CN106093169B - 一种磺酸修饰的毛细管开管柱及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种磺酸修饰的毛细管开管柱及其制备方法，属分析化学技术领域。一种磺酸修饰的毛细管开管柱，所述毛细管开管柱的管壁上键合的物质是2‑丙烯酰胺‑2‑甲基‑1‑丙磺酸。本发明通过在石英熔融毛细管内壁上修饰上磺酸基，以改变其原有的物理化学性质，相对于未修饰的毛细管具有能够有效减少一些生物活性物质在石英毛细管管壁上的吸附，使毛细管的性能更加稳定。

Description

一种磺酸修饰的毛细管开管柱及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种毛细管柱及其制备方法，具体涉及一种磺酸修饰的毛细管开管柱的制备方法，属于分析化学领域。
背景技术
毛细管电泳自首次报道以来，已经发展成为分析生物活性肽及氨基酸类物质的重要工具。与一些传统的分析技术(气相色谱或高效液相色谱)相比具有分离效率高，分析时间短，样品需求量少等优点。这些优点对分析生物样品来说至关重要，其一，生物样品所在的基质非常复杂，干扰较为严重，对它们的分离需要一种高效的分离技术。其二，生物样品的获得非常难，样品量很少，这和毛细管电泳技术本身的特点相吻合。其三，很多生物活性物质在高温下容易变性，使得这些物质用气相色谱或气相色谱-质谱分析相当困难。
在分离生物活性肽或氨基酸等生物活性物质时，被分析物与熔融石英毛细管管壁的相互作用会导致分离效率降低，迁移时间延长，严重时会致使被分析物完全吸附到石英毛细管的管壁上，使得毛细管失去分离能力。在过去的几年时间里，人们相继发展了一些方法用来减小或消除被分析物与管壁的相互作用，改变电渗流的大小以获得快速分离的效果，或者用于提高系统的重现性。这些方法包括采用极端pH值，较高离子强度的缓冲溶液，添加铵盐及两性物质，或采用涂层毛细管。在毛细管电泳系统中，采用极端pH条件下分离肽及氨基酸等生物活性物质，由于较低pH值的缓冲溶液产生的电渗流非常小，使得被分析物的迁移时间很长，导致较长的分离时间。采用高浓度的缓冲溶液或者添加非挥发性的电解质，会产生较大的焦耳热导致系统电流的不稳定。因此，涂层毛细管通常被认为是解决上述问题的一种最佳方式。
涂层毛细管根据制备涂层的方法不同，可大致分为三种类型，即动态吸附、物理涂布和化学键合。动态吸附涂层技术是在毛细管电泳缓冲溶液中加入少量预涂布的物质，并让缓冲液与毛细管充分平衡。该方法的优点是，涂层被缓冲液中的涂布试剂连续更新，缺点是涂布试剂可能影响样品和缓冲溶液性质。物理涂布技术制备的基本过程包括对毛细管管壁的预处理、涂布、后处理等过程，适合涂布吸附性强，粘度大的试剂。化学涂层技术是采用化学修饰的方法制备涂层的一种技术，其核心是利用熔融石英毛细管内表面的硅羟基的化学性质，使之与涂层材料分子化合成键。化学涂层方法制备的毛细管涂层具有性能稳定、有效时间长等优点。
综上所述，如何提高毛细管的性能稳定性以及延长其有效时间是亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种磺酸修饰的毛细管开管柱的制备方法，该方法制备的毛细管涂层具有性能稳定、有效时间长等优点，适用于分析一些生物活性小分子化合物。
本发明提供一种磺酸修饰的毛细管开管柱，所述毛细管开管柱的管壁上键合的物质是2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸。
本发明提供一种磺酸修饰的毛细管开管柱的制备方法，包括如下步骤：
(1)对熔融石英毛细管进行预处理
(2)对预处理过的毛细管进行硅烷化反应
(3)对硅烷化反应后的毛细管进行磺酸化反应
将偶氮二异丁腈和2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸溶解到甲醇中，所述偶氮二异丁腈、2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸和甲醇的质量比为1∶2-4∶316.7，超声处理，然后注入到硅烷化处理过的毛细管中，两端封口，在70-90℃条件下反应11-13h，然后冲洗，得到所述磺酸修饰的毛细管开管柱。
进一步地，所述步骤(1)对毛细管进行预处理的过程为：熔融石英毛细管依次用去离子水、盐酸溶液、去离子水、氢氧化钠溶液、丙酮冲洗，然后经氮气吹干。
进一步地，所述步骤(2)对预处理过的毛细管进行硅烷化反应的过程为：将3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷与等体积的甲醇混合均匀，然后注射到预处理过的毛细管中，两端封口反应，去掉封口，用甲醇冲洗毛细管，然后进行干燥，得到硅烷化反应后的毛细管。
进一步地，所述步骤(3)中将偶氮二异丁腈和2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸溶解到甲醇中，所述偶氮二异丁腈、2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸和甲醇的质量比为1∶3∶316.7，超声处理20min，然后注入到硅烷化处理过的毛细管中，两端封口，在80℃条件下反应12h，然后分别用甲醇和水冲洗，得到所述磺酸修饰的毛细管开管柱。
本发明通过在石英熔融毛细管内壁上修饰上磺酸基，以改变其原有的物理化学性质，相对于未修饰的毛细管具有能够有效减少一些生物活性物质在石英毛细管管壁上的吸附，使毛细管的性能更加稳定。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为一种磺酸修饰的毛细管开管柱制备示意图；
图2为未修饰的熔融石英毛细管的扫描电镜图；
图3为磺酸修饰的熔融石英毛细管的扫描电镜图；
图4为未修饰的熔融石英毛细管和制备的磺酸修饰的熔融石英毛细管的电渗流表征图；
图5为未修饰的熔融石英毛细管和制备的磺酸修饰的熔融石英毛细管分离4种生物活性肽对比谱图；
图6为未修饰的熔融石英毛细管和制备的磺酸修饰的熔融石英毛细管分离3种氨基酸对比谱图。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限定。
实施例1：磺酸修饰的毛细管开管柱的制备方法，包括如下步骤：
(1)对毛细管进行预处理
1)去离子水冲洗0.5h；
2)2mol/L盐酸溶液冲洗0.5h；
3)去离子水冲洗0.5h；
4)2mol/L氢氧化钠溶液冲洗0.5h；
5)丙酮冲洗0.5h；
6)将经上述处理后的毛细管接到气相色谱上，将柱温箱温度设置为200℃，通高纯N2条件下热处理1小时备用；
预处理步骤使石英毛细管管壁裸露硅羟基的数目增多，提高了毛细管涂层的重现性。
(2)对预处理过的毛细管进行硅烷化反应
将3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷与等体积的甲醇混合均匀，然后注射到预处理过的毛细管中，两端封口，在80℃下反应12h，去掉封口，用甲醇冲洗毛细管，以洗掉没有反应的残留溶剂，然后在80℃条件下用N2进行吹风干燥，得到硅烷化反应后的毛细管；
(3)对硅烷化反应后的毛细管进行磺酸化反应
将10.0mg的偶氮二异丁腈和20.0mg的2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸溶解到4.00mL的甲醇溶液中，超声处理20min，然后注入到硅烷化处理过的毛细管中，两端封口，在70℃条件下反应13h，然后分别用甲醇和水冲洗毛细管以除掉未反应的物质。
实施例2：磺酸修饰的毛细管开管柱的制备方法，包括如下步骤：
(1)对熔融石英毛细管进行预处理
1)去离子水冲洗1h；
2)2mol/L盐酸冲洗1h；
3)去离子水冲洗1h；
4)2mol/L氢氧化钠冲洗1h；
5)丙酮冲洗1h；
6)将经上述处理后的毛细管接到气相色谱上，将柱温箱温度设置为200℃，通高纯N2条件下热处理1小时备用；
(2)对预处理过的毛细管进行硅烷化反应将3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷与等体积的甲醇混合均匀，然后注射到预处理过的毛细管中，两端封口，在80℃下反应12h，去掉封口，用甲醇冲洗毛细管，以洗掉没有反应的残留溶剂，然后在80℃条件下用N2进行吹风干燥，得到硅烷化反应后的毛细管；
(3)对硅烷化反应后的毛细管进行磺酸化反应
将10.0mg的偶氮二异丁腈和30.0mg的2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸溶解到4.00mL的甲醇溶液中，超声处理20min，然后注入到硅烷化处理过的毛细管中，两端封口，在80℃条件下反应12h，然后分别用甲醇和水冲洗毛细管以除掉未反应的物质。
2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸被原位嫁接技术键合到石英毛细管的管壁上，减少生物活性物质在石英毛细管管壁上的吸附，能够快快速分离一些生物活性物质，缩短系统的分析时间和提高系统重现性，达到在较低pH值条件下能够获得较强的电渗流的目的。
图1为本发明的磺酸修饰的毛细管开管柱制备示意图。图2为未修饰的熔融石英毛细管放大5000倍后的SEM图，可以观察到熔融石英毛细管的内表面光滑。图3为化学修饰后的涂层毛细管在放大5000倍数条件下的SEM图，观察到修饰过的毛细管管壁上出现薄层，这个薄层即为通过原位嫁接反应制备的高聚物，通过化学键和毛细管管壁结合成一个整体。图4中A线为未修饰的熔融石英毛细管EOF随pH值变化的折线图，A线为磺酸修饰的涂层毛细管EOF随pH值变化的折线图。从图4可知，磺酸修饰的涂层毛细管在pH 3.0到9.0范围内能够提供稳定的较强的电渗流，EOF的大小几乎不受支持电解质pH的影响。
为了验证采用以上技术方案制备的磺酸修饰的毛细管开管柱的有益效果，下面对磺酸修饰的毛细管开管柱在分离生物活性肽和分离氨基酸两个方面进行如下研究。
1、磺酸修饰的毛细管开管柱分离生物活性肽
毛细管电泳作为一种新型高效的分离工具，近年来被广泛应用于复杂生物样品如活性肽和氨基酸的分离，然而，熔融石英毛细管管壁的硅羟基与活性肽的相互作用会引起活性肽等生物大分子样品吸附到毛细管管壁表面，导致毛细管的电渗流不稳定，迁移时间的重现性变差，产生严重的峰拖尾现象，严重时会丧失分离效率。通常采用在极端pH值条件下操作(如pH小于3.0，硅羟基电离度很小)，减小活性肽的在石英毛细管管壁上的吸附。在较低的pH条件下，由于熔融石英毛细管产生的电渗流很小，会导致分析时间很长。
分别研究了4种生物活性肽(D-Ala-D-Ala、Gly-Gly-L-Leu、Gly-D-Phe和L-Leu-D-Leu)在熔融石英毛细管和涂层毛细管上的分离行为。在较高pH值条件下，4种生物活性肽在熔融石英毛细管上无法实现分离，吸附现象较为严重，因此选择在较低pH值(3.0)条件下进行。4种活性肽在熔融石英毛细管上分离的谱图见图5，从图5中可以得出在pH3.0的条件下，4种活性肽在熔融石英毛细管上的分离时间为20min。在相同实验条件下，考察了4种活性肽在涂层毛细管上的分离情况。从图5可以看出，4种生物活性肽通过制备的涂层毛细管在5.6min内得到完全的基线分离，且色谱峰具有良好的对称性，没有前展峰和拖尾峰出现。4种生物活性肽在涂层毛细管中的分析时间相对于熔融石英毛细管节省了大约14min，且制备的新型涂层毛细管能够提供良好的峰型。
2、磺酸修饰的毛细管开管柱分离氨基酸
分别考察了3种氨基酸(glycine、glutamic acid和phenylalanine)在熔融石英毛细管和涂层毛细管上的分离行为。由于氨基酸在较高pH条件下在石英毛细管管壁上有较强的吸附作用，导致此3种氨基酸不能基线分离，且伴有严重的峰拖尾现象。因此，在pH为3.0的情况下，分别研究了3种氨基酸在熔融石英毛细管和涂层毛细管上的分离行为。
首先对3种氨基酸在熔融石英毛细管上的分离情况进行了研究。在pH为3.0条件下，3种氨基酸的分析时间超过了26min，且glycine的色谱峰(峰1)存在着严重的不对称(见图6)。在同样条件下，又考察了3种氨基酸在涂层毛细管上的分离情况，实验表明，3种氨基酸在6.0min内实现了基线分离，且三个色谱峰均具有良好的对称性(见图6)。对比3种氨基酸在熔融石英毛细管和涂层毛细管上的分离行为可知，3种氨基酸在涂层毛细管上能够实现快速分离，且具有良好的分析重现性和色谱峰对称性，分析时间较熔融石英毛细管节省了约20min。
对涂层毛细管稳定性的研究结果表明，在通常的实验条件下，经过1000次大约3个月的分析，涂层毛细管的分离效率没有明显的变化，这可归因于采用的原位嫁接技术制备的毛细管涂层有良好的稳定性。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (4)

1.一种磺酸修饰的毛细管开管柱的制备方法，其特征在于，所述毛细管开管柱的管壁上键合的物质是2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸，所述磺酸修饰的毛细管开管柱的制备方法包括如下步骤：
(1)对毛细管进行预处理
(2)对预处理过的毛细管进行硅烷化反应
(3)对硅烷化反应后的毛细管进行磺酸化反应
将偶氮二异丁腈和2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸溶解到甲醇中，所述偶氮二异丁腈、2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸和甲醇的质量比为1∶2-4∶316.7，超声处理，然后注入到硅烷化处理过的毛细管中，两端封口，在70-90℃条件下反应11-13h，然后冲洗，得到所述磺酸修饰的毛细管开管柱。
2.如权利要求1所述的磺酸修饰的毛细管开管柱的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)对毛细管进行预处理的过程为：熔融石英毛细管依次用去离子水、盐酸溶液、去离子水、氢氧化钠溶液、丙酮冲洗，然后经氮气吹干。
3.如权利要求1所述的磺酸修饰的毛细管开管柱的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)对预处理过的毛细管进行硅烷化反应的过程为：将3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷与等体积的甲醇混合均匀，然后注射到预处理过的毛细管中，两端封口反应，去掉封口，用甲醇冲洗毛细管，然后进行干燥，得到硅烷化反应后的毛细管。
4.如权利要求1所述的磺酸修饰的毛细管开管柱的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中将偶氮二异丁腈和2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸溶解到甲醇中，所述偶氮二异丁腈、2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸和甲醇的质量比为1∶3∶316.7，超声处理20min，然后注入到硅烷化处理过的毛细管中，两端封口，在80℃条件下反应12h，然后分别用甲醇和水冲洗，得到所述磺酸修饰的毛细管开管柱。
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