CN107064265A - 一种MPBA修饰的用于HbA1c检测的电化学生物传感器及其制备与应用 - Google Patents

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曾冬冬
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Abstract

本发明属于生物医学检测领域，具体涉及一种MPBA修饰的用于HbA1c检测的电化学生物传感器及其制备与应用。所述电化学生物传感器，包括工作电极，所示工作电极包括基底电极和捕获分子，所述基底电极为丝网印刷碳电极，所述捕获分子为4‑巯基苯硼酸。所述电化学生物传感器简便、易操作，不需要特殊标记的报告基团输出信号，利用自身催化性质即可产生响应。

Description

一种MPBA修饰的用于HbA1c检测的电化学生物传感器及其制 备与应用
技术领域
本发明属于生物医学检测领域，具体涉及一种MPBA修饰的用于HbA1c检测的电化学生物传感器及其制备与应用。
背景技术
随着经济高速发展和工业化的进程，生活方式发生改变和老龄化进程的加速，使我国糖尿病的患病率正呈快速上升的趋势，成为继心脑血管疾病、肿瘤之后另一个严重危害人民健康的重要慢性非传染性疾病。糖尿病的危害如此之大，如何早期诊断并治疗糖尿病显得极其重要。糖化血红蛋白是血液中血红蛋白A组分的某些特殊部位与葡萄糖分子在红细胞内发生缓慢、不可逆的非酶促反应形成的复合物。HbA1c作为糖化血红蛋白(Glycosylated hemoglobin，GHb)的一种亚型，是最具特征的成分，占据了其组分中的极大部分。其合成贯穿于红细胞平均寿命(120天左右)的全过程，在红细胞死亡前，HbA1c的含量保持相对稳定，在红细胞平均寿命一半时段中所测得的平均血糖值与HbA1c最吻合。HbA1c合成过程不受血糖浓度暂时波动的影响，稳定性较好，具有独特的诊断意义。
目前实验室检测HbA1c主要采用的是免疫法和高效液相色谱层析法。由于免疫法(乳胶凝集抑制法或免疫比浊法)的抗体只能识别血红蛋白B链N端前4～10个糖化氨基酸，而不能识别可逆的Schiff碱及发生化学反应后的衍生物，从而造成结果偏低，因此随着高效液相色谱层析法检测速度的提高，越来越多的国内大、中型医院采用高效液相色谱层析法检测HbA1c。在快速高效的阳离子色谱柱发明以前，离子交换色谱法由于其检测糖化血红蛋白的操作复杂，耗时长，临床上难以广泛应用。早期固定相中应用最广泛的有机聚合物是纤维素或葡聚糖，它们含有羧甲基基团、容量高且亲水性好，但其机械强度差，不能忍受高压，检测糖化血红蛋白耗时长；为了提高检测速度，人们发明了表面键合聚天冬氨酸硅胶固定相，该固定相容量高，在低压下快速分离糖化血红蛋白，使糖化血红蛋白的检测时间大大缩短，但硅胶表面活性基团数量有限，不能进一步提高改性硅胶的柱容量；且硅胶在一定程度上可使蛋白质变性，在碱性条件下易溶解，因此固定相的应用受到了限制。
从经济角度来看，使用HPLC检测收费为65元，使用免疫比浊法检测为25元。根据对糖尿病患者的血糖最佳监控要求，患者需要每3个月做一次HbA1c检测，检测费用给国家和患者带来经济负担。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种MPBA修饰的用于HbA1c检测的电化学生物传感器及其制备与应用，能够极大的降低检测成本，更有利于发展为具有临床使用的检测方法和产品，实现对糖尿病有效糖类标志物HbA1c进行检测，以进行低成本、快速检测，并得到稳定、具有应用价值的诊断标准。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供了一种HbA1c电化学生物传感器，包括工作电极，所示工作电极包括基底电极和捕获分子，所述基底电极为丝网印刷碳电极，所述捕获分子为4-巯基苯硼酸。
优选地，所述基底电极为16通道丝网印刷碳电极。
优选地，所述捕获分子固定于所述基底电极上。
进一步优选地，所述捕获分子通过修饰于基底电极上的纳米金固定于所述基底电极上。进一步地，所述捕获分子通过Au-S键固定于所述基底电极上。
优选地，采用恒电位沉积法将氯金酸直接还原成纳米金并修饰于基底电极上。
优选地，所述基底电极上捕获分子的密度范围≥0.5nmol/平方毫米。
进一步优选地，所述基底电极上捕获分子的密度范围是0.5～10nmol/平方毫米。
进一步优选地，所述基底电极上捕获分子的密度范围是0.64～6.37nmol/平方毫米。
优选地，所示电化学生物传感器中还含有参比电极和对电极。
优选地，所示参比电极选用银/氯化银。所示对电极选用碳电极。
本发明的第二方面，提供了前述HbA1c电化学生物传感器中工作电极的制备方法，包括步骤：在基底电极表面添加捕获分子，孵育，获得工作电极。
具体地，所述方法包括如下步骤：
(1)对基底电极表面进行纳米金修饰：采用恒电位沉积法将氯金酸直接还原成纳米金，并修饰于干净的基底电极表面，获得纳米金修饰的基底电极；
(2)在纳米金修饰的基底电极上固定捕获分子：将步骤(1)获得的纳米金修饰的基底电极表面进行4-巯基苯硼酸孵育，获得工作电极。
优选地，步骤(1)中，电沉积时间为100～200s。优选为150s。
优选地，步骤(1)中，氯金酸浓度范围是0.005～0.1mg/mL。更优选为0.06mg/mL。
优选地，步骤(2)中，采用的4-巯基苯硼酸的浓度≥1mM。进一步地，采用的4-巯基苯硼酸的浓度为1～50mM。进一步地，采用的4-巯基苯硼酸的浓度为10mM。
本发明的第三方面，提供前述HbA1c电化学生物传感器在制备HbA1c检测产品中的用途。
本发明的第四方面，提供了一种HbA1c电化学生物检测系统，包括前述HbA1c电化学生物传感器和H2O2。
本发明的第四方面，提供了一种使用前述HbA1c电化学生物传感器检测HbA1c的方法，包括步骤：在HbA1c电化学生物传感器的工作电极上添加待测样本，孵育，冲洗，吹干后，置于H2O2中进行循环伏安检测。
优选地，所述方法为非疾病诊断目的的方法。
优选地，检测时采用三电极系统，除了工作电极以外，还包括对电极和参比电极。
优选地，采用碳电极为对电极，银/氯化银为参比电极。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
与传统的HbA1c检测手段相比，本发明的电化学生物传感器具有如下优点：通过化学修饰将捕获基团固定在电极表面，相较其他模型能够提高捕获分子的修饰密度，修饰步骤和方法快速简便、易操作，不需要特殊标记的报告基团输出信号，利用自身催化性质即可产生响应。
本发明建立了一种能够特异性识别糖化血红蛋白的电化学生物传感检测体系，也为实现自动化集成化精准检测提供一定检测基础。
附图说明
图1：本发明检测原理图。
图2：电沉积时间的影响。
图3：氯金酸浓度的影响。
图4：MPBA浓度的影响。
图5：各步修饰的循环伏安检测。
图6：各步修饰的时间电流检测。
图7：质量浓度HbA1c检测。
图8：比例浓度HbA1c检测。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1 HbA1c电化学生物传感器的构建
一、材料：
氯金酸(Hydrogen tetrachloroaurate(III)hydrate(HAuCl4))购于百灵威公司；4-巯基苯硼酸(MPBA)购于阿拉丁公司；亚铁氰化钾，氯化钾，30％过氧化氢等试剂购于国药集团化学试剂有限公司；缓冲溶液PBS、0.5％酪氨酸溶液(0.1M PBS)等试剂购于生工生物工程(上海)股份有限公司，所有溶液用Milli-Q水(18MΩcm电阻)配制。靶标分子购于Abcam公司。
二、检测仪器
HSBS16x系列多通道电化学工作站，CHI 760E电化学工作站(上海辰华仪器公司产品)，电子天平，PH计，磁力加热搅拌器，常温离心机，漩涡混合仪。
三、检测原理
如图1所示，本发明将16-SPCE(16通道丝网印刷碳电极)首先通过电沉积纳米金，利用Au-S键的形成将MPBA(4-巯基苯硼酸)修饰在丝网印刷碳电极上。4-巯基苯硼酸中的硼酸能够与糖分子的二羟基发生结合，在此基础上，修饰在电极上的4-巯基苯硼酸作为捕获探针结合糖化血红蛋白，利用HbA1c自催化特性，催化分解H2O2，将化学信号转化为电信号，以实现对糖化血红蛋白的电化学检测。
四、工作电极的制备
(1)16通道丝网印刷碳电极(16-SPCE)的表面处理：将未经处理的16通道丝网印刷碳电极(16-SPCE)用Milli-Q水清洗干净，N2吹干，以备后续实验使用；
(2)16通道丝网印刷碳电极(16-SPCE)表面进行纳米金修饰：采用恒电位沉积法将氯金酸(HAuCl4)直接还原成纳米金，并修饰于步骤(1)中吹干的16通道丝网印刷碳电极(16-SPCE)表面，获得纳米金修饰的16通道丝网印刷碳电极(16-SPCE)；
(3)16通道丝网印刷碳电极(16-SPCE)表面固定捕获分子MPBA：将步骤(2)获得的纳米金修饰的16通道丝网印刷碳电极(16-SPCE)表面进行MPBA孵育，获得MPBA及纳米金修饰的16通道丝网印刷碳电极(MPBA-SAM-SPCE)，亦即工作电极。
五、检测靶标分子HbA1c
首先取出步骤四中制备好的工作电极，用80％甲醇和Milli-Q水清洗干净，N2吹干，加入待检测样品，室温孵育，孵育结束后，冲洗，吹干后，将捕获了靶标分子HbA1c的电化学生物传感器置于H2O2中进行循环伏安检测。
实施例2考察16-SPCE电极电沉积纳米金优化实验条件
将未经处理的16-SPCE用Milli-Q水清洗干净，N2吹干，以备后续实验使用。设定不同运行时间(100s,150s,200s)，考察不同时间条件下对电沉积纳米金效果的影响。将不同运行时间电沉积后的电极置于0.5M H2SO4，扫描速率为100mV s-1，进行循环伏安检测。如图2所示，通过纳米金修饰前后还原峰电流增大的比例来判断修饰电极的性能，随着沉积时间的增加，还原峰电流也逐渐增大，150s时峰电流达到最大值，之后开始降低。由此可知，可将电沉积时间设置为100～200s。将电沉积时间设置为150s时得到的还原峰最强，故为最佳沉积时间。
设置不同浓度的氯金酸(0.005,0.01,0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.07,0.08,0.09,0.1mg/mL)，考察不同氯金酸浓度条件下对电沉积纳米金效果的影响。将不同浓度条件下电沉积后的电极置于0.5M H2SO4，扫描速率为100mV s-1，进行循环伏安检测，取还原峰电流值进行比较。如图3所示，随氯金酸浓度的提高还原峰电流值呈现先上升后下降的趋势，由此可见，氯金酸浓度范围可以是0.005～0.1mg/mL。当浓度值为0.06mg/mL，还原峰电流值达到最高，故为最佳电沉积氯金酸浓度。
因此，可将16-SPCE电极条置于优选出的0.06mg/mL HAuC14溶液中，-200mV下电沉积，运行时间为150s。电沉积后，取出电极条，用Milli-Q水彻底冲洗电极表面后，N2吹干残留的水珠，得到纳米金修饰的16通道丝网印刷电极。
实施例3考察MPBA-SAM-SPCE电极优化实验条件
取MPBA溶于80％甲醇，制备不同浓度的MPBA溶液，设置不同浓度的MPBA(0,10,20,30,40,50mM，80％甲醇)。取上述步骤得到的纳米金修饰16-SPCE，取8μL滴涂于修饰后的工作电极表面，置4℃冰箱中孵育30min后，取出，并用Milli-Q水冲洗干净，并用N2吹干，获得MPBA-SAM SPCE，置于2.5mM K4Fe(CN)6(0.1M KCl)，进行循环伏安检测。如图4所示，MPBA通过与纳米金形成的金硫键而被修饰在SPCE，因此还原位点被封闭，使还原峰减小，不同MPBA浓度修饰的电极之间结果无明显差别，由此可见，MPBA的浓度可以是1～50mM。其中，10mM可为最佳MPBA修饰浓度。亦即，工作电极上捕获分子MPBA的密度范围可以是≥0.5nmol/平方毫米。例如，工作电极上捕获分子MPBA的密度范围可以是0.5～10nmol/平方毫米。进一步地，可以是0.64～6.37nmol/平方毫米。
实施例4完成MPBA电化学生物传感器的构建，考察各步修饰的电催化活性
为了探究每一步修饰步骤对电化学生物传感器的电化学影响，先采用实施例2～3中的最优条件，根据实施例1中的构建方法，制备工作电极。将16通道丝网印刷碳电极、纳米金修饰16通道丝网印刷碳电极和MPBA及纳米金修饰16通道丝网印刷碳电极置于1mM H2O2(0.1M PBS,pH8.5)中进行循环伏安法和时间电流法检测，对产生的电流信号进行对比研究。由图5可以看出，于0～-0.6V电位范围内，纳米金修饰后电极的催化性能远远超过裸碳电极，还原峰增大，还原电流响应提高；再经MPBA进一步化学修饰后，作为催化位点的纳米金被封闭，使其催化响应减小，还原峰减小，还原电流降低。将裸碳电极与MPBA修饰电极进行比较，二者CV峰形相似，还原电流差别不大。同样，由图6所示结果可知，-0.45V的初始电压条件下，纳米金修饰电极可产生的还原电流明显增大，裸碳电极与MPBA修饰电极差别不大。此外，采用实施例2～3中的其他优化条件，根据实施例1中的构建方法，制备工作电极。考察每一步修饰的电催化活性，也获得了一样的实验结果。
通过探究电极每一步修饰的电催化活性，确认本发明能够实现较低的背景信号，为后续实验内容的顺利进行提供了保障。
实施例5采用本发明的MPBA-SAM SPCE电化学生物传感器检测质量浓度靶标蛋白
HbA1c
先采用实施例2～3中的最优条件，根据实施例1中的构建方法，制备工作电极。利用HbA1c分子具有的催化位点，能够催化还原过氧化氢，作为报告单元输出特异性检测信号。取建立好的MPBA-SAM SPCE，加入不同质量浓度的靶标分子HbA1c(5,10,50,100,250,500,600,800,1000μg/ml)，室温孵育1h。孵育结束后，用1×PBS(pH8.5)冲洗，N2吹干后，将捕获了HbA1c的生物传感器置于1mM H2O2(0.1M PBS,pH8.5)中进行循环伏安检测，取-0.6V下的响应电流值进行处理，如图7所示：随HbA1c质量浓度增加还原电流强度递增，并绘制相关曲线方程(y＝1.69672E-9*x+3.17807E-8，R2＝0.9994)。
此外，采用实施例2～3中的其他优化条件，根据实施例1中的构建方法，制备工作电极。绘制工作曲线，也获得了一样的实验结果。
实施例6采用本发明的MPBA-SAM SPCE电化学生物传感器检测比例浓度靶标蛋白
HbA1c
同实施例5，取建立好的MPBA-SAM SPCE，加入不同比例浓度的靶标分子HbA1c(2％,4％,5％,7％,10％,15％,20％)，如图8所示：随HbA1c比例浓度增加还原电流强度递增，并绘制相关曲线方程(y＝2.1057E-7*x-5.11722E-7，R2＝0.94155)。此外，采用实施例2～3中的其他优化条件，根据实施例1中的构建方法，制备工作电极。绘制工作曲线，也获得了一样的实验结果。
综上所述，本发明的电化学生物传感器对于目标蛋白非常好的检测灵敏度效果；非常好的检测限效果；以及非常好的检测准确率效果。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (16)

1.一种HbA1c电化学生物传感器，包括工作电极，所示工作电极包括基底电极和捕获分子，所述基底电极为丝网印刷碳电极，所述捕获分子为4-巯基苯硼酸。
2.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述基底电极为16通道丝网印刷碳电极。
3.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述捕获分子固定于所述基底电极上。
4.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述捕获分子通过修饰于基底电极上的纳米金固定于所述基底电极上。
5.根据权利要求4所述的电化学生物传感器，其特征在于，采用恒电位沉积法将氯金酸直接还原成纳米金并修饰于基底电极上。
6.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述基底电极上捕获分子的密度范围≥0.5nmol/平方毫米。
7.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述基底电极上捕获分子的密度范围是0.5～10nmol/平方毫米。
8.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述基底电极上捕获分子的密度范围是0.64～6.37nmol/平方毫米。
9.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所示电化学生物传感器中还含有参比电极和对电极。
10.如权利要求1～9任一项所述电化学生物传感器中工作电极的制备方法，包括步骤：在基底电极表面添加捕获分子，孵育，获得工作电极。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)对基底电极表面进行纳米金修饰：采用恒电位沉积法将氯金酸直接还原成纳米金，并修饰于干净的基底电极表面，获得纳米金修饰的基底电极；
(2)在纳米金修饰的基底电极上固定捕获分子：将步骤(1)获得的纳米金修饰的基底电极表面进行4-巯基苯硼酸孵育，获得工作电极。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，电沉积时间为100～200s。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，氯金酸浓度范围是0.005～0.1mg/mL。
14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，采用的4-巯基苯硼酸的浓度≥1mM。
15.一种HbA1c电化学生物检测系统，包括如权利要求1～9任一项所述电化学生物传感器和H2O2。
16.如权利要求1～9任一项所述电化学生物传感器或如权利要求15所述HbA1c电化学生物检测系统的使用方法，包括步骤：在HbA1c电化学生物传感器的工作电极上添加待测样本，孵育，冲洗，吹干后，置于H2O2中进行循环伏安检测。
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