CN113318715A - 一种磷酸化肽吸附剂及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种磷酸化肽吸附剂及其制备和应用。具体是以三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(Trimethylolpropane trimethacrylate,TRIM)和烯丙基缩水甘油醚(Allyl glycidyl ether，AGE)为功能单体，采用悬浮聚合法制备带有环氧官能团的聚合物微球，然后用O‑磷酸‑L‑丝氨酸(O‑phospho‑L‑serine)进行修饰，直接在微球表面引入磷酸基团，最后用Ti4+离子螯合后即可用作固定化金属离子亲和色谱(Immobilized metal affinity chromatography,IMAC)的吸附剂，富集复杂生物样品中的磷酸肽。该制备方法简单，原料易得，成本低廉，反应条件温和，适合于大规模制备。所得材料性能稳定，抗碱性强，对生物样品中的磷酸肽具有很高的富集效率及特异选择性。

Description

一种磷酸化肽吸附剂及其制备和应用
技术领域
本发明涉及一种磷酸化肽富集材料的制备和应用，具体是以悬浮聚合法制备的带有环氧基团的聚合物微球为基质，依次用O-磷酸-L-丝氨酸和Ti4+进行修饰，制备出一种可用于磷酸化肽富集的固定化金属离子亲和色谱(IMAC)材料。
背景技术
磷酸化修饰是一种非常重要的蛋白质翻译后修饰，蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的整个过程，包括细胞的增殖、发育、分化和凋亡、神经活动等(文献1，Steen H.et.al“Phosphorylation Analysis by Mass Spectrometry”Mol.Cell.Proteomecs.2006,5,172-181；文献2，Qing G et.al“Hydrogen bond basedsmart polymer for highly selective and tunable capture of multiplyphosphorylated peptides”Nat.Commun.2017,8,文献号461)。蛋白质磷酸化的调节是一个非常复杂的级联反应过程，其异常的调节会导致人类许多疾病，如糖尿病、白血病、癌症和老年痴呆症等，因此研究蛋白质磷酸化过程具有重大的理论和现实意义，近些年来已经成为蛋白质组学的研究热点之一(文献3，“功能化磁性纳米材料在磷酸化肽富集中的应用”色谱，2020,38,60-65)。基于质谱分析的蛋白质组学方法是研究磷酸化肽最常用、最有效的工具之一。然而由于蛋白酶解产物中磷酸化肽段丰度极低，非磷酸肽信号干扰严重，所以进入质谱分析前需要对其进行分离富集。
固定化金属离子亲和色谱(IMAC)是一种常用的磷酸化肽富集方法，广泛应用于磷酸化蛋白质组学研究。该方法利用螯合在基质上的金属离子，如Fe(III)、Ti(IV)、Zr(IV)等，与磷酸肽之间发生的静电与螯合协同作用，可以从生物样品中特异性地吸附磷酸化肽段(文献4，韩彬等“固定化金属离子亲和色谱研究进展”科技导报,2017,35,92-100)。但是现有IMAC材料大多制备流程复杂，反应条件苛刻，或者制备成本高，不利于大规模制备，因此发展制备过程简单的新方法仍然具有重要的意义。
发明内容
本发明涉及一种聚合物微球基质的磷酸化肽富集材料。具体是先以三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸(TRIM)和烯丙基缩水甘油醚(AGE)为功能单体，采用悬浮聚合法制备具有环氧官能团的聚合物微球，然后以O-磷酸-L-丝氨酸(O-phospho-L-serine)为修饰剂采用环氧-胺开环反应，将磷酸根官能团直接引入到微球表面，最后利用螯合作用将Ti4+离子螯合到微球表面，制备出可用于富集磷酸化肽的金属离子亲和色谱(IMAC)吸附剂材料。
具体制备过程包括如下步骤：
(1)具有环氧官能团的聚合物微球制备：将0.2～0.6g的聚乙烯醇加入到40～80mL甲醇-水的混合溶剂中(体积比：甲醇/水＝5/1～5/3)，先将其加热到50～70℃使其完全溶解，再冷却至室温(20～25℃)，然后逐滴加入1～3g烯丙基缩水甘油醚和3～5g三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，接着加入40～80mg的偶氮二异丁腈，在60～80℃条件下，以300～600rpm的搅拌速率进行机械搅拌，2～3h后升温至85～95℃，继续反应20～40min后停止加热，产物依次用甲醇和水进行洗涤，去除残余试剂，干燥后得到环氧聚合物微球；
(2)磷酸基团功能化的聚合物微球的制备：在离心管中将0.5～1.0g O-磷酸-L-丝氨酸溶于15～20mL水中，然后先用0.5～2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至6.8～7.2，再加入0.1～0.3g碳酸钠，使溶液pH值为8～9，配成修饰剂；将1.0～2.0g步骤(1)中得到的聚合物微球分散在修饰液中，在60～100℃条件下，以100～150rpm的搅拌速度反应4～12h；反应结束后，用水将材料洗至6.8～7.2，得到磷酸功能化的聚合物微球；
(3)IMAC吸附剂的制备：将步骤(2)中得到的磷酸功能化的聚合物微球分散在10～20mL浓度为0.5～1.0g/mL的硫酸钛(Ti(SO4)2)溶液中，20～25℃下以100～150rpm的频率搅拌，孵育4～16h，反应结束后用去离子水将材料洗涤3～5次，去除材料中未被螯合的钛离子，干燥后得到Ti4+-IMAC材料。
本发明以三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和烯丙基缩水甘油醚为原料，采用悬浮聚合法制备带有环氧官能团的聚合物微球，然后用O-磷酸-L-丝氨酸进行修饰，直接在微球表面引入磷酸基团，最后用Ti4+离子螯合后即可制备出IMAC吸附剂，富集复杂生物样品中的磷酸肽。
本发明所制备的Ti4+-IMAC功能材料，热稳定性好，耐酸碱能力强(因为基质为聚合物微球)，对生物样品中的磷酸肽具有很高的富集能力和富集特异性，在生物样品前处理方面展现出了良好的应用前景。所述制备方法，反应条件温和，步骤简单，原料易得，成本低廉，适合于大规模制备。
附图说明
图1.本发明基于环氧聚合物微球制备Ti4+-IMAC功能材料的制备示意图。
图2.磷酸丝氨酸-聚合物微球及其制备单体的红外对比图。
图3实施例1中基于环氧聚合物微球制备的Ti4+-IMAC功能材料的热失重图。
图4Ti4+-IMAC功能材料对由β-酪蛋白(β-casein)酶解液和牛血清白蛋白(BSA)酶解液组成的混合酶解液(β-casein/BSA，1/100，质量比)富集前后的MALDI-TOF-MS对比图:(a)富集前，(b)实施例1制备Ti4+-IMAC微球富集后，(c)实施例2商品化的Ti4+-IMAC微球富集后。*为磷酸肽峰。
具体实施方式
实施例1基于环氧聚合物微球制备的Ti4+-IMAC功能材料用于磷酸肽的分离富集Ti4+-IMAC功能材料的制备：
(1)环氧基团功能化的聚合物微球制备：将0.5g聚乙烯醇加入到60mL甲醇-水的混合溶剂中(甲醇/水＝5/2，体积比)，加热到60℃使其完全溶解，再冷却至室温(22℃)，然后逐滴加入2g烯丙基缩水甘油醚和2g三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，再加入60mg偶氮二异丁腈，于70℃油浴中，以500rpm的搅拌速率进行机械搅拌，2h后升温至85℃，继续反应30min后停止加热，产物依次用甲醇和水进行洗涤，去除残余试剂，60℃真空干燥12h，得到环氧聚合物微球。
(2)磷酸基团功能化的聚合物微球的制备：在烧杯中将1.0g O-磷酸-L-丝氨酸溶于10mL水，然后用1.0mol/L的氢氧化钠调节溶液至中性，再加入0.2g碳酸钠，调节溶液pH值为8～9，配成修饰液；将1.0g步骤(1)中得到的聚合物微球分散在修饰液中，于60℃油浴中，以120rpm的搅拌速度加热反应6h。反应结束后，用水将材料洗至中性，得到磷酸功能化的聚合物微球。
(3)Ti4+-IMAC吸附剂的制备：将步骤(2)中得到的材料分散在15mL浓度为1.0g/mL的硫酸钛(Ti(SO4)2)溶液中，室温下以120rpm的频率，孵育4h，反应结束后用去离子水将材料洗涤至中性，60℃真空干燥12h，得到Ti4+-IMAC材料，粒径100～200μm，平均粒径160μm。
酶解样品的制备：
将1mg酪蛋白(β-casein)或者牛血清白蛋白(BSA)溶解在含8M尿素的100mM碳酸氢铵溶液中(pH＝8.2)，然后加入80μmol二硫苏糖醇，60℃恒温1h，再加入40μmol碘代乙酰胺，避光40min，再用100mM的碳酸氢铵溶液将尿素浓度稀释到1M，按照蛋白质与酶的质量比为1:20的比例加入胰蛋白酶，在37℃的水浴中酶解反应16h，将得到的酶解液分装后保存在-20℃的冰箱中备用。
磷酸化肽的富集：
称取5mg Ti4+-IMAC微球材料于离心管中，先用上样溶液(乙腈/三氟醋酸/水＝80/6/14，体积比)酸化平衡；在室温下(25℃)，将100μL酶解液与100μL上样溶液等体积混合，并转移至装有Ti4+-IMAC材料的离心管中。室温下振荡(1,500rpm)30min后离心(14,000rpm)，除去上清溶液；用200μL洗涤溶液A(为含有200mM NaCl、50％乙腈、6％三氟乙酸(体积浓度)的水溶液)洗涤材料三次，每次震荡(1,500rpm)15min，以除去吸附在材料上的非磷酸肽段(每次洗涤后均需离心分离除去洗涤后溶液)，接着用200μL洗涤溶液B(乙腈/三氟醋酸/水＝30/0.1/69.9，体积比)洗涤材料三次，每次振荡(1,500rpm)15min(每次洗涤后均离心分离除去洗涤后溶液)；最后用100μL洗脱液(质量百分比为10％的氨水)将富集到材料上的磷酸肽洗脱下来，得到的洗脱液用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-AssistedLaser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS)进行分析。
MALDI-TOF MS分析过程：
将0.5μL洗脱液滴加在MADLI靶上，待其自然晾干后，将0.5μL 2,5-二羟基苯甲酸溶液(DHB，25mg/mL)覆盖到样品点上，待完全自然晾干后，送入质谱仪进行分析。
实施例2商业化Ti4+-IMAC微球用于磷酸化肽的分离富集
商业化Ti4+-IMAC微球购自百灵威试剂公司，其磷酸肽富集与质谱鉴定过程均同实施例1。
材料表征：
以傅里叶变换衰减全反射红外光谱法(ATR-FTIR)对环氧聚合物微球、磷酸丝氨酸-聚合物微球及O-磷酸-L-丝氨酸单体进行了表征。如图2所示，在环氧聚合物微球谱图中出现了波数在910cm-1和1255cm-1的环氧基团特征振动峰，而在磷酸丝氨酸-聚合物微球的谱图中波数在910cm-1的吸收峰消失，波数在1255cm-1处的吸收峰强度也出现了明显下降，表明聚合物微球表面上的环氧基团与O-磷酸-L-丝氨酸单体发生了开环反应，其含量明显下降。O-磷酸-L-丝氨酸的谱图中可以观察到波数在3175cm-1和3101cm-1的两个N-H伸缩振动峰，以及在1560cm-1处的N-H弯曲振动峰，这些峰在磷酸丝氨酸-聚合物微球的红外谱图中基本消失。但是在磷酸丝氨酸-聚合物微球谱图中却出现了波数在1257cm-1的归属于P＝O双键的伸缩振动峰。这些数据表明，磷酸根被成功的接枝到了环氧聚合物微球的表面。
热失重测定结果如图3所示，磷酸丝氨酸聚合物微球的分解温度在250℃，说明该材料具有良好的热稳定性。
按照质量比为1:100将β-casein与BSA的酶解液进行混合形成的混合酶解液作为样品，分别用实施例1中制备的Ti4+-IMAC聚合物微球以及商品化的Ti4+-IMAC微球进行富集，结果如图4所示。富集前磷酸肽的丰度很低(图4a)，谱图信号基本被非磷酸肽的信号占据，磷酸肽信号很弱；用实施例1所制备的Ti4+-IMAC微球富集后(图4b)，仅出现了三条明显质荷比为2061、2556、3122的磷酸肽特征峰，而非磷酸肽峰基本消失，说明该材料对磷酸肽有特异性的富集效果。虽然从百灵威公司购买的商品化的Ti4+-IMAC微球也可以从混合酶解液中富集到全部三条磷酸肽峰(图4c)，但非磷酸肽信号依然不能忽略，并且在同等条件下，实施例1制备的材料富集到的三条磷酸肽特征峰中有一条特征峰强度(2061，m/z)高于商品化材料富集到的该峰强度，一条特征峰强度(2056，m/z)低于商品化材料富集到的该峰强度，另一条特征峰强度(3122，m/z)则与商品化材料富集到的该峰强度相当。这些鉴定结果说明本发明基于环氧聚合物微球所制备的Ti4+-IMAC材料比商品化的Ti4+-IMAC材料对磷酸肽具有更高的选择性和与其相当的富集效率，可以用于复杂生物样品中磷酸肽的高效富集，由于整个制备过程反应条件温和，原材料易得价廉，因此适合于大规模制备。

Claims (9)

1.一种磷酸化肽吸附剂的制备方法，首先以三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)和烯丙基缩水甘油醚(AGE)为功能单体，采用悬浮聚合法制备带有环氧官能团的聚合物微球，再以此聚合物微球为基质，利用环氧-胺开环反应，以O-磷酸-L-丝氨酸为修饰剂将磷酸官能团一步引入到微球表面，最后用Ti4+离子进行螯合，即可制备出具有磷酸肽富集功能的IMAC吸附剂。
2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
所制备IMAC吸附剂结构示意式如下所示：
Figure FDA0002394884200000011
其中左侧的圆球代表聚合物微球。
3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
具体制备过程，以三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)和烯丙基缩水甘油醚(AGE)为功能单体，聚乙烯醇(PVA)为分散剂，偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，采用悬浮聚合法制备带有环氧官能团的聚合物微球；
以O-磷酸-L-丝氨酸(O-phospho-L-serine)为修饰剂，采用环氧-胺开环反应将磷酸官能团引入到环氧聚合物微球表面；
以硫酸钛为螯合剂在微球表面螯合Ti4+离子，制备IMAC功能材料。
4.根据权利要求1或3所述的制备方法，其特征在于：可按如下步骤进行操作，
(1)具有环氧官能团的聚合物微球制备：将0.2～0.6g的聚乙烯醇加入到40～80mL甲醇-水的混合溶剂中(体积比：甲醇/水＝5/1～5/3)，先将其加热到50～70℃使其完全溶解，再冷却至室温(20～25℃)，然后逐滴加入1～3g烯丙基缩水甘油醚和3～5g三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，接着加入40～80mg的偶氮二异丁腈，在60～80℃条件下，以300～600rpm的搅拌速率进行机械搅拌，2～3h后升温至85～95℃，继续反应20～40min后停止加热，产物依次用甲醇和水进行洗涤，去除残余试剂，干燥后得到环氧聚合物微球；
(2)磷酸基团功能化的聚合物微球的制备：在离心管中将0.5～1.0g O-磷酸-L-丝氨酸溶于15～20mL水中，然后先用0.5～2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至6.8～7.2，再加入0.1～0.3g碳酸钠，使溶液pH值为8～9，配成修饰剂；将1.0～2.0g步骤(1)中得到的聚合物微球分散在修饰液中，在60～100℃条件下，以100～150rpm的搅拌速度反应4～12h；反应结束后，用水将材料洗至6.8～7.2，得到磷酸功能化的聚合物微球；
(3)IMAC吸附剂的制备：将步骤(2)中得到的磷酸功能化的聚合物微球分散在10～20mL浓度为0.5～1.0g/mL的硫酸钛(Ti(SO4)2)溶液中，20～25℃下以100～150rpm的频率搅拌，孵育4～16h，反应结束后用去离子水将材料洗涤3～5次，去除材料中未被螯合的钛离子，干燥后得到Ti4+-IMAC材料。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中的干燥过程是在50～100℃条件下真空干燥6～12h；
步骤(3)中的干燥过程是在50～80℃条件下真空干燥5～12h。
6.一种权利要求1-5任一所述制备方法获得的磷酸化肽吸附剂，其为Ti4+-IMAC微球材料。
7.根据权利要求6所述的吸附剂，其特征在于：
微球的粒径范围100～200μm。
8.一种权利要求6或7所述磷酸化肽吸附剂的应用，其特征在于：
所述Ti4+-IMAC微球材料可用于富集生物样品中的磷酸化肽段。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：
所述生物样品为酪蛋白酶解液、血清酶解液、Hela细胞酶解液、牛血清白蛋白酶解液中的一种或两种以上。
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