CN105880204A - 针对细胞分析仪用含金基质检测板的快速清洗方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及针对细胞分析仪用含金基质检测板的快速清洗方法，包括：去除原有液体并以去离子水洗涤；加入胰酶溶液进行消化；进行进一步清洗；无水乙醇洗涤，干燥，灭菌，备用。本发明可对细胞分析仪用含金基质检测板进行快速清洗，在保持实验结果稳定的前提下，使之能重复利用，从而降低检测成本，具有良好的市场应用前景。同时，本发明同样适用于普通细胞培养板的清洗，以降低实验成本。

Description

针对细胞分析仪用含金基质检测板的快速清洗方法
技术领域
本发明涉及针对细胞分析仪用含金基质检测板的快速清洗方法，属于分子生物学耗材清洗领域。
背景技术
近年来，无损、实时、连续的新型细胞芯片分析技术发展日渐成熟，也逐步被推广应用到各个实验室中。大部分细胞微型芯片都采用基于金基质的电化学阻抗技术，例如艾森生物（ACEA Biosciences）公司研发的细胞实时检测分析系统。这类细胞分析仪能够实时检测细胞的生长、增殖、毒性、粘附及形态变化等动态生物学反应过程，可应用于基础应用科学和新药研发的多个领域。但是，其核心检测模块采用纯度较高的金基底材料耗材，且只能单次使用，例如，细胞分析系统使用的检测模块一盒包括6块板，每块板有16个检测微芯片（Plate16），市场价格超过2000元，这直接造成检测成本居高不下。
经检索发现，以申请号200910106775.6、申请公布号CN101869894A、名称《清洗装置、清洗系统、清洗方法及粒子分析仪》的中国发明专利申请，以及申请号201310298448.1、申请公布号CN104289466A、名称为《细胞分析仪及其清洗系统》的中国发明专利申请为代表的现有技术中，尚未出现专门针对细胞分析仪用含金基质检测板的清洗技术手段，亟待研发。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的问题，提出一种针对细胞分析仪用含金基质检测板的快速清洗方法，能使该检测板重复使用，从而降低检测成本。
本发明的技术方案如下：
一种针对细胞分析仪用含金基质检测板的快速清洗方法，其特征是，包括以下步骤：
第一步、采用已用于检测的细胞分析仪用含金基质检测板；去除检测板各孔内原有液体，以去离子水将各孔分别洗涤至少2次；
第二步、向检测板各孔内分别加入预定量的胰酶溶液，并放置预定时间；
第三步、若检测时向检测板孔内加入了不溶性材料则转至S1，否则转至S4；
S1. 先以密封件将检测板各孔的孔口密封，再将检测板孔口朝下放入离心机内进行离心；之后，除去密封件并去除检测板各孔内的液体；
S2. 向检测板各孔内分别加入去离子水，并在执行S1后转至S3；
S3. 判断S2的执行次数是否达到预定次数，若否则转至S2，若是则转至第四步；所述预定次数大于或等于2；
S4. 去除检测板各孔内的液体，以去离子水将各孔分别洗涤至少3次；转至第四步；
第四步、以无水乙醇将检测板各孔分别洗涤至少2次；干燥检测板；灭菌后备用。
采用该方法对使用过的检测板进行清洗，不仅不会破坏检测板孔底的金阵列，从而保证信号响应的稳定，还能将检测板孔内的贴壁细胞以及实验过程中带入的药物等物质彻底清洗去除，从而实现细胞分析仪用含金基质检测板的重复利用。
为进一步提高清洗效果，以保证实验结果的稳定性：
优选地，第四步还包括：在无水乙醇洗涤之前，向检测板各孔内分别加入无水乙醇，并放置预定时间；接着，先以密封件将检测板各孔的孔口密封，再将检测板孔口朝下放入离心机内进行离心；之后，除去密封件并去除检测板各孔内的液体。
优选地，第四步中，所述预定时间为至少10分钟；在加入无水乙醇并放置预定时间之后，每孔反复吹打至少10次；离心条件为：转速为500-1000rpm，离心时间为1-5分钟。
优选地，第一步、第三步S1、第三步S4以及第四步中，去除检测板各孔内液体时采用的方式为：在水池中甩动检测板，使孔内液体被甩出；或者，以移液器吸除孔内液体。
本发明进一步完善的技术方案如下：
优选地，第二步中，所述预定量为至少200μl，所述预定时间为至少30分钟；加入胰酶溶液并放置预定时间之后，每孔反复吹打至少5次。
优选地，第三步中，所述不溶性材料包括介孔材料；第三步S1中，离心条件为：转速为500-1000rpm，离心时间为1-5分钟；第三步S2中，加入去离子水后每孔反复吹打若干次；第三步S4中，每次洗涤时，加入去离子水后每孔反复吹打至少10次。
优选地，第四步中，干燥方式为晾干或在60℃以下烘干；灭菌方式为紫外照射灭菌至少1小时。
优选地，第二步中，胰酶溶液的质量浓度为0.25%；第三步中，所述密封件为封口膜。
优选地，在整个方法中，当用到移液器时，移液器下端与检测板各孔底部始终保持距离；检测板两端的电极始终保持干燥。这样可避免划伤板底，避免检测板两端的电极因短路而无法与仪器连接、影响使用。
此外，本发明上述方法还可将清洗对象替换为细胞培养板，包括96孔板、24孔板、12孔板、6孔板。
本发明可对细胞分析仪用含金基质检测板（如金基质微型细胞电化学检测模块E-plate 16/96）进行快速清洗，在保持实验结果稳定的前提下，使之能重复利用，从而降低检测成本，具有良好的市场应用前景。同时，本发明同样适用于普通细胞培养板的清洗，以降低实验成本。
附图说明
图1为本发明具体实施方式中试验案例所用清洗方法的具体步骤。
图2为本发明具体实施方式中试验案例第5步所得细胞生长曲线；其中，a为A549细胞的空白对照组；b为DOX作用组；c为介孔材料作用组；d为介孔材料复合DOX作用组。
图3为本发明具体实施方式中试验案例第7步和第8步所得细胞生长曲线；其中，A为新的E-Plate16各5孔第一次/第二次接种细胞的曲线；B为第2次/第3次接种细胞的曲线；C为第三次/第四次接种细胞的曲线；D为做过一次细胞毒性实验的E-Plate16清洗一次后的细胞生长曲线；E为清洗第3次后细胞生长曲线；F为清洗第4次后细胞生长曲线。
图4为本发明具体实施方式中试验案例的孔底拍摄图片；其中，A为未使用的E-Plate16；B为接种了细胞的E-Plate16（10倍物镜）；C为接种了细胞的E-Plate16（50倍物镜）；D为清洗后的E-Plate16。
图5为本发明具体实施方式中试验案例的金电极阻抗曲线；其中，a为裸金电极的阻抗曲线；b为悬滴细胞后的金电极阻抗曲线；c为被清洗后的金电极阻抗曲线。
具体实施方式
下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。
本发明在具体实施时所用针对细胞分析仪用含金基质检测板的快速清洗方法，包括：
第一步、采用已用于检测的细胞分析仪用含金基质检测板；去除检测板各孔内原有液体，以去离子水将各孔分别洗涤至少2次。
第二步、向检测板各孔内分别加入预定量的胰酶溶液，并放置预定时间；
其中，所述预定量为至少200μl，所述预定时间为至少30分钟；加入胰酶溶液并放置预定时间之后，每孔反复吹打至少5次。胰酶溶液的质量浓度为0.25%。
第三步、若检测时向检测板孔内加入了不溶性材料则转至S1，否则转至S4；所述不溶性材料包括介孔材料；
S1. 先以密封件将检测板各孔的孔口密封，再将检测板孔口朝下放入离心机内进行离心；之后，除去密封件并去除检测板各孔内的液体；
其中，离心条件为：转速为500-1000rpm，离心时间为1-5分钟；密封件为封口膜；
S2. 向检测板各孔内分别加入去离子水，并在执行S1后转至S3；其中，加入去离子水后每孔反复吹打若干次；
S3. 判断S2的执行次数是否达到预定次数，若否则转至S2，若是则转至第四步；所述预定次数大于或等于2；
S4. 去除检测板各孔内的液体，以去离子水将各孔分别洗涤至少3次；转至第四步；其中，每次洗涤时，加入去离子水后每孔反复吹打至少10次。
第四步、向检测板各孔内分别加入无水乙醇，并放置预定时间；接着，先以密封件将检测板各孔的孔口密封，再将检测板孔口朝下放入离心机内进行离心；之后，除去密封件并去除检测板各孔内的液体；以无水乙醇将检测板各孔分别洗涤至少2次；干燥检测板；灭菌后备用；
其中，所述预定时间为至少10分钟；在加入无水乙醇并放置预定时间之后，每孔反复吹打至少10次；离心条件为：转速为500-1000rpm，离心时间为1-5分钟。干燥方式为晾干或在60℃以下烘干；灭菌方式为紫外照射灭菌至少1小时。密封件为封口膜。
在整个方法中，当用到移液器时，移液器下端与检测板各孔底部始终保持距离；检测板两端的电极始终保持干燥。
此外，上述各步中，去除检测板各孔内液体时采用的方式为：在水池中甩动检测板，使孔内液体被甩出；或者，以移液器吸除孔内液体。反复吹打时采用移液器。
试验案例
本案例概要：采用细胞分析仪检测介孔材料装载药物对细胞的毒性试验，然后按图1所示具体清洗方法对使用过的检测板进行清洗，监测细胞生长曲线，验证本发明清洗方法的可行性。
本案例具体内容如下：
本案例采用艾森生物（ACEA Biosciences）公司的RTCA S16实时细胞功能分析仪，该仪器主要包括实时细胞分析仪（RTCA S16 Analyzer）、实时细胞分析仪控制元件（RTCA Control Unit）、E-plate 检测板（E-Plate16）三个部件。
实验所用细胞A549细胞购于ATCC。实验室合成介孔材料并装载了盐酸阿霉素（DOX）。
具体试验步骤：
第1步. 分析仪经紫外照射灭菌后放入CO2培养箱，连接好仪器，设置好仪器参数（细胞毒性试验），E-Plate16每孔加入50μl培养液铺满孔底，将E-Plate16放入仪器，系统自动检查连接情况及基线校正。
第2步. 将细胞培养皿的细胞消化下来，稀释一定倍数，制成细胞悬液，5000~10000个细胞/100μl。
第3步. 暂停程序，取出仪器中的E-Plate16，加入100μl混合均匀的细胞悬液，并置于超净台中室温放置30min。
第4步. 将E-Plate 16置于培养箱中的分析仪内，点击继续。
第5步. 将装载DOX的介孔材料于超净台中用培养液配制成不同浓度的混合液，混匀器振荡，使其分散均匀；仪器监测细胞24h后，状态良好，暂停，取出E-Plate16，于超净台中将原有液体小心吸出，每孔加入200μl上述配制的混合液，将E-Plate16放回分析仪，继续监测。所得细胞生长曲线如图2所示。
第6步. 实验结束后，取出E-Plate16，倒出培养液后，按图1所示清洗方法进行清洗（由于加入的介孔材料属于不溶性材料，所以在图1分支处选择左侧流程），晾干后于超净台中紫外照射1.5h。
第7步. 将该E-Plate16按上述第1步至第4步进行操作，接种细胞，监测其生长状况（未加药），得到图3D。
之后，按图1所示清洗方法清洗两次（由于未加入不溶性材料，所以在图1分支处选择右侧流程），使该E-Plate16共被清洗3次，然后接种细胞，监测其生长状况（未加药），得到图3E。
再之后，按图1所示清洗方法清洗一次（在图1分支处选择右侧流程），使该E-Plate16共被清洗4次，然后接种细胞，监测其生长状况（未加药），得到图3F。
第8步. 采用一块新的E-Plate16，选取5个孔单纯接种细胞，然后按图1所示清洗方法仅对使用过的5个孔清洗一次（在图1分支处选择右侧流程），再选取未使用过的5个孔和清洗过一次的5个孔同时接种细胞，得到图3A；
之后，按图1所示清洗方法对上述10个孔清洗两次（在图1分支处选择右侧流程），使该E-Plate16中有5个孔共被清洗2次，还有5个孔共被清洗3次，然后向这10个孔同时接种细胞，得到的图3B；
再之后，按图1所示清洗方法对上述10个孔清洗一次（在图1分支处选择右侧流程），使该E-Plate16中有5个孔共被清洗3次，还有5个孔共被清洗4次，然后向这10个孔同时接种细胞，得到的图3C。
结果显示：图3A、3B、3D中，信号稳定，同一次实验中，每孔之间细胞的生长趋势相同（每批次实验之间接种的细胞数不同，有多有少，所以细胞指数值不同）。
图3A表明，清洗一次后和未清洗的孔，若尽可能保持加入每孔的细胞数目相同，则细胞指数值越相近。
如图3E所示，在清洗三次后，会出现个别孔的信号不稳定。如图3C、3F所示，清洗四次后，每个孔的差异性增大，信号的平行性差，甚至极度不稳定。
以上结果表明，以本发明清洗方法清洗E-Plate16一到两次时，E-Plate16的信号响应保持稳定，能够满足实验要求。
由此可知，利用本发明清洗方法，可使E-Plate16/96（同理）在不影响实验的前提下，可重复利用2次以上，预计可减少E-Plate16成本约200元/块，E-Plate96约400元/块。
在进行上述试验步骤的同时，利用Thermo Fisher DXR Raman Microscope (Madison, USA)对接种细胞前后以及清洗以后的E-Plate16的孔底部进行图片采集得到图4，拍摄时使用10X目镜，10X和50X物镜。图3A为全新的E-Plate16孔底面，图3B/3C为接种细胞的E-Plate16孔底面，图3D为接种细胞后按清洗方法清洗后的E-Plate16孔底部。可以看出，用该清洗方法可以将孔内清洗干净，且孔底表面无可见变化。
此外，使用金电极模拟E-Plate16每个孔底部的微阵列金电极，进行电化学阻抗的测试（CHI660D, China）。具体过程如下：
1. 打磨金电极，在0.5M H2SO4中活化至达到测试标准，测定裸金电极的阻抗，得图5a；
2. 将配置好的细胞悬液悬滴于金电极表面，晾至微干，进行电化学阻抗测试得到图5b。
3. 将金电极按图1所示清洗方法清洗一次（在图1分支处选择右侧流程）后，再进行电化学阻抗测试，得到图5c。
由电化学阻抗谱可以看出，该洗涤方法能够将金电极表面的细胞等物质清洗干净。
由上述试验案例的验证结果可知，本发明清洗方法能够简单有效地对细胞实验中的E-Plate16/96及金表面进行清洗，在保持实验稳定的基础上大大降低实验成本。此外，对于在MTT法等细胞实验中用到的普通的96孔板、24孔板、12孔板、6孔板，也可以用该方法清洗，实现重复利用。本发明可降低科研成本，可广泛应用于使金基质细胞微型芯片可重复使用，对资源环境的保护和再利用方面具有重要意义。

Claims (10)

1.一种针对细胞分析仪用含金基质检测板的快速清洗方法，其特征是，包括以下步骤：
第一步、采用已用于检测的细胞分析仪用含金基质检测板；去除检测板各孔内原有液体，以去离子水将各孔分别洗涤至少2次；
第二步、向检测板各孔内分别加入预定量的胰酶溶液，并放置预定时间；
第三步、若检测时向检测板孔内加入了不溶性材料则转至S1，否则转至S4；
S1. 先以密封件将检测板各孔的孔口密封，再将检测板孔口朝下放入离心机内进行离心；之后，除去密封件并去除检测板各孔内的液体；
S2. 向检测板各孔内分别加入去离子水，并在执行S1后转至S3；
S3. 判断S2的执行次数是否达到预定次数，若否则转至S2，若是则转至第四步；所述预定次数大于或等于2；
S4. 去除检测板各孔内的液体，以去离子水将各孔分别洗涤至少3次；转至第四步；
第四步、以无水乙醇将检测板各孔分别洗涤至少2次；干燥检测板；灭菌后备用。
2.根据权利要求1所述的快速清洗方法，其特征是，第四步还包括：在无水乙醇洗涤之前，向检测板各孔内分别加入无水乙醇，并放置预定时间；接着，先以密封件将检测板各孔的孔口密封，再将检测板孔口朝下放入离心机内进行离心；之后，除去密封件并去除检测板各孔内的液体。
3.根据权利要求2所述的快速清洗方法，其特征是，第四步中，所述预定时间为至少10分钟；在加入无水乙醇并放置预定时间之后，每孔反复吹打至少10次；离心条件为：转速为500-1000rpm，离心时间为1-5分钟。
4.根据权利要求2所述的快速清洗方法，其特征是，第一步、第三步S1、第三步S4以及第四步中，去除检测板各孔内液体时采用的方式为：在水池中甩动检测板，使孔内液体被甩出；或者，以移液器吸除孔内液体。
5.根据权利要求1所述的快速清洗方法，其特征是，第二步中，所述预定量为至少200μl，所述预定时间为至少30分钟；加入胰酶溶液并放置预定时间之后，每孔反复吹打至少5次。
6.根据权利要求1所述的快速清洗方法，其特征是，第三步中，所述不溶性材料包括介孔材料；第三步S1中，离心条件为：转速为500-1000rpm，离心时间为1-5分钟；第三步S2中，加入去离子水后每孔反复吹打若干次；第三步S4中，每次洗涤时，加入去离子水后每孔反复吹打至少10次。
7.根据权利要求1所述的快速清洗方法，其特征是，第四步中，干燥方式为晾干或在60℃以下烘干；灭菌方式为紫外照射灭菌至少1小时。
8.根据权利要求1所述的快速清洗方法，其特征是，第二步中，胰酶溶液的质量浓度为0.25%；第三步中，所述密封件为封口膜。
9.根据权利要求1所述的快速清洗方法，其特征是，在整个方法中，当用到移液器时，移液器下端与检测板各孔底部始终保持距离；检测板两端的电极始终保持干燥。
10.根据权利要求1至9任一项所述的快速清洗方法，其特征是，将清洗对象由细胞分析仪用含金基质检测板替换为细胞培养板，所述细胞培养板包括96孔板、24孔板、12孔板、6孔板。
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