TWI513662B - 表面含有二氧化鈦之板及其製造方法與應用 - Google Patents

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Description

表面含有二氧化鈦之板及其製造方法與應用
本發明係關於一種表面含有二氧化鈦之板及其製造方法與應用；本發明亦關於一種純化磷酸化胜肽的方法，包含使用該表面含有二氧化鈦之板。
蛋白質磷酸化為一常見的蛋白質後轉譯修飾(protein post-translational modification)，係一可逆的蛋白質修飾過程。已知蛋白質磷酸化與生物體中許多生化反應過程之調控有關，例如細胞生長、代謝、凋亡、以及細胞訊息傳遞之調控等。若生物體特定蛋白質發生過度磷酸化，就可能導致疾病的發生。舉例言之，研究發現，當人體大腦中之微管相關蛋白質(microtubule-associated protein，Tau)過度磷酸化，則可能會使蛋白質異常堆積在細胞內而造成神經纖維糾結，引起阿茲海默症之疾病。因此，有關磷酸化蛋白質之研究，乃蛋白質體學中的重要研究課題。
目前對於磷酸化蛋白質的研究，主要係使用質譜儀技術分析磷酸化蛋白質的特性與磷酸基團的結合位置。然而，在判讀蛋白質樣品中磷酸化蛋白質之質譜儀訊號時，蛋白質樣品中 含量極低的磷酸化胜肽之質譜儀訊號通常會受到含量豐富的非磷酸化胜肽之質譜儀訊號的抑制。此外，相較於未經磷酸化修飾之胜肽，磷酸化胜肽之酸性較高，故其陽離子形成效率較低，因而增加使用質譜儀鑑定磷酸化胜肽的難度。因此，為了改進以質譜儀偵測磷酸化胜肽的敏感度，通常需先將磷酸化胜肽由蛋白質混合物中純化出來再進行質譜分析。
傳統用於純化磷酸化胜肽的方法包括固定化金屬離子親和性層析法(immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC)，其係利用鐵離子(Fe3+ )或鎵離子(Ga3+ )螯合磷酸化胜肽上的磷酸化基團。然由於IMAC方法係以離子作用力為基礎，其選擇性常受限於酸性非磷酸化胜肽之非專一性結合。另一種習知用於純化磷酸化胜肽的方法為金屬氧化物親和層析法(Metal Oxide Affinity Chromatography，MOAC)，其係包含於純化過程中使用酸性緩衝液，以避免非磷酸化蛋白質與配體(ligand)產生非專一性結合。
已知二氧化鈦可專一性地與磷酸化胜肽結合，業經開發將二氧化鈦用於MOAC方法中，製成微量吸管等可用以純化磷酸化胜肽的工具。然而，於使用傳統微量吸管(pipette tips，如TiO2 Tip)以純化磷酸化胜肽時，一般需先將二氧化鈦顆粒(TiO2 beads)裝填至微量吸管中，再配合離心操作步驟進行胜肽樣品之裝填、清洗、以及沖提等步驟，且於完成純化後，還須將所沖提之樣品加載(loading)至質譜儀之樣品盤上，始能進行質譜儀分析。因此，使用如TiO2 Tip之微量吸管以純化磷酸化胜肽，除無法進行高通量(high throughput)之樣品分析以外，另存在操作費 時、耗費人力、樣品易於多步驟處理過程中損耗、以及實驗再現性可能受樣品沖提速度等人為操作變因影響等缺點。
鑒於此，本案發明人經研究後發現，可透過一簡易方法而將二氧化鈦固定於一表面上，從而提供一表面含有二氧化鈦之板，其用於純化磷酸化胜肽時，具有操作簡單、高通量(即，可批次純化多個樣品)、實驗再現性高、以及可簡易再生基材等優點。
本發明之一目的，在於提供一種表面含有二氧化鈦之板，包含：(A)一基材；(B)一聚二甲基矽氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)膜層，位於該基材之至少一表面上；以及(C)一或多個二氧化鈦顆粒聚集體，位於該聚二甲基矽氧烷膜層上。
本發明之另一目的，在於提供一種製備上述於表面含有二氧化鈦之板的方法，其係包含以下步驟：(a)提供一基材；(b)於該基材之至少一表面形成一聚二甲基矽氧烷膜層；(c)將一含二氧化鈦顆粒之含水懸浮液施用於該聚二甲基矽氧烷膜層之至少部分表面上；以及(d)乾燥該二氧化鈦懸浮溶液，形成一或多個二氧化鈦顆粒聚集體於該聚二甲基矽氧烷膜層上。
本發明之又一目的，在於提供一種純化磷酸化胜肽的方法，其係包含以下步驟：(i)使一胜肽溶液與前述於表面含有二氧化鈦顆粒之板之二氧化鈦顆粒聚集體接觸歷時1分鐘至60分鐘；(ii)以一清洗溶液淋洗該二氧化鈦顆粒聚集體；以及(iii)使該二氧化鈦顆粒聚集體與一沖提溶液接觸歷時1分鐘至30分鐘，以沖提出經磷酸化之胜肽。
本發明之詳細技術及較佳實施態樣，將描述於以下內容中，以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之技術內容。
第1a圖所示為以顯微鏡觀察本發明之表面含有二氧化鈦顆粒之板上之二氧化鈦顆粒聚集體的照片；第1b圖所示為以光學掃描器掃描根據本發明之表面含有二氧化鈦之板之影像；第2a圖所示為未經純化之卵白蛋白進行MALDI-TOF分析之質譜圖；第2b圖所示為卵白蛋白經一根據本發明之表面含有5微米之二氧化鈦顆粒之板純化並進行MALDI-TOF分析之質譜圖；第2c圖所示為卵白蛋白經一根據本發明之表面含有小於150奈米之二氧化鈦顆粒之板純化並進行MALDI-TOF分析之質譜圖；第3a圖所示為未經純化之複雜胜肽混合物進行MALDI-TOF分 析之質譜圖；第3b圖所示為經一根據本發明之表面含有二氧化鈦之板純化之複雜胜肽混合物進行MALDI-TOF分析之質譜圖；第4a圖所示為未經純化之磷酸化胜肽混合物進行MALDI-TOF分析之質譜圖；第4b圖所示為經一根據本發明之表面含有二氧化鈦之板純化之磷酸化胜肽混合物進行MALDI-TOF分析之質譜圖；第5a圖所示為2毫微微莫耳之β-酪蛋白經一根據本發明之表面含有二氧化鈦之板純化後進行MALDI-TOF分析之質譜圖；第5b圖所示為20毫微微莫耳之β-酪蛋白經TiO2 Tip純化後進行MALDI-TOF分析之質譜圖；以及第6圖所示為0.5微克至100微克之β-酪蛋白經一根據本發明之表面含有二氧化鈦之板純化後，2061.8 m/z與2465.2 m/z之訊號峰的訊號強度比。
以下將描述根據本發明之部分具體實施態樣；惟，在不背離本發明精神下，本發明尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將本發明保護範圍解釋為限於說明書所陳述者。此外，除非文中有另外說明，於本說明書中(尤其是在後述專利申請範圍中)所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式。
蛋白質磷酸化係指在蛋白質分子上加上一個磷酸(PO4 )基團，此磷酸化作用主要發生在絲胺酸(Serine)、蘇胺酸 (threonine)、及酪胺酸(Tyrosine)等胺基酸殘基上。已知二氧化鈦與磷酸基團之間可產生良好的親合性鍵結，故可用於純化磷酸化蛋白質。然而，如上所述，傳統用於固定二氧化鈦以進行磷酸化蛋白質之純化的方法仍存在許多缺點。是故，目前仍持續存在關於可簡便且有效固定二氧化鈦之方法的需求。
本案發明人意外發現，可透過二氧化鈦顆粒之含水懸浮液，使二氧化鈦顆粒有效地以聚集體形式固定於聚二甲基矽氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)膜層表面，從而提供一種表面含有二氧化鈦之板，該板可用於純化磷酸化胜肽。特定言之，本發明之表面含有二氧化鈦之板係包含：(A)一基材；(B)一聚二甲基矽氧烷膜層，位於該基材之至少一表面上；以及(C)一或多個二氧化鈦顆粒聚集體，位於該聚二甲基矽氧烷膜層之表面上。
於根據本發明之表面含有二氧化鈦之板中，該基材係指一可用於支撐該聚二甲基矽氧烷膜層之構件，其形狀與材質均無特殊限制，可根據實際應用來選擇。一般而言，由於聚二甲基矽氧烷乃很好的附著物，與多材質之附著性皆很好，因此，可於本發明中使用例如選自以下群組之基材：金屬基材、玻璃基材、聚合物基材(如聚甲基丙烯酸甲酯基材、聚碳酸酯基材、聚對苯二甲酸乙二酯基材、聚對苯二甲酸乙二酯基材)、以及木質基材等。此外，視實際應用需求，該基材表面可為平滑或不平滑(如：具有凹槽)者。於本發明之一具體實施態樣中，係使用盤狀之不鏽鋼金屬(stainless steel)基材。
聚二甲基矽氧烷為一高分子有機矽化合物，具有不易燃、惰性、無毒等性質。聚二甲基矽氧烷於固化前為一黏稠液 體，具有如下式1之結構，其黏度隨n值增加而提高，且其結構鏈中的甲基與端基可部分經其他官能基取代，例如可經選自以下群組之基團取代：氫基、乙烯基或苯基：
固化後的聚二甲基矽氧烷為一疏水性膜層，與各種材質之基材皆具有良好之附著性質，且具有可撓性、熱穩定性、以及光學透明性，可用於醫藥領域如作為人造器官、導管、隱形眼鏡、藥物傳遞系統之材料；且亦可於工業界中用作微流體裝置(microfluidic device)、微反應器(microreactor)之材料；或作為填縫劑、絕緣體等。
可使用任何可提供聚二甲基矽氧烷的方法以於基材上形成根據本發明之聚二甲基矽氧烷膜層。舉例言之，可透過混合一氫基官能化之聚二甲基矽氧烷(hydrogen-functional PDMS)以及一乙烯基官能化之聚二甲基矽氧烷(vinyl-functional PDMS)，並視需添加一含鉑催化劑，從而於基材表面固化並形成聚二甲基矽氧烷膜。前述固化反應，係透過氫基官能化之聚二甲基矽氧烷之矽氧基團(silane group)與乙烯基官能化之聚二甲基矽氧烷之乙烯基團進行加成反應而達成。該氫基官能化之聚二甲基矽氧烷的例子，包含但不限於：聚甲基氫矽氧烷(Poly(methylhydrosiloxane))、三甲基矽基封端之聚甲基氫矽氧烷(Poly(methylhydrosiloxane),trimethylsilyl terminated)、三甲基矽基封端之聚二甲基矽氧烷-共-甲基氫矽氧烷 (Poly(dimethylsiloxane-co-methylhydrosiloxane),trimethylsilyl terminated)、氫氧基封端之聚二甲基矽氧烷(Poly(dimethylsiloxane),hydroxy terminated)、及氫基封端之聚二甲基矽氧烷(Poly(dimethylsiloxane),hydride terminated)。該乙烯基官能化之聚二甲基矽氧烷的例子，包含但不限於：乙烯基封端之聚二甲基矽氧烷(Poly(dimethylsiloxane),vinyl terminated)、及二乙烯基封端之聚二甲基矽氧烷-共-二苯基矽氧烷(Poly(dimethylsiloxane-co-diphenylsiloxane),divinyl terminated)。該含鉑催化劑的例子，包含但不限於：六氯鉑酸、二氧化鉑、氯鉑酸鉀、二氯化鉑、及四氯化鉑。
此外，亦可使用市售用於製備可固化聚二甲基矽氧烷的套組來提供本發明之聚二甲基矽氧烷膜層。一般而言，市售可固化聚二甲基矽氧烷的套組係包含一聚二甲基矽氧烷彈性體主劑(PDMS elastomer base)與一聚二甲基矽氧烷彈性體固化劑(PDMS elastomer curing agent)。於使用該套組時，通常先以特定比例混合主劑與固化劑以得到一混合物，並視需要加熱處理所得混合物，以固化聚二甲基矽氧烷。舉例言之，於根據本發明之一具體實施態樣中，係使用市售sylgard® 184有機矽彈性體套組(購自Dow Corning公司，美國)來製備聚二甲基矽氧烷膜層，該套組內包含一二甲基矽氧烷彈性體主劑(試劑A)與一二甲基矽氧烷彈性體固化劑(試劑B)。該使用sylgard® 184有機矽彈性體套組以提供二甲基矽氧烷膜層之操作，係包含如下步驟：(1)以試劑A：試劑B之體積比為3：1至15：1之範圍混合試劑A與試劑B，較佳為試劑A：試劑B之體積比為約10：1；(2)施用所得混 合溶液至一基材之至少一表面；(3)於40℃至200℃下乾燥該基材5分鐘至120分鐘，以形成一二甲基矽氧烷膜層。
上述以sylgard® 184有機矽彈性體套組以提供二甲基矽氧烷膜層之步驟(2)的施用方法，可為任何本發明所屬技術領域中具有通常知識者所習知者，通常可包含但不限於網印(screen-printing)方法、塗佈方法或點膠方法。其中，塗佈方法包含如刮刀式塗佈(knife coating)、滾輪塗佈(roller coating)、微凹版印刷塗佈(micro gravure coating)、流塗(flow coating)、含浸塗佈(dip coating)、噴霧塗佈(spray coating)、簾塗(curtain coating)、或上述方法之組合。舉例言之，可取適量之試劑A與試劑B之混合溶液，置於一基材上，再視需要以一玻璃載玻片或滾輪將混合溶液鋪平。
於本發明之表面含有二氧化鈦之板中，該聚二甲基矽氧烷膜層的厚度可視實際應用而調整，並無特殊限制。其中，可於上述塗抹聚二甲基矽氧烷之混合溶液的程序中，調整塗佈溶液之體積與塗佈次數，以控制乾燥後之聚二甲基矽氧烷膜層的厚度。
於本發明之表面含有二氧化鈦之板中，該二甲基矽氧烷膜層之表面上係有一或多個二氧化鈦顆粒聚集體，各該聚集體係實質上由二氧化鈦顆粒所組成。參見第1a圖，顯示於根據本發明一實施態樣中，由粒徑為約5微米之二氧化鈦顆粒所形成之聚集體，以顯微鏡觀察該聚集體的照片。第1b圖顯示另一根據本發明之表面含有二氧化鈦顆粒之板之具體實施態樣，其中，二氧化鈦顆粒係呈複數個聚集體分布於二甲基矽氧烷膜層之表面，從 而使所製得之表面含有二氧化鈦之板可用以同時進行多個磷酸化胜肽樣品之純化。
於本發明之表面含有二氧化鈦之板中，二氧化鈦顆粒聚集體中之二氧化鈦顆粒之粒徑基本上並無特別限制。然而，當二氧化鈦顆粒之粒徑為奈米尺寸(如粒徑小於150奈米)時，所提供之二氧化鈦顆粒聚集體與非磷酸化胜肽之間容易產生非專一性的結合，導致純化磷酸化蛋白質的專一性降低。因此，於根據本發明之表面含有二氧化鈦之板中，二氧化鈦顆粒聚集體中之二氧化鈦顆粒，其粒徑一般為至少150奈米，較佳為0.5微米至10微米，更佳為1微米至5微米。
本發明亦提供一種製備上述於表面含有二氧化鈦之板的方法，其係包含以下步驟：(a)提供一基材；(b)於該基材之至少一表面形成一聚二甲基矽氧烷膜層；(c)將一含二氧化鈦顆粒之含水懸浮液施用於該聚二甲基矽氧烷膜層之至少部分表面上；以及(d)乾燥該二氧化鈦懸浮溶液，形成一或多個二氧化鈦顆粒聚集體於該聚二甲基矽氧烷膜層上。其中，可用於本發明方法中步驟(a)所涉之基材的種類與特性、步驟(b)所涉之聚二甲基矽氧烷膜層之製備方法、以及步驟(c)所涉之二氧化鈦顆粒的粒徑，係如上文所述。
於本發明方法之步驟(c)中，係使用一含二氧化鈦顆粒之含水懸浮液，此為本發明之關鍵所在。本案發明人意外發現，當施用二氧化鈦顆粒之含水懸浮液於疏水性之二甲基矽氧烷膜層表面並乾燥後，可將二氧化鈦顆粒固定於二甲基矽氧烷膜層表面，但若該懸浮液不含水，則無法達到所欲固定二氧化鈦的效 果。於施用該含二氧化鈦顆粒之含水懸浮液時，可採用本發明所屬技術領域中具有通常知識者所習知之方法，將懸浮液施用於聚二甲基矽氧烷膜層之至少部分表面上。舉例言之，於本發明之一具體實施態樣中，係以微量吸管重複吸取約2微升至約5微升之二氧化鈦懸浮液，滴置於聚二甲基矽氧烷膜層上，形成一或複數個各自分離的液滴，從而於乾燥後在聚二甲基矽氧烷膜層上提供一或多個由二氧化鈦顆粒構成之顆粒聚集體。
於前述二氧化鈦懸浮液施用的過程中，各二氧化鈦懸浮液之液滴的體積可視實際應用之需求而調整。一般而言，可透過施用較大體積之二氧化鈦懸浮液液滴或調高懸浮液之二氧化鈦顆粒濃度，以於乾燥後得到較大體積的二氧化鈦顆粒聚集體，於純化磷酸化胜肽時提供較高的樣品乘載容量(capacity)。
此外，於本發明方法中，可視需要於上述二氧化鈦顆粒之含水懸浮液中添加一極性低於水之有機溶劑，以降低含水懸浮液之極性，減小施用於聚二甲基矽氧烷膜層上之含水懸浮液液滴與聚二甲基矽氧烷膜層的接觸角(contact angle)，增加所形成二氧化鈦顆粒聚集體與聚二甲基矽氧烷膜層間的接觸面積。舉例言之，該極性低於水之有機溶劑可選自以下群組：乙腈、甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、丙烯腈、丙酮、乙酸乙酯、四氫呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、苯、甲苯、正己烷、正戊烷、及前述之組合。於本發明之部分具體實施態樣中，係於二氧化鈦顆粒之含水懸浮液中添加乙腈，以於聚二甲基矽氧烷膜層上提供具較大接觸面積之二氧化鈦顆粒聚集體。
於本發明方法步驟(d)中，可採用任何合宜之手段 以乾燥施用於聚二甲基矽氧烷膜層上之二氧化鈦懸浮溶液或液滴，不須特別採用高溫加熱。例如，可採用風乾、烘乾或於室溫下自然乾燥等方式。較佳係於10℃至100℃下乾燥該二氧化鈦懸浮溶液，且更佳係於20℃至80℃下乾燥。根據本發明之部分具體實施態樣，係於80℃烘箱中乾燥二氧化鈦懸浮溶液，或於室溫下自然乾燥。由於本發明之方法可經由低溫乾燥將二氧化鈦固定於聚二甲基矽氧烷膜層上，毋須採用高溫燒結等步驟，故更具經濟效益。
如上述，由於二氧化鈦可與磷酸化蛋白質上的磷酸基團結合，故本發明之表面含有二氧化鈦之板可用於純化磷酸化蛋白質之用途。因此，本發明亦提供一種使用本發明之表面含有二氧化鈦之板以純化磷酸化胜肽的方法，其係包含以下步驟：(i)使一胜肽溶液與本發明之表面含有二氧化鈦之板之二氧化鈦顆粒聚集體接觸歷時1分鐘至60分鐘；(ii)以一清洗溶液淋洗該二氧化鈦顆粒聚集體；以及(iii)使該二氧化鈦顆粒聚集體與一沖提溶液接觸歷時1分鐘至30分鐘，以沖提出經磷酸化之胜肽。
於進行上述純化磷酸化胜肽的方法之前，可視需要先以例如0.1%甲酸(formic acid，FA)溶液之合宜清洗液清洗並乾燥本發明之板之其上有二氧化鈦顆粒聚集體的表面，以去除可能存在於該板表面之雜質。
於上述步驟(i)中，該胜肽溶液可為一經水解之蛋白質樣品。舉例言之，可經由使用一蛋白質水解酶處理待純化之蛋白質樣品，以提供經水解之胜肽溶液。適用之水解酶包含但不限於胰蛋白酶(trypsin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、Glu-c 蛋白酶、Lys-C蛋白酶、Asp-N蛋白酶等。
於完成上述蛋白質水解酶處理後，較佳係先乾燥經水解之胜肽，並將所得胜肽溶於一緩衝溶液中，再使胜肽溶液與本發明之表面含有二氧化鈦之板之二氧化鈦顆粒聚集體接觸，接觸時間較佳為1分鐘至60分鐘，更佳為2分鐘至20分鐘，以使磷酸化胜肽與二氧化鈦結合。前述緩衝溶液較佳係包含選自以下群組之成分：乙腈(Acetonitrile，ACN)、三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)、以及2,5-二羥苯甲酸(2,5-dihydroxybenzoic acid，DHB)、及前述之組合。其中，2,5-二羥苯甲酸已知可降低酸性胺基酸殘基(如天門冬胺酸(Asparatic acid)及麩胺酸(Glutamic acid))與二氧化鈦之間的靜電作用力，因此可用於增強磷酸化胜肽之磷酸化基團與二氧化鈦顆粒之結合親和力，並降低非專一性結合反應。
於使胜肽溶液與二氧化鈦顆粒聚集體接觸之步驟完成後，以一清洗溶液淋洗該二氧化鈦顆粒聚集體，以去除未與二氧化鈦結合之非磷酸化胜肽，即步驟(ii)。該清洗溶液較佳係包含一有機相及一酸，其中，該有機相可例如選自乙腈、甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、丙烯腈、丙酮、乙酸乙酯、四氫呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、苯、甲苯、正己烷、正戊烷、及前述之組合；該酸可例如選自經取代或未經取代之甲酸、經取代或未經取代之乙酸、及前述之組合。根據本發明之一具體實施態樣，係以包含60重量%至90重量%之乙腈、以及1重量%至5重量%之三氟乙酸之水溶液作為該清洗溶液。
接著，於上述步驟(iii)中，使該二氧化鈦顆粒聚 集體與一沖提溶液接觸，接觸時間較佳為1分鐘至30分鐘，更佳為2分鐘至10分鐘，以沖提出磷酸化之胜肽。該沖提溶液較佳係選自以下群組：氨水溶液、銨鹽水溶液(如醋酸銨水溶液、碳酸氫銨水溶液)、甲酸水溶液、及前述之組合。於本發明之一具體實施態樣中，係使用氨水溶液作為該沖提溶液。
於完成上述步驟(iii)之沖提程序後，即可獲得經純化之磷酸化胜肽。此時，視基材之種類以及後續之應用目的，可直接以本發明之表面含有二氧化鈦之板(其上有含有沖提出之胜肽樣品的沖提液)進行分析，或收集含有所沖提出之胜肽樣品的沖提液並進行分析，此分析可為質譜儀分析、液相層析、或液相層析結合質譜儀分析，例如液相層析質譜儀(LC-MS)、液相層析串聯質譜儀(HPLC-MS/MS)、奈米級液相層析串聯式質譜儀分析(nanoLC-MS/MS)等。
於根據本發明之一具體實施態樣，所採用之表面含有二氧化鈦之板之基材為MALDI-TOF樣品盤(即，不鏽鋼基材)，故於完成步驟(ii)去除未與二氧化鈦結合之非磷酸化胜肽後，於各樣品槽(即，第1b圖所示之圓形區域內)中注入沖提溶液以進行步驟(iii)之沖提程序。其後，進行乾燥並於各樣品槽中添加適用之MALDI-TOF基質溶液，並直接進行MALDI-TOF實驗，以分析所純化之磷酸化胜肽，而毋須另行將經純化之胜肽樣品加載至MALDI-TOF樣品盤中。
根據本發明之表面含有二氧化鈦之板，其基材於使用後可透過簡易手段而再生。舉例言之，可直接以手剝除聚二甲基矽氧烷膜層，以使基材再生而供重複使用。
根據本發明之表面含有二氧化鈦之板，係可於表面具有複數個二氧化鈦顆粒聚集體，故使用於純化磷酸化胜肽時，可批次純化多個胜肽樣品。此外，如上述，使用本發明之表面含有二氧化鈦之板以純化磷酸化胜肽時，毋需進行繁複的離心步驟，故可降低樣品損耗率。因此，相較於使用傳統TiO2 Tip純化磷酸化胜肽，使用本發明之表面含有二氧化鈦之板乃具有高通量、操作簡單、低樣品損耗率、實驗再現性高、以及可簡易再生基材等優點。
茲以下列實施例進一步例示說明本發明。其中該等實施例僅提供作為說明，而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示。
實施例1：製備表面含有二氧化鈦之板
首先，混合10重量份聚二甲基矽氧烷彈性體主劑(Sylgard® 184 reagent A，購自Dow Corning公司，美國)及1重量份之聚二甲基矽氧烷彈性體固化劑(Sylgard® 184 reagent B，購自Dow Corning，美國)，形成一PDMS混和溶液。塗佈該PDMS混和溶液至一MALDI-TOF樣品盤(購自Bruker Daltonics公司，美國)表面，並視需要以一玻璃載玻片或滾輪(roller，購自Bio-Rad公司，美國)將溶液鋪平後，於80℃烘箱中烘乾60分鐘。接著，分別將10毫克之粒徑5微米之二氧化鈦顆粒(購自GL Sciences公司，日本)與10毫克粒徑小於150奈米之二氧化鈦顆粒(購自Sigma-Aldrich公司，美國)懸浮於100微升60%乙腈的水溶液中，震盪混合後，分別以微量吸管重複吸取2微升至5微升該等二氧化鈦懸浮液，滴置於該聚二甲基矽氧烷膜層上，形成一液滴(於 滴置過程中，使各液滴間隔一間距)，再於80℃烘箱中烘乾10分鐘，完成表面含有二氧化鈦之板之製備。
將所製得之表面含有二氧化鈦之板以光學掃描器掃描。掃描之影像如第1b圖所示，其中，二氧化鈦顆粒係以聚集體的形式(可參見第1a圖)固定於聚二甲基矽氧烷膜的表面而以白色圓形區域呈現於掃描影像中，每一圓形區域之直徑約2.5毫米(mm)。
實施例2：由單一蛋白質中純化磷酸化胜肽 (1)蛋白質水解
將卵白蛋白(購自Sigma-Aldrich公司，美國)溶於50毫莫耳濃度之碳酸氫銨溶液中，於90℃下加熱20分鐘。添加10毫莫耳濃度之二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)，於56℃下加熱20分鐘。添加55毫莫耳濃度之碘乙醯胺(iodoacetamide，IAA)，置於25℃下避光靜置30分鐘。接著，以酵素與受質重量比為1：50之比例添加胰蛋白酶至蛋白質溶液中，於37℃下反應12小時，以水解蛋白質。接著，以離心乾燥機乾燥水解後之胜肽。
(2)純化磷酸化胜肽
將前述胜肽樣品溶於一緩衝溶液(含80%乙腈、2%三氟乙酸、及20至200毫克/毫升2,5-二羥苯甲酸)，使用微量吸管吸取2微升之該胜肽溶液，滴置於實施例1所製備之表面含有二氧化鈦之板之二氧化鈦顆粒聚集體上，接觸約2至5分鐘後，以一清洗溶液(含80%乙腈，2%三氟乙酸)淋洗該二氧化鈦顆粒聚集體，以去除未結合之非磷酸化胜肽。接著，添加3微升至5微升0.05%氨水至該二氧化鈦顆粒聚集體上，以沖提出結合在二氧 化鈦顆粒聚集體的磷酸化胜肽。待二氧化鈦顆粒聚集體乾燥後，添加MALDI-TOF基質溶液(2毫克/毫升2,5-二羥苯甲酸溶於25%乙腈，以及1%磷酸)至二氧化鈦顆粒聚集體上，並進行MALDI-TOF分析。
(3)MALDI-TOF分析
MALDI-TOF實驗採用MALDI-TOF/TOF-MS質譜儀(Ultraflex III TOF/TOF，購自Bruker Daltonics公司，德國)，並使用一胜肽校正標準品套組(購自Bruker Daltonics公司)作為檢測分子量之標準品。質譜儀之實驗參數設定如下：反射(reflector)模式；25千伏特加速電壓；26.3千伏特反射電壓；以及20奈秒脈衝離子提取時間。
(4)實驗結果
第2圖為經水解之卵白蛋白進行MALDI-TOF分析之質譜圖，其中，第2a圖為未經純化之卵白蛋白之胜肽(作為實驗之對照組)進行MALDI-TOF分析之質譜圖，顯示未經純化之卵白蛋白之胜肽中含有多種訊號峰，其中磷酸化胜肽之訊號峰(2088.908 m/z)之訊號強度明顯低於其他非磷酸化胜肽主要訊號峰；第2b圖為經水解之卵白蛋白之胜肽經表面含有5微米之二氧化鈦顆粒之板純化後進行MALDI-TOF分析之質譜圖，其訊號峰明顯較少，且以磷酸化胜肽之訊號峰(2088.879 m/z)為主要訊號峰；第2c圖為經水解之卵白蛋白之胜肽經表面含有小於150奈米之二氧化鈦顆粒之板純化後進行MALDI-TOF分析之質譜圖，其中除了顯示磷酸化胜肽之訊號峰(2088.937 m/z)外，同時呈現其他非磷酸化胜肽之訊號峰。第2b圖及第2c中圓圈符號(即，O)所標示之訊號峰為磷酸化胜肽之訊號峰失去86道爾吞之磷酸化胜 肽片段後的訊號峰。
由第2a至2c圖之結果顯示，本發明之表面含有二氧化鈦之板可有效純化磷酸化胜肽，且相較於使用奈米尺寸之二氧化鈦顆粒，當使用粒徑為5微米之二氧化鈦顆粒時，所製得之表面含有二氧化鈦之板可更專一性地純化磷酸化胜肽。另一方面，若使用由小於150奈米之二氧化鈦顆粒所提供之表面含有二氧化鈦之板以純化磷酸化胜肽，則會產生非專一性的結合，推測此可能是由於奈米尺寸之二氧化鈦顆粒具有更多可用於結合磷酸化與非磷酸化胜肽的反應位置，因此容易導致非專一性的結合。
實施例3：由蛋白質混合物中純化磷酸化胜肽
將三種非磷酸化蛋白質(牛血清白蛋白(BSA)、肌紅蛋白、及細胞色素C蛋白質)以及三種磷酸化蛋白質(卵白蛋白、α-酪蛋白、β-酪蛋白)(皆購自Sigma-Aldrich公司，美國)分別溶於50毫莫耳濃度碳酸氫銨溶液中，形成一蛋白質混合溶液，並以實施例2所示之方式以胰蛋白酶進行蛋白質水解。接著，分別取20毫微微莫耳(fm)之上述六種經水解之蛋白質胜肽進行混合，並以實施例2所示之方式，使用實施例1所製備之表面含有二氧化鈦之板(二氧化鈦顆粒為5微米)純化經磷酸化之胜肽，並於純化後進行MALDI-TOF分析。
第3a圖為未經表面含有二氧化鈦之板純化之複雜胜肽混合溶液進行MALDI-TOF分析之質譜圖，其中非磷酸化胜肽為質譜圖中主要的訊號峰；第3b圖為經表面含有二氧化鈦之板純化之複雜胜肽混合溶液進行MALDI-TOF分析之質譜圖，以磷酸化胜肽為主要訊號峰。其中，第3b圖中各符號所代表之意義如下： ●為α-S1-酪蛋白之磷酸化胜肽之訊號峰；◆為α-S2-酪蛋白之磷酸化胜肽之訊號峰；★為β-酪蛋白之磷酸化胜肽之訊號峰；■為酪蛋白之磷酸化胜肽之訊號峰；O為磷酸化胜肽之訊號峰失去86道爾吞之磷酸化胜肽片段後的訊號峰。
下表1顯示分別以經本發明表面含有二氧化鈦之板純化之複雜胜肽混合溶液以及未經純化之複雜胜肽混合溶液進行MALDI-TOF分析，各個磷酸化胜肽之訊號峰訊號/雜訊比(S/N)(4重複之實驗的平均值)、以及磷酸化胜肽序列與磷酸化位置(序列中所示小寫字母p為磷酸化位置)。
如第3a圖、第3b圖、及表1之結果所示，經本發明之表面含有二氧化鈦之板純化之胜肽混合溶液，其磷酸化胜肽之質譜儀訊號大幅增強，且質譜圖(第3b圖)中幾乎未顯示非磷酸化之胜肽的訊號。以上結果顯示本發明之表面含有二氧化鈦之板確實可有效自多種蛋白質混合溶液中純化磷酸化胜肽。因此，可有效避免蛋白質樣品進行質譜儀分析時，其磷酸化胜肽之質譜儀訊號受到非磷酸化胜肽抑制。
實施例4：評估樣品回收率
為評估以本發明之純化方法純化磷酸化胜肽的樣品回收率(recovery)，混合20毫微微莫耳下列二磷酸化胜肽：(1)VNQIG(pT)LSESIK(SEQ ID NO：8)，1368.678 m/z；以及(2)VNQIGTL(pS)E(pS)IK(SEQ ID NO：9)，1448.644 m/z(序列中所示小寫字母p為磷酸化位置)。接著，以如實施例2所示之方式使用本發明之表面含有二氧化鈦之板(二氧化鈦顆粒之粒徑為5微米)純化前述磷酸化胜肽混合物，並以未經純化的磷酸化胜肽混合物作為對照組。接著，將經純化的胜肽樣品與一內部標準品(2毫微微莫耳血管收縮素II，1046.542 m/z)混合，並進行MALDI-TOF分析。
第4a圖為未經純化之磷酸化胜肽混合物進行MALDI-TOF分析所得之質譜圖，其中1368.68 m/z訊號峰與1046.54 m/z訊號峰之強度比為約0.55；第4b圖為經表面含有二氧化鈦之板純化之磷酸化胜肽混合物進行MALDI-TOF分析所得之質譜圖，其中1368.68 m/z訊號峰與1046.54 m/z訊號峰之強度比為約0.48(實驗結果為3重複之平均值)。以上結果顯示，以本發 明之表面含有二氧化鈦之板純化磷酸化胜肽之樣品回收率可達約87%(即，0.48/0.55×100%)，顯示本發明之純化方法具有極低樣品損耗率。
實施例5：評估樣品偵測極限
為評估本發明之純化方法相較於傳統純化方法之樣品偵測極限(detection limit)的差異，分別取不同濃度(2毫微微莫耳(fm)、5毫微微莫耳、10毫微微莫耳、20毫微微莫耳)之β-酪蛋白(即，磷酸化蛋白質)，以實施例2所示之方式以胰蛋白酶進行水解，並以表面含有二氧化鈦之板(二氧化鈦顆粒之粒徑為5微米)進行純化，再進行質譜儀分析；或者，以二氧化鈦微量吸管尖(TiO2 Tip)進行純化，再進行質譜儀分析。
以二氧化鈦微量吸管尖進行純化之操作步驟如下：首先，將懸浮於80%乙腈與0.1%三氟乙酸的二氧化鈦顆粒(TiO2 beads)裝填於一GELoader微量吸管中，並使用一塑膠注射器製造空氣壓力，以裝填TiO2 Tip至二氧化鈦之高度為2微米；接著，將經水解之β-酪蛋白裝填至TiO2 Tip中；以25微升含有80%乙腈與2%三氟乙酸的溶液清洗，並以20微升0.05% NH4OH(pH 10.5)之溶液沖提磷酸化胜肽；以水清洗管柱TiO2 Tip；再以10微升含50%乙腈及0.1%甲酸之溶液沖提磷酸化胜肽；將所沖提之溶液以離心濃縮機進行乾燥；將乾燥之樣品溶於2微升MALDI-TOF基質溶液(2毫克/毫升2,5-二羥苯甲酸溶於25%乙腈，以及1%磷酸)中，並進行MALDI-TOF分析。前述樣品裝填、清洗、以及沖提步驟皆以離心方式進行操作(二氧化鈦微量吸管尖之製備方法可參見Larsen MR et al.,Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Molecular & cellular proteomics：MCP 2005；4：873-86.)。
第5a圖所示為經胰蛋白酶水解之2毫微微莫耳之β-酪蛋白經本發明之表面含有二氧化鈦之板進行純化後並以MALDI-TOF分析之質譜圖，其磷酸化訊號峰(2061.8 m/z)之訊號/雜訊比(S/N)為14.7(4重複實驗之平均值)，顯示本發明發法可用於純化極低蛋白質濃度的樣品；第5b圖為經胰蛋白酶水解之20毫微微莫耳之β-酪蛋白經傳統TiO2 Tip純化並以MALDI-TOF分析之質譜圖，其磷酸化訊號峰(2061.8 m/z)訊號/雜訊比(S/N)為12.6(3重複實驗之平均值)。以上結果顯示，相較於使用傳統TiO2 Tip之純化方法，使用本發明之表面含有二氧化鈦之板進行純化磷酸化胜肽的方法，具有較高的偵測靈敏度。
實施例6：評估樣品乘載容量
為了評估以本發明實施例1所製備之表面含有二氧化鈦之板(每一二氧化鈦圓形區域之直徑約2.5毫米)純化磷酸化胜肽的樣品乘載容量(capacity)，分別將0.5微克、1微克、5微克、10微克、50微克、及100微克之β-酪蛋白以本發明實施例2所述之方式藉由表面含有二氧化鈦之板(二氧化鈦顆粒之粒徑為5微米)進行純化，再分別與作為內標準品之100毫微微莫耳、200毫微微莫耳、1微微莫耳、2微微莫耳、10微微莫耳、及20微微莫耳之促腎上腺皮質素(Adrenocorticotropic hormone；ACTH)胜肽片段(胺基酸序列為RPVKVYPNGAEDESAEAFPLEF(SEQ ID NO：10)；2464.2 m/z)混合，並進行MALDI-TOF分析。
如第6圖所示，當0.5微克至5微克之β-酪蛋白經本發明之表面含有二氧化鈦之板純化後，2061.8 m/z(β-酪蛋白之磷酸化訊號峰)與2465.2 m/z(內標準品)之訊號峰的訊號強度比皆為約16，顯示此蛋白質濃度仍低表面含有二氧化鈦之板的樣品乘載容量；10微克之β-酪蛋白經本發明之表面含有二氧化鈦之板純化後，2061.8 m/z(β-酪蛋白之磷酸化胜肽訊號峰)與2465.2 m/z之訊號峰的訊號強度比約略降低至約15；50微克之β-酪蛋白經本發明之表面含有二氧化鈦之板純化後，2061.8 m/z與2465.2 m/z之訊號峰的訊號強度比明顯降低至約5，100微克之β-酪蛋白經本發明之表面含有二氧化鈦之板純化後，2061.8 m/z與2465.2 m/z之訊號峰的訊號強度比明顯降低至約2。以上結果顯示，當本發明之表面含有二氧化鈦之板上每一二氧化鈦圓形區域之直徑為約2.5微米時，每一二氧化鈦圓形區域於純化β-酪蛋白之樣品乘載容量可高達約10微克。
<110> 中國醫藥大學
<120> 表面含有二氧化鈦之板及其製造方法與應用
<130> 無
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> α-S1-酪蛋白，58至73號胺基酸
<400> 1
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> α-S1-酪蛋白，58至73號胺基酸
<400> 2
<210> 3
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> α-S1-酪蛋白，74至94號胺基酸
<400> 3
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> α-S2-酪蛋白，61至85號胺基酸
<400> 4
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> β-酪蛋白，48至63號胺基酸
<400> 5
<210> 6
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> β-酪蛋白，16至40號胺基酸
<400> 6
<210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 卵白蛋白，340至359號胺基酸
<400> 7
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 磷酸化胜肽
<400> 8
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 磷酸化胜肽
<400> 9
<210> 10
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 促腎上腺皮質素胜肽片段
<400> 10

Claims (17)

  1. 一種於表面含有二氧化鈦之板，包含：(A)一基材；(B)一聚二甲基矽氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)膜層，位於該基材之至少一表面上；以及(C)一或多個二氧化鈦顆粒聚集體，位於該聚二甲基矽氧烷膜層上，其中該二氧化鈦顆粒之粒徑為0.5微米至10微米。
  2. 如請求項1之板，其中該二氧化鈦顆粒之粒徑為1微米至5微米。
  3. 如請求項1或2之板，其中該基材係選自以下群組：金屬基材、玻璃基材、聚甲基丙烯酸甲酯基材、聚碳酸酯基材、聚對苯二甲酸乙二酯基材、聚對苯二甲酸乙二酯基材、木質基材。
  4. 一種製備如請求項1之於表面含有二氧化鈦之板的方法，其係包含以下步驟：(a)提供一基材；(b)於該基材之至少一表面形成一聚二甲基矽氧烷膜層；(c)將一含二氧化鈦顆粒之含水懸浮液施用於該聚二甲基矽氧烷(PDMS)膜層之至少部分表面上；以及(d)乾燥該二氧化鈦懸浮溶液，形成一或多個二氧化鈦顆粒聚集體於該PDMS膜層上；其中該於步驟(c)之懸浮液中之二氧化鈦顆粒之粒徑為0.5 微米至10微米。
  5. 如請求項4之方法，其中於步驟(c)將該含二氧化鈦顆粒之含水懸浮液滴置於該聚二甲基矽氧烷膜層上，形成一或複數個各自分離的液滴。
  6. 如請求項4之方法，其中該二氧化鈦顆粒之粒徑為1微米至5微米。
  7. 如請求項4之方法，其中該於步驟(c)之懸浮液另包含一極性低於水之有機溶劑。
  8. 如請求項7之方法，其中該有機溶劑係選自以下群組：乙腈、甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、丙烯腈、丙酮、乙酸乙酯、四氫呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、苯、甲苯、正己烷、正戊烷、及前述之組合。
  9. 如請求項4之方法，其中係於10℃至100℃進行該步驟(d)之乾燥。
  10. 如請求項9之方法，其中係於20℃至80℃進行該步驟(d)之乾燥。
  11. 如請求項4之方法，其中該基材係選自以下群組：金屬基材、玻璃基材、聚甲基丙烯酸甲酯基材、聚碳酸酯基材、聚對苯二甲酸乙二酯基材、聚對苯二甲酸乙二酯基材、木質基材。
  12. 一種純化磷酸化胜肽的方法，其係包含以下步驟：(i)使一胜肽溶液與如請求項1至4中任一項之板之二氧化鈦顆粒聚集體接觸歷時1分鐘至60分鐘；(ii)以一清洗溶液淋洗該二氧化鈦顆粒聚集體；以及 (iii)使該二氧化鈦顆粒聚集體與一沖提溶液接觸歷時1分鐘至30分鐘，以沖提出經磷酸化之胜肽。
  13. 如請求項12方法，其中該步驟(ii)之淋洗溶液係包含一有機相及一酸。
  14. 如請求項13方法，其中該有機相係選自乙腈、甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、丙烯腈、丙酮、乙酸乙酯、四氫呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、苯、甲苯、正己烷、正戊烷、及前述之組合；該酸係選自經取代或未經取代之甲酸、經取代或未經取代之乙酸、及前述之組合。
  15. 如請求項12方法，其中該步驟(iii)之沖提溶液係選自以下群組：氨水溶液、銨鹽水溶液、甲酸水溶液、及前述之組合。
  16. 如請求項15方法，其中該步驟(iii)之沖提溶液係一氨水溶液。
  17. 如請求項12至16中任一項方法，其中該步驟(i)之接觸時間為2分鐘至20分鐘；該步驟(iii)之接觸時間為2分鐘至10分鐘。
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