CN116459797A - 一种复合磁性固相萃取材料及其制备方法和在类固醇激素提取中的应用 - Google Patents

一种复合磁性固相萃取材料及其制备方法和在类固醇激素提取中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，公开了一种复合磁性固相萃取材料及其制备方法和在类固醇激素提取中的应用。该复合磁性固相萃取材料的制备方法包括如下步骤：将氯化铁与氯化亚铁通过氨水进行还原制备得到四氧化三铁磁珠，并使用油酸进行混合包裹提高其油溶性，进而进一步进行二氧化硅包裹保护，并在其表面改性使其表面增加碳碳双键活性反应位点，以实现N‑乙烯基吡咯烷酮和二乙烯基苯的聚合接枝，最终得到具有两亲性HLB层的所述复合磁性固相萃取材料。本发明中的复合磁固相萃取材料可用于提取富集血液样品中的类固醇激素如含羧基、羟基的甾体激素等，萃取操作步骤简单，萃取相与样品易于分离，同时还有效避免了有机溶剂的消耗，应用前景好。

Description

一种复合磁性固相萃取材料及其制备方法和在类固醇激素提 取中的应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，特别涉及一种复合磁性固相萃取材料及其制备方法和在类固醇激素提取中的应用。
背景技术
类固醇激素又称甾体激素，是一类以环戊烷多氢菲结构为核心的脂溶性低分子化合物，它在调节新陈代谢、治疗相关炎症、维持水盐平衡、促进性征发育等方面都起着关键的作用。正因如此，其被广泛的应用于免疫调节、生育调控等领域，而这也导致了其容易流入环境，并随着食物链富集，对相关生物产生影响。测量生物样本中的类固醇激素是毒理学中内分泌相关研究的关键因素，因此，实现对样品中类固醇激素的提取富集至关重要。
类固醇激素在生物样品中通常以结合形式存在，因此，早期许多预处理方法采用样品水解法。近年来，酶水解法逐渐取代酸水解法，成为了样品水解法的主流，但其仍存在操作时间长，实验费用高等缺点。且生物样品通常较为复杂，采用水解法进行前处理，往往会引入其他未知的副产物，使得样品预处理过程复杂化。因此，为了实现快速高效提取生物样品中的类固醇激素，解决样品提取法所存在的问题，亟需一种更具优势的预处理方法。
选择磁性材料作为吸附剂以实现固相萃取提取血液中类固醇激素方法，具有样品体积需求量低，操作时间短，实验成本低廉等优点。因此在磁性材料的基础上加以改性，制备具有针对性的提取、富集类固醇激素的磁固相萃取材料，具有广泛的应用前景和实际意义。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种复合磁性固相萃取材料的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种上述制备方法制备得到的复合磁性固相萃取材料。
本发明的另一目的在于提供一种上述复合磁性固相萃取材料在类固醇激素提取中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种复合磁性固相萃取材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)将TritonX-100溶解在环己烷中超声10～30min，得到A混合物；将油酸包裹的磁性纳米粒子(OMNPs)超声悬浮在环己烷中，得到B混合物；将A混合物和B混合物混合并振摇，滴加入氨水和四乙氧基硅烷(TEOS)，然后在室温下搅拌反应，所得纳米复合材料通过磁性倾析用乙醇和水彻底洗涤以去除表面活性剂和溶剂，得到二氧化硅包裹的磁性纳米粒子(SMNPs)；
(2)将二氧化硅包裹的磁性纳米粒子(SMNPs)分散在乙醇水溶液中，在氮气环境下滴加氨水，然后在搅拌下添加甲基丙烯酸3-三甲氧基甲硅烷基丙酯(MPS)的乙醇溶液，在室温下搅拌反应，所得产物用磁铁收集，然后用水和乙醇洗涤数次，最后超声分散溶解在乙腈中，得到MSMNPs纳米粒子溶液；
(3)将偶氮二异丁腈加入到上述MSMNPs纳米粒子溶液中充分搅拌溶解，随后在氮气环境下加入二乙烯基苯(DVB)与N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)并搅拌，加热至80℃反应12～48小时，所得产物经过磁分离，用丙酮和乙醇漂洗数次，在60℃下真空干燥12h，得到复合磁性固相萃取材料(AMNPs)；所述复合磁性固相萃取材料(AMNPs)贮存于纯水中得到复合磁性固相萃取材料悬浊液。
步骤(1)所述油酸包裹的磁性纳米粒子(OMNPs)按照以下方法制备得到：将摩尔比为1:1的六水合氯化铁和四水合氯化亚铁搅拌溶解于超纯水中，滴加溶有油酸的丙酮溶液；滴加完毕后以300～450rpm的转速搅拌混匀10～30min，接着向混合液中逐滴加入质量百分浓度为25％的氨水，加热至50～100℃进行反应1～5h，反应结束后冷却至室温，收集黑色磁性粒子，分别用乙醇和超纯水洗涤，然后真空干燥，得到油酸包裹的磁性纳米粒子(OMNPs)。
步骤(1)中所述A混合物与B混合物的体积比为10：1；所述TritonX-100和油酸包裹的磁性纳米粒子的质量比为1.26：1；所述氨水与四乙氧基硅烷的体积比为1：1；所述氨水的用量按照每1g油酸包裹的磁性纳米粒子使用250μL氨水；所述搅拌反应的时间为24～48h；所述氨水的浓度为质量分数25％；所述的搅拌速度为300～600rpm。
步骤(2)中所述乙醇水溶液的组成为体积比3：1的乙醇和水混合液；所述甲基丙烯酸3-三甲氧基甲硅烷基丙酯(MPS)的乙醇溶液是由体积比4：5的甲基丙烯酸3-三甲氧基甲硅烷基丙酯(MPS)和乙醇组成；所述甲基丙烯酸3-三甲氧基甲硅烷基丙酯与氨水的体积比为2：1；所述甲基丙烯酸3-三甲氧基甲硅烷基丙酯(MPS)与二氧化硅包裹的磁性纳米粒子(SMNPs)的用量关系为：4mL甲基丙烯酸3-三甲氧基甲硅烷基丙酯对应1mg二氧化硅包裹的磁性纳米粒子(SMNPs)；所述氨水的浓度为质量分数25％；所述MSMNPs纳米粒子溶液的浓度为每100mL乙腈中含有1g MSMNPs纳米粒子；所述搅拌均为采用300～600rpm的搅拌速度。
步骤(3)所述二乙烯基苯与N-乙烯基吡咯烷酮的质量比为1:1～1:2，优选为0.78：1；所述的偶氮二异丁腈与二乙烯基苯的质量比为1：15.6；所述偶氮二异丁腈的用量按照每200mL MSMNPs纳米粒子溶液使用0.1g偶氮二异丁腈；所述的搅拌速度为300～600rpm。
一种由上述的制备方法制备得到的复合磁性固相萃取材料。
上述的复合磁性固相萃取材料在类固醇激素的富集、浓缩和/或检测中的应用，所述类固醇激素为化学结构中含有羟基、羧基的类固醇激素。
所述类固醇激素优选为美雄醇、可的松和勃地酮中的至少一种。
一种利用上述的复合磁性固相萃取材料富集、浓缩和检测类固醇激素的方法，包括如下步骤：
(A)样品预处理：向待测离体血液加入预处理制剂，预处理制剂和待测离体血液的体积比为1～4：1，在0～20℃低温条件下以5000～10000rpm转速高速离心分离，将上清液分离收集，得到预处理全血；
(B)萃取：取预处理全血加入复合磁性固相萃取材料悬浊液中，以1000～2500rpm震荡混匀3～20min以富集浓缩目标物，再利用磁吸附将复合磁性固相萃取材料取出，用纯水润洗数次，晾干；
(C)洗脱：用甲醇对步骤(B)晾干后的复合磁性固相萃取材料进行洗脱、过滤，得到含有类固醇激素的洗脱液。
步骤(A)中所述的预处理制剂为等同体积的无水甲醇与0.1mol/L的硫酸锌溶液混合而成的甲醇-硫酸锌溶液；所述预处理制剂和待测离体血液的体积比为2：1；所述的低温条件为5℃；所述的离心分离的转速为9000rpm；
步骤(B)中所述的预处理全血和复合磁性固相萃取材料悬浊液的用量为10mL复合磁性固相萃取材料悬浊液添加200μL预处理全血；所述震荡的转速为1500rpm；所述震荡的时间为10min；
步骤(C)中所述的甲醇和复合磁性固相萃取材料的用量为每1mL甲醇洗脱100mg复合磁性固相萃取材料；所述洗脱的次数为两次。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：
1、本发明制备了一种复合磁性固相萃取材料，该方法制备得到的磁固相萃取材料由二氧化硅包覆的磁核(Fe3O4)和复合HLB吸附层(N-乙烯基吡咯烷酮与二乙烯基苯聚合物)两部分构成；该材料在保证满足磁吸附分离使用要求的前提下，适当牺牲材料的磁饱和强度，构架多层复合结构，进一步提升了材料的稳定性。
本发明在制备过程中，通过二氧化硅包裹与MPS接枝改性，增加磁核表面碳碳双键反应位点，巩固了HLB聚合物层与磁核的连接，良好的实现了无机与有机材料的结合，避免提取过程中洗涤造成的吸附层脱落，同时二氧化硅的包裹也减缓了磁核的氧化，进一步提高材料稳定性；本发明材料多层的复合结构，赋予了材料更大的比表面积，增加了材料的表面吸附位点，进而实现应用于复杂生物基质，低样品量、低浓度类固醇激素的富集萃取。
2、本发明复合磁性固相萃取材料制备流程简单，对类固醇激素具有优异的富集提取效果。本发明所提出的萃取操作简便，所需材料简单易得，前处理流程便捷，能实现小体积生物样品的快速提取富集；前处理方案不引入额外的干扰物，避免了传统生物样品提取方法的弊端。且该材料体现了较好的稳定性，在多次重复使用下依然具有较高的回收率，具有良好的经济效益，绿色环保。
附图说明
图1是实施例1制备得到的磁性纳米粒子和复合磁性固相萃取材料的傅里叶变换红外光谱图；
图2是实施例1制备得到的磁性纳米粒子和复合磁性固相萃取材料的磁滞回曲线图。
图3是实施例1制备得到的复合磁性固相萃取材料的SEM图。
图4是实施例2中的3种类固醇激素(美雄醇，可的松和勃地酮)的色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
实施例1制备复合磁性固相萃取材料：
(1)制备磁性纳米粒子OMNPs
分别称取5.40g六水合氯化铁、1.99g四水合氯化亚铁，搅拌溶解于150mL超纯水中，得到A溶液；称取2.00g油酸，充分溶解于15mL丙酮中，缓慢滴加于A溶液中，搅拌混匀30min后，在混合液中逐滴加入15mL氨水(质量浓度为25％)，在20～30℃下搅拌混匀1h，加热至80℃，反应3h，得到磁性纳米粒子；待冷却至室温，收集黑色磁性粒子，分别用乙醇和超纯水洗涤4次，然后将产物在45℃下真空干燥12h，得到油酸包裹的磁性纳米粒子OMNP；
(2)制备二氧化硅包裹的磁性纳米粒子SMNPs
将3.52g Triton-X100溶解在40mL环己烷中超声10～30min，得到A混合溶液；将2gOMNPs超声悬浮在4mL环己烷中，得到B混合溶液；然后，将A混合溶液和B混合溶液混合后转移到250mL锥形烧瓶中并振摇30min，然后滴加入500μL氨水(质量浓度为25％)和500μLTEOS，将所得混合物在室温(25℃)下以500rpm搅拌反应48h；所得纳米复合材料通过磁性倾析用乙醇和水彻底洗涤以去除表面活性剂和溶剂(主要是指Triton-X100和环己烷)，得到二氧化硅包裹的磁性纳米粒子SMNPs。
(3)制备复合磁固相萃取材料AMNPs
将2g SMNPs分散在200mL乙醇的水溶液中；在氮气环境下缓慢滴加4mL氨水(质量浓度为25％)，然后在搅拌下添加10mL(含8mL MPS)MPS的乙醇溶液；在室温(25℃)下搅拌反应12h；将所得产物用磁铁收集，用水和乙醇洗涤数次，最后溶解在200mL乙腈中，并将溶液超声使其分散均匀，得到MSMNPs纳米粒子溶液。将0.1g偶氮二异丁腈加入到上述MSMNPs纳米粒子溶液中充分搅拌溶解，随后在氮气环境下加入1.56g二乙烯基苯与2.00g乙烯基吡咯烷酮并搅拌溶解，加热至80℃反应24小时，所得产物经过磁分离，用丙酮和乙醇漂洗数次，并在60℃下真空干燥12h；得到复合磁性固相萃取材料AMNPs，并将其贮存于纯水中得到浓度为100mg/10mL的AMNPs悬浊液。
对本实施例所得复合磁性固相萃取材料AMNPs进行以下性能检测：
通过傅里叶变换红外图(FT-IR)可以证明：N-乙烯基吡咯烷酮和二乙烯基苯在磁珠表面成功聚合(图1)。
通过振动样品磁强计(VSM)可以证明，材料磁滞回线呈S型曲线，通过磁化零点。所有的VSM曲线几乎没有磁滞、剩磁和矫顽力。具有典型的超顺磁性(图2)。
通过观察SEM图可知所制备得到的复合磁固相萃取材料粒径约为50nm，表面结构粗糙，具有较大的比表面积(121.3618m2/g)，活性位点较为丰富(图3)。
实施例2
利用本发明复合磁性固相萃取材料提取血液中类固醇激素并联用HPLC-MS/MS进行定量分析的方法，包括以下步骤：
(1)标准品的配制，用甲醇(色谱纯)为溶剂，分别配制美雄醇、可的松和勃地酮的浓度为40mg/L的储备液并置于4℃保存；然后再以甲醇为溶剂，配制三种类固醇激素的混合标准溶液，浓度依次为10μg/L、20μg/L、40μg/L、100μg/L、200μg/L、400μg/L、1000μg/L，用HPLC-MS/MS进行检测分析，根据其响应强度和浓度绘制标准工作曲线，工作曲线绘制于表5中。
(2)固相萃取
①样品预处理：取2mL兔全血，加入步骤(1)所得浓度为1000μg/L的类固醇激素混合标准溶液配制成浓度为100μg/L的加标兔全血；加入4mL配制好的预处理制剂(所述的预处理制剂为等同体积的无水甲醇与0.1mol/L的硫酸锌溶液混合而成的甲醇-硫酸锌溶液)，在5℃9000rpm下离心，将上清液分离收集，得到预处理加标兔全血。
②萃取：将200μL预处理加标兔全血添加到10mL实施例1所得AMNPs悬浊液中，恒温下振荡混匀10min(转速1500rpm)；接着通过磁吸附将复合磁性固相萃取材料从样品溶液中取出，用水洗涤数次并烘干；
③洗脱：用1mL甲醇溶液对烘干后的复合磁固相萃取材料洗脱两次，每次在1500rpm转速下震荡洗脱5min，得到的洗脱液用0.22μm过滤器过滤除去样品中的细小颗粒，利用液质串联质谱(HPLC-MS/MS)进行检测。其中，HPLC-MS/MS检测条件如下：
液相：SHIMADZU 20ADXR液相色谱仪，色谱柱为C18柱(2.1×100mm，1.9μm)，流动相A相为0.1％甲酸水溶液，B相为乙腈，流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样量为10μL；
质谱：SHIMADZU LCMS-8045三重四极杆液质联用仪，离子源为电喷雾离子源(ESI)；检测方式和扫描方式分别设置为多反应检测(MRM)和正离子模式；其中雾化气流量、加热气流量和干燥气流量分别为3L/min、10L/min和10L/min；接口温度、脱溶剂温度、DL温度、加热块温度依次为300℃、526℃、250℃和400℃。
其他参数见表1，梯度洗脱程序见表2，目标分析物的结构见表3，目标物的色谱图见图4(从左至右分别为美雄醇，可的松和勃地酮)。
(3)结果：目标分析物的检出限、线性范围及回收率见表4(回收率＝(解吸后浓度×2)/(样品浓度×0.2)×100％)。
表1目标分析物定性、定量离子和质谱分析参数
表2梯度洗脱程序表
表3目标分析物
表4目标物在兔全血中回收率
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种复合磁性固相萃取材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将TritonX-100溶解在环己烷中超声10～30min，得到A混合物；将油酸包裹的磁性纳米粒子超声悬浮在环己烷中，得到B混合物；将A混合物和B混合物混合并振摇，滴加入氨水和四乙氧基硅烷，然后在室温下搅拌反应，所得纳米复合材料通过磁性倾析用乙醇和水彻底洗涤以去除表面活性剂和溶剂，得到二氧化硅包裹的磁性纳米粒子；
(2)将二氧化硅包裹的磁性纳米粒子分散在乙醇水溶液中，在氮气环境下滴加氨水，然后在搅拌下添加甲基丙烯酸3-三甲氧基甲硅烷基丙酯的乙醇溶液，在室温下搅拌反应，所得产物用磁铁收集，然后用水和乙醇洗涤数次，最后超声分散溶解在乙腈中，得到MSMNPs纳米粒子溶液；
(3)将偶氮二异丁腈加入到上述MSMNPs纳米粒子溶液中充分搅拌溶解，随后在氮气环境下加入二乙烯基苯与N-乙烯基吡咯烷酮并搅拌，加热至80℃反应12～48小时，所得产物经过磁分离，用丙酮和乙醇漂洗数次，在60℃下真空干燥12h，得到复合磁性固相萃取材料；所述复合磁性固相萃取材料贮存于纯水中得到复合磁性固相萃取材料悬浊液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(1)所述油酸包裹的磁性纳米粒子按照以下方法制备得到：将摩尔比为1:1的六水合氯化铁和四水合氯化亚铁搅拌溶解于超纯水中，滴加溶有油酸的丙酮溶液；滴加完毕后以300～450rpm的转速搅拌混匀10～30min，接着向混合液中逐滴加入质量百分浓度为25％的氨水，加热至50～100℃进行反应1～5h，反应结束后冷却至室温，收集黑色磁性粒子，分别用乙醇和超纯水洗涤，然后真空干燥，得到油酸包裹的磁性纳米粒子。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述A混合物与B混合物的体积比为10：1；所述TritonX-100和油酸包裹的磁性纳米粒子的质量比为1.26：1；所述氨水与四乙氧基硅烷的体积比为1：1；所述氨水的用量按照每1g油酸包裹的磁性纳米粒子使用250μL氨水；所述搅拌反应的时间为24～48h；所述氨水的浓度为质量分数25％；所述的搅拌速度为300～600rpm。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述乙醇水溶液的组成为体积比3：1的乙醇和水混合液；所述甲基丙烯酸3-三甲氧基甲硅烷基丙酯的乙醇溶液是由体积比4：5的甲基丙烯酸3-三甲氧基甲硅烷基丙酯和乙醇组成；所述甲基丙烯酸3-三甲氧基甲硅烷基丙酯与氨水的体积比为2：1；所述甲基丙烯酸3-三甲氧基甲硅烷基丙酯与二氧化硅包裹的磁性纳米粒子的用量关系为：4mL甲基丙烯酸3-三甲氧基甲硅烷基丙酯对应1mg二氧化硅包裹的磁性纳米粒子；所述氨水的浓度为质量分数25％；所述MSMNPs纳米粒子溶液的浓度为每100mL乙腈中含有1g MSMNPs纳米粒子；所述搅拌均为采用300～600rpm的搅拌速度。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(3)所述二乙烯基苯与N-乙烯基吡咯烷酮的质量比为1:1～1:2；所述的偶氮二异丁腈与二乙烯基苯的质量比为1：15.6；所述偶氮二异丁腈的用量按照每200mL MSMNPs纳米粒子溶液使用0.1g偶氮二异丁腈；所述的搅拌速度为300～600rpm。
6.一种由权利要求1～5任一项所述的制备方法制备得到的复合磁性固相萃取材料。
7.根据权利要求6所述的复合磁性固相萃取材料在类固醇激素的富集、浓缩和/或检测中的应用，其特征在于：所述类固醇激素为化学结构中含有羟基、羧基的类固醇激素。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述类固醇激素为美雄醇、可的松和勃地酮中的至少一种。
9.一种利用权利要求6所述的复合磁性固相萃取材料富集、浓缩和检测类固醇激素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(A)样品预处理：向待测离体血液加入预处理制剂，预处理制剂和待测离体血液的体积比为1～4：1，在0～20℃低温条件下以5000～10000rpm转速高速离心分离，将上清液分离收集，得到预处理全血；
(B)萃取：取预处理全血加入复合磁性固相萃取材料悬浊液中，以1000～2500rpm震荡混匀3～20min以富集浓缩目标物，再利用磁吸附将复合磁性固相萃取材料取出，用纯水润洗数次，晾干；
(C)洗脱：用甲醇对步骤(B)晾干后的复合磁性固相萃取材料进行洗脱、过滤，得到含有类固醇激素的洗脱液。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：
步骤(A)中所述的预处理制剂为等同体积的无水甲醇与0.1mol/L的硫酸锌溶液混合而成的甲醇-硫酸锌溶液；所述预处理制剂和待测离体血液的体积比为2：1；所述的低温条件为5℃；所述的离心分离的转速为9000rpm；
步骤(B)中所述的预处理全血和复合磁性固相萃取材料悬浊液的用量为10mL复合磁性固相萃取材料悬浊液添加200μL预处理全血；所述震荡的转速为1500rpm；所述震荡的时间为10min；
步骤(C)中所述的甲醇和复合磁性固相萃取材料的用量为每1mL甲醇洗脱100mg复合磁性固相萃取材料；所述洗脱的次数为两次。
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