CN115591531B - 一种含功能聚合物刷的磷酸化肽吸附剂及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于磷酸化肽富集材料技术领域，具体涉及一种含功能聚合物刷的磷酸化肽吸附剂及其制备与应用。其中磷酸化肽吸附剂具体以烯丙基缩水甘油醚和二甲基丙烯酸二乙二醇酯作为功能单体和交联剂制备得到一种大孔吸附树脂(MAR)微球，然后通过在大孔吸附树脂微球表面接枝一层带有环氧基团的聚合物刷形成聚合基质，最后依次磷酸化处理和钛(Ti4+)离子螯合修饰所述聚合基质，综上制备出可用于富集磷酸化肽的固定化金属离子亲和色谱吸附材料Ti4+‑Brush@MAR。本发明制备的Ti4+‑Brush@MAR微球材料不仅对单磷酸化肽具备优异的富集能力，还对多磷酸化肽表现出了极好的的富集特异性，且本发明的原料易得、成本低廉、步骤简单、反应条件温和，能有效适合于大规模制备。

Description

一种含功能聚合物刷的磷酸化肽吸附剂及其制备与应用
技术领域
本发明属于磷酸化肽富集材料技术领域，具体涉及一种含功能聚合物刷的磷酸化肽吸附剂及其制备与应用。
背景技术
蛋白质的翻译后修饰可以传递生物信号、运动刺激等信息，这些信息是蛋白质功能的重要调节因子。其中，可逆磷酸化是翻译后修饰中最重要的方法之一，它可以调节生命活动中的多种过程，从而控制各种细胞活动，包括细胞增殖、细胞分裂、细胞间信息传递和基因表达等。然而，在我们的日常生活中，蛋白质的异常磷酸化(如磷酸化途径的改变、过度翻译等)与多种疾病的形成有着密切的联系，如癌症和恶性肿瘤等(文献1，R.Gupta,et.al"Post-translational modifications:regulators ofneurodegenerativeproteinopathies"Ageing Res.Rev.2021,68,101336；文献2，X.Li,et.al"Recentadvances in phosphopeptide enrichment:strategies and techniques"TRAC-Trend.Anal.Chem.2016,78,70-83)。因此，诊断和治疗磷酸化异常至关重要。
目前，由于真实生物样品的复杂性以及待测样品中磷酸化肽的低丰度和大量干扰肽的存在，使得对磷酸化肽进行直接质谱分析存在较大的困难(文献3,W.Qiu,et.al"Phosphopeptide enrichment for phosphoproteomic analysis-atutorial and reviewofnovel materials"Anal.Chim.Acta 2020,1129,158-180)。因此，在质谱分析之前，对低丰度的磷酸化肽进行富集成为了必不可少的步骤。
固定化金属离子亲和色谱(IMAC)是一种常用的磷酸化肽富集方法，广泛应用于磷酸化蛋白质组学研究。该方法利用螯合在基质上的金属离子(如Fe(III)、Ti(IV)、Zr(IV)等)与磷酸肽之间发生的静电与螯合协同作用，可以从生物样品中特异性地吸附磷酸化肽段(文献4，韩彬等“固定化金属离子亲和色谱研究进展”科技导报,2017,35,92-100)。但是，据报道，传统的IMAC材料更容易捕获整体磷酸化肽或单磷酸化肽，而对于多磷酸化肽的富集并不理想(文献5,R.Tang,et.al"Facile"one-pot"preparation of phosphonatefunctional polythiophene based microsphere via friedel-crafts reaction forselective enrichment ofphosphopeptides from milk"Anal.Chim.Acta 2022,1190,339268)。实际的，多磷酸肽在细胞行为的调控中承担着更多的功能，如细胞周期和蛋白质相互作用等(文献6，J.Li,et.al"Solvothermal synthesis ofnovel magnetic nickelbased iron oxide nanocomposites for selective capture of global-and mono-phosphopeptides"Anal.Chem.2020,92,1058-1067)。
综上，开发一种在生物或食品等复杂样品中更倾向于富集多磷酸化肽的材料具有重要的意义。
发明内容
本发明涉及一种大孔吸附树脂(MAR)微球基质的磷酸化肽富集材料。具体分别以烯丙基缩水甘油醚和二甲基丙烯酸二乙二醇酯作为功能单体和交联剂制备得到一种大孔吸附树脂微球，然后通过在大孔吸附树脂微球表面接枝一层带有环氧基团的聚合物刷形成聚合基质，最后依次用磷酸化处理和Ti4+离子螯合修饰所述聚合基质，制备出可用于富集磷酸化肽的吸附剂(Ti4+-Brush@MAR)。
所述磷酸化肽吸附剂的结构式为：
其中，左侧的圆球代表大孔吸附树脂微球。
具体制备过程包括如下步骤：
S1.制备单分散的大孔吸附树脂微球
以5～15mL/0.1～0.5g的比例将烯丙基缩水甘油醚与偶氮二异丁腈依次加入到浓度为2％～5％的聚乙烯吡咯烷酮溶液中，通氮除氧20～50min后在60～80℃的温度及70～100r/min的转速下旋蒸加热反应20～24h；离心洗涤反应后的产物，然后置于浓度为0.2％～0.5％的十二烷基硫酸钠溶液中，4℃环境下静置得到种子溶液；
以偶氮二异丁腈、烯丙基缩水甘油醚、二甲基丙烯酸二乙二醇酯、甲苯与环己醇的混合物为油相，以浓度为2％～5％的聚乙烯醇和0.2％～0.5％的十二烷基硫酸钠按照20～30mL/60～80mL的比例混合做为水相，将油相与水相以20～30mL/80～110mL的比例混合乳化，得到乳液；
室温条件下以150～250r/min的转速磁力搅拌种子溶液20～40min后加入乳液，种子量和乳液量的比例为8～12mL/100～140mL。接着通氮除氧20～50min并继续磁力搅拌20～40h，然后升温至60～80℃并保温反应20～24h，依次索提、洗涤、干燥反应后的产物，得到单分散的大孔吸附树脂微球；
S2.微球表面接枝聚合物刷形成聚合基质
以1～2g/20～40mL的比例将所述大孔吸附树脂微球分散于浓度为0.1～0.3mol/L硫酸溶液中，40～60℃条件下反应10～12h，然后将反应后的产物洗涤至中性并干燥得到酸化的大孔吸附树脂微球；
以1～2g/30～60mL的比例将酸化的大孔吸附树脂微球加入至二氯甲烷溶液中，150～300r/min的速度下冰浴搅拌10～40min，然后边搅拌边依次加入三乙胺、2-溴异丁酰溴和4-二甲基氨基吡啶，维持冰浴反应2～3h后室温反应24h，洗涤并干燥反应后的产物得到大分子引发剂；
以0.5～2g/20～30mg/0.5～1mL/10mL的比例将大分子引发剂、2,2'-联吡啶和甲基丙烯酸缩水甘油酯依次分散于乙醇-水的混合溶剂中，其中乙醇-水的混合溶剂中乙醇/水的体积比为4/1；
通过冷冻、抽真空和充氮的操作去除溶剂和反应体系中的氧气，以10mL/20～40mg的比例向溶剂中添加催化剂溴化亚铜，并且在氮气氛围下40～60℃催化反应20～24h，得到表面接枝有聚合物刷的聚合基质Brush@MAR微球；
S3.所述聚合基质表面的磷酸化处理
以20～40mg/8～10mL的比例将O-磷酸-L-丝氨酸溶于浓度为0.4～0.8mmol/L的碳酸钠溶液中，调整溶液PH值至7～8，然后按1～3g/4～5mL的比例将所述聚合基质分散于碳酸钠溶液中，40～60℃条件下反应2～4h，将反应后的产物洗涤至中性并干燥得到磷酸化改性的聚合基质；
S4.Ti4+离子螯合修饰磷酸化改性的聚合基质，
以1～2g/10～20mL的比例将磷酸化改性的聚合基质置于浓度为100～200mg/mL的硫酸钛水溶液中室温孵育，将孵育后的产物洗涤至中性并干燥得到可用于富集磷酸化肽的吸附剂Ti4+-Brush@MAR。
优选的
步骤S1的所述油相中偶氮二异丁腈、烯丙基缩水甘油醚、二甲基丙烯酸二乙二醇酯、甲苯与环己醇的混合比例为0.3～0.5g/6～8mL/6～8mL/6～8mL/6～8mL。
步骤S1中的干燥过程是60～80℃条件下真空干燥4～10h。
步骤S2的所述二氯甲烷溶液与三乙胺的混合比例为30～60mL/1～2mL，且添加三乙胺后继续搅拌10～20min；所述三乙胺、2-溴异丁酰溴与4-二甲基氨基吡啶的混合比例为1～2mL/0.5～1mL/10～20mg。
步骤S2中的干燥过程是50～80℃条件下真空干燥5～12h。
步骤S3中的干燥过程是30～50℃条件下真空干燥8～12h。
步骤S4中的干燥过程是30～60℃条件下真空干燥10～12h。
本发明制备的Ti4+-Brush@MAR微球材料不仅对单磷酸化肽具备优异的富集能力，还对多磷酸化肽表现出了极好的富集特异性，由此为多磷酸化肽的富集提供了一种良好的策略。另外，对于本发明的制备过程：其原料易得、成本低廉、步骤简单、反应条件温和，能有效适合于大规模制备。
附图说明
图1为本发明的磷酸化肽吸附剂的制备流程图；
图2为本发明的聚合基质的氦离子扫描电镜(HIM)图；
图3为本发明的聚合基质与大孔吸附树脂微球的氮气吸脱等温曲线图(a)，孔径分布图(b)；
图4为本发明中大孔吸附树脂微球、聚合基质、O-磷酸-L-丝氨酸、磷酸化改性的聚合基质的红外表征图；
图5为X-衍射光电子能谱图：(a)磷酸化肽吸附剂与大孔吸附树脂微球的全谱图，(b)磷酸化肽吸附剂中Ti-2p的高分辨能谱图；
图6为本发明的磷酸化肽吸附剂对β-酪蛋白酶解液富集前后的对比图：(a)富集前，(b)富集后；
图7为本发明磷酸化肽吸附剂对不同β-酪蛋白添加量下的酶解液富集的MALDI-TOF-MS质谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
以含功能聚合物刷大孔吸附树脂微球为基质的磷酸化肽吸附剂(Ti4+-Brush@MAR)用于生物样品中的磷酸化肽富集
1、磷酸化肽吸附剂(Ti4+-Brush@MAR)的制备
S1.制备单分散的大孔吸附树脂(MAR)微球
首先将10mL的烯丙基缩水甘油醚单体加入到2％的聚乙烯吡咯烷酮溶液中(2g聚乙烯吡咯烷酮溶解于87.8mL乙醇溶液中)，之后添加0.2g偶氮二异丁腈，通氮除氧30min后在70℃的温度及80r/min的转速下旋蒸加热反应24h；反应结束后，利用无水乙醇离心洗涤反应后的产物，然后置于浓度为0.2％的十二烷基硫酸钠溶液中，4℃环境下静置得到种子溶液；
取0.36g偶氮二异丁腈置于烧杯中，然后加入6mL烯丙基缩水甘油醚、6mL二甲基丙烯酸二乙二醇酯、6mL甲苯与6mL环己醇混合组成油相；
以浓度为5％的聚乙烯醇和浓度为0.2％的十二烷基硫酸钠的混合液为水相；
将油相与水相混合并置于细胞破碎仪中充分乳化，得到乳液；
取8.2mL的种子溶液置于烧瓶中，室温条件下以200r/min的转速磁力搅拌30min后加入乳液，接着通氮除氧30min并继续磁力搅拌24h(以此使油相被充分吸收到种子内部)，然后升温至70℃并保温反应24h，反应后其聚合反应产物经48h索提、无水乙醇和丙酮依次洗涤、60℃真空干燥12h得到单分散的大孔吸附树脂微球；
S2.微球表面接枝聚合物刷形成聚合基质
将2g大孔吸附树脂微球分散于36mL浓度为0.1mol/L硫酸溶液中，60℃条件下反应12h，然后将反应后的产物洗涤至中性并在60℃下真空干燥12h，得到酸化的MAR；
将1g酸化的MAR加入至32mL的二氯甲烷溶液中，200r/min的速度下冰浴搅拌30min，然后加入1mL三乙胺并继续搅拌10min，接着在依次加入0.8mL的2-溴异丁酰溴和15.2mg的4-二甲基氨基吡啶，维持冰浴反应2h后转移至室温条件下反应24h，将反应后的产物依次用二氯甲烷和水各洗涤3次，之后在60℃下真空干燥12h，得到大分子引发剂；
原子转移自由基聚合(ATRP)反应：将1g大分子引发剂、25.8mg的2,2'-联吡啶和1mL甲基丙烯酸缩水甘油酯依次分散于10mL乙醇-水的混合溶剂中，其中乙醇-水的混合溶剂中乙醇/水的体积比为4/1；
循环执行3次冷冻、抽真空和充氮的操作以去除溶剂和反应体系中的氧气，然后添加26mg的溴化亚铜催化剂；
再循环执行3次冷冻、抽真空和充氮的操作并且在氮气氛围下60℃催化反应24h，得到表面接枝有聚合物刷的聚合基质(Brush@MAR微球)；
S3.所述聚合基质表面的磷酸化处理
将30mg的O-磷酸-L-丝氨酸溶于9mL浓度为0.6mmol/L的碳酸钠溶液中，然后调整溶液PH值至8；接着将1g所述聚合基质分散于碳酸钠溶液中，并在60℃条件下反应3h，以此在聚合基质表面进入磷酸根，最后将反应后的产物用去离子水洗涤至中性、并且在50℃下真空干燥12h，得到磷酸化改性的聚合基质；
S4.Ti4+离子螯合修饰磷酸化改性的聚合基质
取1g磷酸化改性的聚合基质分散于20mL浓度为100mg/mL的硫酸钛水溶液中，室温孵育4h，将孵育后的产物用去离子水洗涤至中性、并且在50℃下真空干燥12h，得到可用于富集磷酸化肽的吸附剂，其为Ti4+-Brush@MAR微球材料，且微球的粒径为5～7μm，平均粒径为6μm。
2、材料表征
图2：以HIM扫描电镜对聚合基质Brush@MAR微球材料进行HIM微观表征，如图2所示，从Brush@MAR微球的HIM微观形态可以看出，Brush@MAR微球具有均匀单分散的球形形态，粒径约为6.0μm，且粗糙表面和大孔的存在有利于后续的改性。
图3：通过比表面积测定仪测试磷酸化肽吸附剂(Ti4+-Brush@MAR微球材料)与MAR的N2吸脱附曲线，计算比表面积及孔径分布，具体由图3可知，MAR的比表面积值为10.8m2/g，在经过ATRP修饰之后的Brush@MAR微球的比表面积小于5.0m2/g，其原因是在MAR表面接枝了一层绵柔状的致密聚合物刷。
图4：以傅里叶变换衰减全反射红外光谱法(ATR-FTIR)对MAR、聚合基质(Brush@MAR微球)、O-磷酸-L-丝氨酸及磷酸化改性的聚合基质进行表征，如图4所示：
MAR光谱中907cm-1和1738cm-1的两个峰分别来自甲基丙烯酸缩水甘油酯中的环氧基团和C＝O的拉伸振动，这两个峰同样出现在了Brush@MAR的光谱中，并且907cm-1处的环氧峰略微增强，此外，Brush@MAR的光谱中还在3500cm-1处出现了强宽峰(由水解环氧基团产生的O-H拉伸振动生成)，基于此表明聚合物刷被成功地接枝到MAR表面；
在O-磷酸-L-丝氨酸的光谱中，3175cm-1和3104cm-1的两个弱峰对应的是N-H的伸缩振动，1560cm-1的峰对应为N-H的弯曲振动，而这些峰在磷酸化改性的聚合基质的光谱中没有出现。对于O-磷酸-L-丝氨酸与磷酸化改性的聚合基质两个谱图，968cm-1处的出峰对应于P-O的伸缩振动，1257cm-1处的出峰对应于P＝O的伸缩振动，基于此表明O-磷酸-L-丝氨酸通过环氧胺开环反应被成功接枝在了Brush@MAR的表面，完成磷酸化改性。
图5：图5a为磷酸化肽吸附剂(Ti4+-Brush@MAR微球材料)与聚合基质(Brush@MAR微球)的XPS全谱图，其中Brush@MAR谱图中只有O-1s和C-1s的峰(来自于烯丙基缩水甘油醚或者二甲基丙烯酸二乙二醇酯)，除O-1s和C-1s之外，在Ti4+-Brush@MAR谱图中还出现了N-1s、P-2p和Ti-2p的峰，由此表明Ti4+被成功的固定到了Brush@MAR的表面。图5b为磷酸化肽吸附剂(Ti4+-Brush@MAR微球材料)中Ti-2p的高分辨能谱图，图中464.5eV和458.7eV的两个峰分别对应的是钛原子的2p-1/2和2p-3/2轨道，基于此进一步表明了Ti4+被成功的固定到了Brush@MAR的表面。
3、磷酸化肽的富集
取5mg的Ti4+-Brush@MAR微球材料于离心管中，先用上样液(乙腈/水/三氟乙酸＝80/6/14，体积比)酸化平衡，然后置于200μL含有胰蛋白酶的上样液中室温孵育30min；
室温振荡离心，除去上清液；
依次用洗涤液A(乙腈/200mmol/L氯化钠水溶液/三氟乙酸＝50/44/6，体积比)和洗涤液B(乙腈/水/三氟乙酸＝30/69.9/0.1，体积比)对材料进行清洗，以除去吸附在材料上的非磷酸肽段(每次清洗后均需离心分离除去清洗后溶液)；
最后用洗脱液(质量百分比为10％的氨水)将富集到材料上的磷酸肽洗脱下来，得到的洗脱液用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行分析。
实施例2
磷酸化肽吸附剂(Ti4+-Brush@MAR)的制备
S1.制备单分散的大孔吸附树脂微球
首先将5mL的烯丙基缩水甘油醚单体加入到2％的聚乙烯吡咯烷酮溶液中(2g聚乙烯吡咯烷酮溶解于87.8mL乙醇溶液中)，之后添加0.1g偶氮二异丁腈，通氮除氧30min后在70℃的温度及80r/min的转速下旋蒸加热反应24h；反应结束后，利用无水乙醇离心洗涤反应后的产物，然后置于浓度为0.2％的十二烷基硫酸钠溶液中，4℃环境下静置得到种子溶液；
取0.5g偶氮二异丁腈置于烧杯中，然后加入8mL烯丙基缩水甘油醚、8mL二甲基丙烯酸二乙二醇酯、8mL甲苯与8mL环己醇混合组成油相；
以浓度为3％的聚乙烯醇和浓度为3％的十二烷基硫酸钠的混合液为水相；
将油相与水相混合并置于细胞破碎仪中充分乳化，得到乳液；
取4.1mL的种子溶液置于烧瓶中，室温条件下以200r/min的转速磁力搅拌30min后加入乳液，接着通氮除氧30min并继续磁力搅拌24h(以此使油相被充分吸收到种子内部)，然后升温至70℃并保温反应24h，反应后其聚合反应产物经48h索提、无水乙醇和丙酮依次洗涤、60℃真空干燥12h得到单分散的大孔吸附树脂微球；
S2.微球表面接枝聚合物刷形成聚合基质
将1g大孔吸附树脂微球分散于22mL浓度为0.2mol/L硫酸溶液中，60℃条件下反应12h，然后将反应后的产物洗涤至中性并在60℃下真空干燥12h，得到酸化的MAR；
将2g酸化的MAR加入至58mL的二氯甲烷溶液中，200r/min的速度下冰浴搅拌30min，然后加入2mL三乙胺并继续搅拌10min，接着在依次加入1mL的2-溴异丁酰溴和19.8mg的4-二甲基氨基吡啶，维持冰浴反应2h后转移至室温条件下反应24h，将反应后的产物依次用二氯甲烷和水各洗涤3次，之后在60℃下真空干燥12h，得到大分子引发剂；
ATRP反应：将0.5g大分子引发剂、20mg的2,2'-联吡啶和0.5mL甲基丙烯酸缩水甘油酯依次分散于10mL乙醇-水的混合溶剂中，其中乙醇-水的混合溶剂中乙醇/水的体积比为4/1；
循环执行3次冷冻、抽真空和充氮的操作以去除溶剂和反应体系中的氧气，然后添加35mg的溴化亚铜催化剂；
再循环执行3次冷冻、抽真空和充氮的操作并且在氮气氛围下60℃催化反应24h，得到表面接枝有聚合物刷的聚合基质(Brush@MAR微球)；
S3.所述聚合基质表面的磷酸化处理
将20mg的O-磷酸-L-丝氨酸溶于8mL浓度为0.7mmol/L的碳酸钠溶液中，然后调整溶液PH值至7；接着将2g所述聚合基质分散于碳酸钠溶液中，并在60℃条件下反应3h，以此在聚合基质表面进入磷酸根，最后将反应后的产物用去离子水洗涤至中性、并且在50℃下真空干燥12h，得到磷酸化改性的聚合基质；
S4.Ti4+离子螯合修饰磷酸化改性的聚合基质
取2g磷酸化改性的聚合基质分散于10mL浓度为200mg/mL的硫酸钛水溶液中，室温孵育4h，将孵育后的产物用去离子水洗涤至中性、并且在50℃下真空干燥12h，得到可用于富集磷酸化肽的吸附剂，其为Ti4+-Brush@MAR微球材料。
以本实施例的Ti4+-Brush@MAR微球材料进行磷酸化肽富集，其操作与实施例1相同。
材料应用
以10μg的β-酪蛋白酶解液为样品，用实施例1所制备的磷酸化肽吸附剂(Ti4+-Brush@MAR微球材料)进行富集，结果如图6所示：在富集前(图6a)谱图信号大多属于非磷酸化肽的信号峰(质荷比为1383m/z的非磷酸化肽达到了最高峰强度26900，而质荷比为2556m/z的磷酸化肽的信号峰强度仅有640)。用实施例1所制备的Ti4+-Brush@MAR微球富集后(图6b)谱图信号显示出质荷比为2061m/z、2556m/z、3122m/z的三种磷酸肽特征峰，其中多磷酸化肽(3122m/z)的占比最高，且非磷酸化肽的信号强度几乎为零，由此说明Ti4+-Brush@MAR微球材料对磷酸化肽具备良好的富集性能。
以5μg-30μg不等量的β-酪蛋白酶解液为样品，用实施例1所制备的磷酸化肽吸附剂(Ti4+-Brush@MAR微球材料)进行富集，图7a-e依次对应的是β-酪蛋白酶解液上样量为5，6，8，20和30μg时的质谱图。在富集到的三个磷酸化肽的特征信号峰中，2061m/z和2556m/z的两个信号峰属于单磷酸化肽的出峰位置，3122m/z的信号峰属于多磷酸化肽的出峰位置，值得注意的是，随着β-酪蛋白酶解液含量的逐渐增加(5μg-30μg)，富集到的单磷酸化肽的两个信号峰(2061m/z和2556m/z)逐渐降低，直至不能被检测(图7a-e所示)。相反的，多磷酸化肽及其去磷酸化片段的信号强度(3122m/z)随着β-酪蛋白酶解液上样量的增加而得到了显著的提升，并且逐渐在谱图中占据到了主导地位。由此本发明为多磷酸化肽富集提供了一种良好的策略，可有望应用于复杂生物样品中多磷酸化肽的高效富集。
另外由于本发明整个制备过程简单、反应条件温和、原材料易得价廉，因此适合于大规模制备。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的范围。

Claims (7)

1.一种含功能聚合物刷的磷酸化肽吸附剂，其特征在于：
以烯丙基缩水甘油醚和二甲基丙烯酸二乙二醇酯为原料制备单分散的大孔吸附树脂（MAR）微球；
在所述大孔吸附树脂微球表面接枝一层带有环氧基团的聚合物刷，形成聚合基质；
依次用磷酸化处理和Ti4+离子螯合修饰所述聚合基质，制备得到可用于富集磷酸化肽的固定化金属离子亲和色谱（IMAC）吸附材料。
2.根据权利要求1所述的含功能聚合物刷的磷酸化肽吸附剂，其特征在于，所述的磷酸化肽吸附剂的结构式为：其中，左侧的圆球代表大孔吸附树脂微球。
3.根据权利要求1所述的含功能聚合物刷的磷酸化肽吸附剂，其特征在于，分别以烯丙基缩水甘油醚和二甲基丙烯酸二乙二醇酯作为功能单体和交联剂，采用种子溶胀法制备得到5～7µm单分散的大孔吸附树脂微球；
将含有环氧基团的甲基丙烯酸缩水甘油酯功能单体利用原子转移自由基聚合（ATRP）技术接枝到所述大孔吸附树脂微球表面，得到材料表面形成一层致密聚合物刷的聚合基质Brush@MAR微球；
通过环氧胺开环反应将O-磷酸-L-丝氨酸修饰剂中的磷酸官能团引入所述聚合基质表面，得到改性的Brush@MAR微球；
以硫酸钛为螯合剂，通过金属螯合作用将Ti4+离子固定到磷酸化改性的Brush@MAR微球表面，得到可以用于富集磷酸化肽的吸附剂Ti4+-Brush@MAR。
4.一种含功能聚合物刷的磷酸化肽吸附剂的制备方法，其特征在于，包括：
S1.制备单分散的大孔吸附树脂微球
以0.3～0.5g/6～8mL/6～8mL/6～8mL/6～8mL的偶氮二异丁腈、烯丙基缩水甘油醚、二甲基丙烯酸二乙二醇酯、甲苯与环己醇的混合物为油相，以浓度为2%～5%的聚乙烯醇和0.2%～0.5%的十二烷基硫酸钠按照20～30mL/60～80mL的比例混合作为水相，将油相，水相与种子量以20～30mL/80～110mL/8～12mL的比例混合，之后通氮除氧20～50min，并在常温下150～250r/min磁力搅拌20～40h，然后升温至60～80℃并保温反应20～24h，依次索提、洗涤、干燥后，得到单分散的大孔吸附树脂微球；
S2.微球表面接枝聚合物刷形成聚合基质
将1～2g大孔吸附树脂酸化开环，之后以1～2g/30～60mL的比例将酸化的大孔吸附树脂微球加入至二氯甲烷溶液中，150～300r/min的速度下冰浴搅拌10～40min，然后边搅拌边依次加入1～2mL/0.5～1mL/10～20mg的三乙胺、2-溴异丁酰溴和4-二甲基氨基吡啶，维持冰浴反应2～3h后室温反应24h，洗涤并干燥反应后的产物得到大分子引发剂；
以0.5～2g/20～30mg/0.5～1mL/10mL的比例将大分子引发剂、2,2'-联吡啶和甲基丙烯酸缩水甘油酯依次分散于乙醇-水的混合溶剂中，其中乙醇-水的混合溶剂中乙醇/水的体积比为4/1；通过冻融操作除去体系中的氧气，并以10mL/20～40mg的比例向溶剂中添加溴化亚铜催化剂，并且在氮气氛围下40～60℃催化反应20～24h，得到表面接枝有聚合物刷的聚合基质Brush@MAR微球；
S3.所述聚合基质表面的磷酸化处理以20～40mg/8～10mL的比例将O-磷酸-L-丝氨酸溶于浓度为0.4～0.8mmol/L的碳酸钠溶液中，调整溶液PH值至7～8，然后按1～3g/4～5mL的比例将所述聚合基质分散于碳酸钠溶液中，40～60℃条件下反应2～4h，将反应后的产物洗涤至中性并干燥得到磷酸化改性的聚合基质；
S4.Ti4+离子螯合修饰磷酸化改性的聚合基质以1～2g/10～20mL的比例将磷酸化改性的聚合基质置于浓度为100～200mg/mL的硫酸钛水溶液中室温孵育，将孵育后的产物洗涤至中性并干燥得到可用于富集磷酸化肽的吸附材料Ti4+-Brush@MAR。
5.一种由权利要求4所述的含功能聚合物刷的磷酸化肽吸附剂的制备方法制备得到的磷酸化肽吸附剂，其为Ti4+-Brush@MAR微球材料。
6.一种根据权利要求5所述的磷酸化肽吸附剂的应用，其特征在于：
所述磷酸化肽吸附剂可用于生物样品中的磷酸化肽段的富集。
7.一种根据权利要求6所述的磷酸化肽吸附剂的应用，其特征在于：
所述生物样品为酪蛋白酶解液、牛奶酶解液中的一种或两种。
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