CN105219836A - 一种微阵列用活性醛基修饰基片 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微阵列用活性醛基修饰基片，本发明所提供的生物芯片基片是在氨基化表面上连接醛基基团的基片。本发明提供的醛基基片，因使用浓硫酸处理清洗，解决了普通基片杂质点较多的问题，使用多聚赖氨酸和制成氨基化表面，并再用戊二醛作为醛基基团的供体，形成了静电吸附和化学偶联的联合作用，提高了核酸的固定力，使各探针点的形状饱满规则，提高了基片的稳定性。因此本发明提供的醛基基片是一种优良的生物芯片探针载体，可广泛应用于生物芯片制备。

Description

一种微阵列用活性醛基修饰基片

技术领域

本发明涉及一种生物微阵列基片。适用于医学及生物学领域。

背景技术

现今，生物微阵列已经成为生命科学及医学研究与检测不可缺少的工具，因其高通量，高灵敏度，高准确性的优点使得生物微阵列在分析基因突变、基因表达谱、蛋白质反应及病原物检测等领域被广泛应用。而基片是微阵列的基础，其制备是生物微阵列的研制中十分重要的环节。

生物微阵列一般选择经过相应处理的硅片、玻璃片、金属片、塑料片或硝酸纤维素膜作为载体。玻璃片由于廉价、表面光滑、低荧光背景等优点被广泛应用。

要使探针固定在玻璃表面，必须先对其进行物理化学修饰。目前常用的修饰方法有氨基修饰、醛基修饰等，其中普通基片多数使用氨基基片，这类载体仅通过物理吸附作用把探针固定于玻璃片表面，这种方法便于制备，成本较低，但是经常出现探针固定率低，表面均一性差，会有背景较高杂质点出现，探针点形态不规则，同一点内分布不均匀，玻璃片背景较高等问题。因此发明一种制备方法简单，同时能有良好的生物分子结合能力和表面均一性高、背景低、探针点固定率高、信号强的的生物微阵列基片十分必要。

发明内容

本发明提供一种微阵列用活性醛基修饰基片。该基片制备方法简单，成本低，适合于工业化生产。所得基片背景低、表面均一、探针点规则、探针固定率高、它同时具有静电吸附和化学偶联的作用，是一种性能优越的微阵列载体。

为实现上述目的，本发明的制作采用如下技术方案：1.玻片的预处理；以往的普通基片初步清洗过程清洗过程多数仅使用普通纯净水或是一些弱酸来进行，这样的清洗方式在后续的芯片制备中会存在点样扫描后，芯片背景有杂质点，这些杂质点会对扫描仪读取信号产生干扰，造成读数不准确，影响芯片的检测效果，并且同时严重影响芯片的外观效果。为解决这样的问题，本发明中，采用浓度浓硫酸进行，将玻片浸入浓硫酸中1-2小时，而后浓硫酸较强的酸性可以使玻片表面绝大多数的杂质异物等脱离或溶解，而玻片本身性能不受影响，最终能得到背景较干净均匀的基片，此步骤同时可解决普通基片中出现的探针点不均匀及形态不规则的问题。

2.多聚赖氨酸包被；上述的活性醛基修饰基片制备方法中，在初步清洗之后，纯化水洗净浓硫酸，引入活性基团之前，需在玻片表面包被一层多聚赖氨酸。将玻片浸于多聚赖氨酸溶液中10-30分钟，此步骤可在玻璃表面形成三维立体结构，此结构使载体表面与探针接触面积大大增加，也增加了固定率。多聚赖氨酸提供的氨基也是活性醛基基团的结合位置。多聚赖氨酸对探针产生物理吸附作用，其静电效应可以一定程度的吸附探针。

3.引入活性醛基基团；上述的活性醛基修饰基片制备方法中，使用戊二醛引入活性醛基基团。用纯净水洗去多余的多聚赖氨酸溶液后，使用戊二醛溶液浸泡玻片10-30分钟，以引入活性基团。醛基基片通过其表面的醛基基团与生物分子中的氨基形成Schiff碱来固定生物分子：DNA·(CH2)·NH6+R-CHO---~DNA-(CH2)-N=OHC-R，提供了牢固的化学结合的作用，相比普通基片单纯的物理吸附作用，提高了探针的固定率。如图1所示。

4．玻片的清洗；上述的活性醛基修饰基片制备方法中，每一步骤完成后都要对玻片进行一次清洗，与普通基片使用纯化水清洗方式不同的是，本发明中采用氧等离子清洗方式。氧等离子清洗过程，根据其原理，在真空状态下，压力越来越小，分子间间距越来越大，分子间力越来越小，利用射频电源产生的高压交变电场将氧气震荡成具有高反应活性或高能量的离子，然后与有机污染物及微颗粒污染物反应或碰撞形成挥发性物质，然后由工作气体流及真空泵将这些挥发性物质清除出去，从而达到表面清洁活化的目的。是清洗方法中最为彻底的剥离式清洗。

使用以上方法制备得到的醛基基片，是一种性能优越的基片材料。

附图说明

图1.活性醛基与DNA中的氨基生成Schiff碱机理图。

图2.多聚赖氨酸静电吸附作用机理图。

图3.普通氨基片与本发明基片点样后背景对比图。

图4.普通氨基片与本发明基片探针形态规则及均匀度对比图。

图5.普通氨基片与本发明基片点样后背景比较图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的使用范围。在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明所述活性醛基修饰基片制备方法：1.玻片预处理：将玻片放置玻片架，将整个玻片架，连同玻片置于事先浸泡于纯化水中2分钟。然后将玻片架从纯化水中取出，并放置于浓硫酸中，计时2小时。计时浸泡完成后将玻片从浓硫酸中缓慢取提起，靠容器壁沥干玻片上附着的浓硫酸，直到无液体滴下时取出，将玻片放入纯化水中，浸泡2分种。浸泡完成后将玻片取出并放入事先装好纯化水的氧等离子清洗机中，清洗2分钟，排干并再次加入等量纯化水，清洗2min，总计清洗3次，洗脱完毕后排干纯化水。

2.多聚赖氨酸的包被：将玻片从清洗机中取出，放置于多聚赖氨酸溶液中，浸泡30分钟，将载玻片转移至预先盛有纯化水的“玻片清洗机”中，清洗1min,排干纯化水，加入等量纯化水重复清洗1次。清洗完毕后将洗脱仪中的水排干。将玻片取出置于预先开启并恒温60℃的鼓风干燥箱内烘干40分钟，然后将玻片取出，冷却至室温。

3.引入活性醛基：将冷却至室温的玻片放入戊二醛溶液中，计时浸泡30分钟，将玻片转移至预先盛有纯化水的“玻片清洗机”中，清洗1min,排干纯化水，加入等量纯化水清洗1min。清洗完毕后将洗脱仪中的水排干，然后转移到鼓风干燥箱内60℃烘干30min。烘干完毕后，活性醛基修饰基片制备完成。

点样：使用3′端氨基修饰，5′端HEX荧光标记修饰的特定序列探针，配制浓度为50ng/μl的探针溶液，将配制好的探针按照每孔80μl上样于384孔样品板。将点样仪设置为直径2个drop，矩阵设置为4×4矩阵图形。点样应分别点样于本发明制备的活性醛基修饰基片和普通氨基片，如图2，图3，图中A为本发明制备的活性醛基修饰基片，B为普通氨基片。其中，普通氨基片未经浓硫酸处理，未使用氧等离子清洗，未引入活性醛基，只经过纯化水洗后多聚赖氨酸包被制得。

洗脱前扫描：点样完成后，对固定完成后的芯片使用激光共聚焦芯片扫描仪进行扫描，读取532nm共聚焦扫描的荧光值中值（F532Median）。

洗片：数据读取完成后，进行微阵列洗脱，洗脱方法为：洗脱液Ⅰ（含0.1%SDS的2×SSC溶液）中100r/min洗脱5min；洗脱液Ⅱ（0.25%-0.3%2×SSC溶液）42℃封闭8-10min；洗脱液Ⅲ（2×SSC溶液）中100r/min洗脱5min；纯化水中100r/min洗脱5min晾干。

洗脱后扫描：洗脱完成后同样对微阵列使用激光共聚焦芯片扫描仪进行扫描，读取532nm共聚焦扫描的荧光值中值（F532Median）。

数据计算：计算芯片洗脱后和洗脱前532nm荧光值中值（F532Median）的信号强度比值。计算结果列入表1。

表1.活性醛基修饰基片与普通氨基片固定率比较。

由表1比较可知，活性醛基修饰基片的探针固定率均值为67%，而普通氨基片探针固定率均值仅为31%左右，可见本发明所述活性醛基修饰基片可使探针固定率提高一倍以上。

经比较，图3中普通氨基片B背景杂质较多，而本发明所述活性醛基修饰基片A，背景均匀。

经比较，图3中普通氨基片B会出现探针点不均一，如空心点现象，而本发明所述活性醛基基片A点形态规则，探针内部较均匀。

经比较，图5中普通氨基片B，背景很高，已使探针点形态不明显，难以用肉眼识别。

因此，本发明所述微阵列用活性醛基修饰基片是一种性能优越的微阵列载体，其制备方法也较简单，成本低，适于工业化生产。

Claims (8)

1.一种生物微阵列用基片，是在浓硫酸处理过的玻片表面包被多聚赖氨酸，再在多聚赖氨酸上连接上醛基基团。

2.根据权利要求1所述的基片，其特征在于：多聚赖氨酸的静电吸附作用和醛基基团与生物分子中的氨基形成Schiff碱同时来固定生物分子。

3.一种制备权利要求1所述的基片，其特征在于：制备时第一步、玻片用浓硫酸预处理并进行玻片清洗；第二步、玻片包被多聚赖氨酸并进行玻片清洗，干燥；第三步、玻片连接醛基并进行玻片清洗，干燥。

4.根据权利要求1所述的基片，其特征在于：制备时使用80%以上浓硫酸预处理时，玻片放置于浓硫酸中浸泡1-2小时。

5.根据权利要求1所述的基片，其特征在于：制备时玻片包被多聚赖氨酸，使用多聚赖氨酸溶液，浸泡玻片10-30分钟。

6.根据权利要求1所述的基片，其特征在于：玻片连接醛基时，使用浓度为的戊二醛溶液，浸泡玻片10-30分钟。

7.根据权利要求1所述的基片，其特征在于：玻片清洗是指用氧等离子清洗方式清洗

根据权利要求1所述的基片，其特征在于：玻片干燥是指将玻片置于55-65℃下干燥30-60分钟。

8.由权利要求1所述的基片制得的生物微阵列芯片。