MX2011003952A - Metodo electroquimico no enzimatico para la determinacion simultanea de hemoglobina total y hemoglobina glucosilada. - Google Patents

Abstract

Se expone un método electroquímico no enzimático para la medición simultánea de hemoglobina (Hb) y el porcentaje de hemoglobina glucosilada (%HbA1c) en una muestra de sangre. El método incluye la determinación de la cantidad total de hemoglobina en una muestra al medir electroquímicamente la corriente voltimétrica debida a las porciones redox de hierro (II) y hierro (III) de la hemoglobina y la determinación del porcentaje de hemoglobina glucosilada (HbA1c) por potenciometría. También se expone una novedosa tira con electrodo impreso por serigrafía (SPE, por sus siglas en inglés) modificada para la medición potenciométrica de HbA1c.

Description

MÉTODO ELECTROQUÍMICO NO ENZIMÁTICO PARA LA DETERMINACIÓN SIMULTÁNEA DE HEMOGLOBINA TOTAL Y HEMOGLOBINA GLUCOSILADA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un método que utiliza una tira de electrodo no enzimático impreso por serigrafia (tira de SPE, por sus siglas en inglés) desechable para la medición simultánea de hemoglobina (Hb) total y el porcentaje de hemoglobina glucosilada (%HbAlc) en una muestra de sangre en donde la Hb total se estima por amperometría o voltametria de pulso diferencial, y la cantidad de HbAlc se estima por potenciometria . También se describe la modificación de una tira de SPE para la medición potenciométrica de HbAlc.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La importancia del diagnóstico y monitoreo de la diabetes es enfatizado por un reporte reciente en el cual se ha establecido que 20% de la población total mundial está afectada por esta enfermedad crónica. Una de las medidas proactivas necesarias para controlar la diabetes mellitus es el monitoreo y control periódico de los niveles de glucosa en la sangre ya sea con la ayuda de clínicos o usando kits de "hágalo usted mismo". HbAlc es una variante estable menor de Hb, formada in vivo por medio de modificación post traslacional no enzimática de valina con terminal N de las cadenas ß de Hb. La estimación de HbAlc es extremadamente valiosa para el control a largo plazo de la diabetes mellitus a diferencia de la estimación directa de glucosa en donde se obtiene información del azúcar en la sangre en el momento de la medición. Por lo tanto, además del monitoreo de los niveles de glucosa en la sangre, es extremadamente importante que se monitoree el nivel global de glucosa mediante el monitoreo de HbAlc. Esta es una mejor manera de manejar la diabetes, y puede resultar en la prevención o reducción de complicaciones a largo plazo. En años recientes, se han descrito o desarrollado varios tipos de kits para monitorear los niveles de HbAlc en la sangre .

La Patente de EE.UU. No. 7,005,273 describe métodos electroquímicos catalizados por enzimas para medir Hb y HbAlc, y un método espectrofotométrico para medir HbAlc. El método se basa en una estimación electroquímica indirecta de Hb usando una medición de oxígeno disuelto y reacciones catalizadas por enzimas. Las desventajas de este método se relacionan con la estabilidad de la enzima y la vida de anaquel del sistema. Es bien sabido que los niveles de oxígeno disuelto dependen de la temperatura y por lo tanto necesita mantenerse un ambiente de temperatura constante para la conflabilidad del análisis.

Adicionalmente , la solubilidad del oxigeno en un ambiente acuoso no es suficiente para proporcionar las señales de corriente requeridas para la determinación indirecta de Hb .

La Patente de EE.UU. No. 6,677,158 describe un método colorimétrico para la estimación de HbAlc que puede realizarse fuera del laboratorio médico e incluye varias etapas que incluyen la adición química y dispositivos de lectura de color para la medición de Hb lo cual requiere una alta dilución de la muestra. Esta técnica es más bien compleja y requiere varias operaciones manuales. Además, en mediciones colorimétricas, la sensibilidad es relativamente menor en comparación con otros métodos.

La Patente de EE.UU. No. 4,876,205 describe un método para el ensayo de Hb en la sangre en el cual la sangre se pone en contacto con una cantidad suficiente de un ferricianuro (mediador de oxidación-reducción) de tal manera que la hemoglobina en la sangre reacciona con el mismo y la hemoglobina se ensaya electroquímicamente monitoreando el cambio en la corriente, producida al reducirse el ferricianuro por la hemoglobina. El método de ensayo incorpora un sensor de tira seca con una mezcla seca que contiene ferricianuro finamente dividido y un surfactante no iónico, clerol (una mezcla de óxido de polietileno y óxido de polipropileno y emulsionantes). Sin embargo, este es un método útil solo para hemoglobina total en toda la sangre. Esta es una estimación indirecta de Hb y tiene ciertas limitaciones, tales como la dependencia de la señal de corriente en la cinética de las transformaciones de oxidación-reducción del mediador. El uso de mediadores de oxidación-reducción no es económico para la comercialización del proceso.

La Patente EP 1,225,449 Al describe el uso de una tira de electrodo desechable no enzimático para la detección de ácido úrico y H . La tira contiene surfactantes no iónicos o neutrales tales como Tritón X-100 para Hb y un surfactante catiónico para ácido úrico. La tira se usa entonces como un sensor amperométrico . En este método no se usan ni surfactantes aniónicos ni catiónicos para detectar Hb.

Se conocen métodos para el análisis de HbAlc. Por ejemplo, el analizador DCA2000 de Siemens Diagnostics es un método de inmunoensayo de enzimas automatizado para la determinación de HbAlc. La mayoría de los analizadores comercialmente disponible emplean HPLC como una herramienta para el ensayo de HbAlc [Clinical Biochemistry, 2005, 38, 88-91]. Recientemente ha habido un reporte sobre el uso de un biosensor de cristal de cuarzo para la detección de HbAlc usando reacciones formadoras de complejos de grupos dioles con ácido 3-aminofenilborónico [Analytica Chimica Acta, 2005, 530, 75-84].

Existen reportes acerca de los métodos de exploración electroquímica tales como amperometría y variantes para desarrollar sensores desechables para la determinación de HbAlc [Biosensors and Bioelectronics , 2006, 21, 1952-1959; Biosensors and Bioelectronics, 2007, 22, 2051- 2056; Sensors and Actuators B, 2006, 113, 623-629; Sensors and Actuators A, 2006, 130-131, 267-272; Clinical Biochemistry, 2008, CLB6720, doi: 10.1016/j. clinbiochem.208.01.113] .

La estimación clínica de HbAlc basada en la conversión enzimática es más bien complicada y requiere el uso de métodos analíticos tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, electroforesis en gel, métodos inmunoquímicos y otros métodos espectroscópicos . Estas técnicas son complejas, requieren grandes cantidades de reactivos y consumen tiempo. El costo por análisis también es relativamente alto. A pesar de que están comercialmente disponibles varios métodos para la estimación de HbAlc, existe una necesidad por una herramienta de diagnóstico rápida, robusta y económica para el análisis de HbAlc, de tal manera que puedan hacerse decisiones para un mejor manejo de la diabetes mellitus y las complicaciones de la misma.

Por lo tanto, un aspecto de la presente invención es proporcionar un método rápido, no enzimático y directo para la determinación simultánea de Hb total por amperometria o voltametria de pulsos diferencial y el porcentaje de HbAlc por potenciometria en una muestra de sangre en un solo análisis.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con una tira de electrodo impreso por serigrafia (SPE) para la medición simultánea de Hb total y %HbAlc en una muestra sanguínea. La tira incluye cuatro electrodos.

En un aspecto de la invención, la tira de SPE es no enzimática.

En otro aspecto de la invención, la tira de SPE es desechable.

La invención también se relaciona con una tira de electrodo impreso por serigrafia (SPE) desechable no enzimático, para la medición simultánea de Hb total por amperometria o voltametria de pulsos diferencial, y %HbAlc por potenciometria en una muestra de sangre.

Aún otro aspecto de la invención es que la tira se usa en un método para la medición simultánea de Hb total y %HbAlc en una muestra de sangre.

La presente invención también se relaciona con un kit para la medición simultánea de Hb total y %HbAlc en una muestra sanguínea que comprende una tira de SPE (como se describe arriba), una solución de lisis, y una solución de surfactante. El kit también puede incluir una lanceta, una tira de papel de transferencia por adsorción, un vial vacio y un inserto con instrucciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es un diagrama de bloques de la tira de SPE y su conexión a un medidor.

La figura 2 es un diagrama de bloques del hardware y los detalles funcionales del medidor.

La figura 3 es un diagrama de una tira de electrodo impreso por serigrafia (SPE) .

La figura 4A muestra un gráfica de calibración típica para Hb por amperometría .

La figura 4B muestra la respuesta del electrodo para Hb por amperometría.

La figura 5A muestra una gráfica de calibración típica para Hb por voltametría de pulsos diferencial (DPV, por sus siglas en inglés) .

La figura 5B muestra la respuesta del electrodo para Hb por voltametría de pulsos diferencial (DPV) .

La figura 6 muestra la respuesta de DPV de Hb en 1.5 mM de dodecilsulfato de sodio (SDS, por sus siglas en inglés) en solución amortiguadora de acetato de pH 5.0 [conc. de Hb 0.7-1.7 g/dl] .

La figura 7 muestra la estimación potenciométrica de HbAlc (la línea de la gráfica que tiene símbolos cuadrados ¦ ) usando película de polímero de ácido aminofenilboronico sobre la superficie del electrodo y la estimación de Hb (la línea de la gráfica con símbolos triangulares .

La figura 8 muestra la estimación potenciométrica de HbAlc usando ácido aminofenilboronico en solución.

La figura 9 muestra la estimación potenciométrica de HbAlc usando un electrodo que ha sido modificado con tinta de carbón usando ácido 4-fenil-vinil borónico insoluble en agua (la línea de la gráfica que tiene símbolos cuadrados ¦) y un electrodo que ha sido modificado con tinta de carbón usando ácido 3-tiofeno borónico (la línea de la gráfica con símbolos triangulares .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Antes de describir detalladamente la presente invención, tiene que entenderse que esta invención no se limita a modalidades particulares. Debe entenderse que la terminología utilizada en la presente tiene como propósito describir solo modalidades particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invención.

Tal como se usa en la especificación y en las reivindicaciones, las formas singulares "un", "uno/una" y "el/la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente otra cosa.

El término "tira de electrodo impreso por serigrafia (SPE)" se refiere a una tira de electrodo descrita más adelante. Se entenderá que aunque los electrodos pueden formarse usando impresión por serigrafia, la invención no se limita al uso de impresión por serigrafia para formar los electrodos. Pueden usarse otros métodos de impresión u otros métodos para formar los electrodos .

El término "intervalo de respuesta Nernstiano" se refiere a un intervalo de concentración en el cual la pendiente (definida por mV/década de concentración) es menor que la pendiente Nernstiana "ideal" de 59 mV/década.

El término "electrodo modificado" se refiere a un electrodo cuya superficie está recubierta con capas de materiales funcionales deseados específicos para la aplicación. En una modalidad de la presente invención, un electrodo de carbón o de grafito impreso por serigrafia se modifica por medio de un compuesto de ácido borónico insoluble en agua.

El término "voltametría de pulsos diferencial" se refiere a una técnica electroanalitica en la cual un pulso 52-713 de onda cuadrada sobrepuesta a una rampa de potencial de de (incremento lineal de potencial con el tiempo) se aplica en el electrodo detector y la salida de corriente diferencial se gráfica contra el potencial de de aplicado.

El término "área de reacción" se refiere al área sobre el electrodo, que se expone a la muestra de sangre.

El término "carbón vitreo" también denominado carbón vidrioso se refiere a un carbón no grafitico, el cual combina propiedades vitreas y cerámicas con las del carbón no grafitico. Las propiedades más importantes son resistencia a altas temperaturas, resistencia extrema al ataque químico e impermeabilidad a gases y líquidos. El carbón vitreo se usa ampliamente como un material de electrodo en electroquímica.

El término "medidor" se refiere a un instrumento, el cual mide la diferencia de potencial y la señal de corriente generada en la superficie del electrodo cuando el electrodo se pone en contacto con la muestra de sangre. La concentración de HbAlc se convierte a diferencia de potencial, la concentración de Hb se convierte a señal de corriente, y tanto los valores de Hb como de %HbAlc se visualizan en la pantalla del medidor.

Medición de Hb Total Hb consiste de cuatro cadenas de proteínas con 52-713 cuatro porciones heme (Fe /Fe ) y se localiza en los eritrocitos. Aunque sin estar limitado por ninguna teoría, el enfoque de la presente invención incluye analizar Hb aprovechando el comportamiento de oxidación-reducción de las porciones heme (Fe2+/Fe3+) en la molécula de Hb usando una superficie de electrodo impreso por serigrafía desechable recubierta con un material tal como carbón, grafito, oro, platino, paladio, plata o una tinta de impresión como se describe más adelante.

El método de conformidad con la presente invención incluye determinar la cantidad total de Hb en una muestra por medición electroquímica de la corriente voltamétrica debido a centros de oxidación-reducción de hierro (II) (también conocido como Fe2+) e hierro (III) (también conocido como Fe3+) en Hb usando metodologías de modificación de amplificación de señales de corriente mejoradas con surfactante. El potencial del electrodo se fija a un nivel en el que la molécula de heme interactúa con la superficie del electrodo para someterse a una reacción de transferencia de electrones. Por lo tanto la corriente observada es directamente proporcional a la cantidad de heme presente, la cual a su vez está relacionada con la concentración de Hb total presente en la solución de prueba dada. Como los centros de heme en Hb se entierran profundamente dentro de las moléculas de 52-713 proteínas voluminosas, es difícil obtener una señal de corriente apreciable. Para superar esto, las porciones de heme deben liberarse o hacerse disponibles antes de realizar una medición amperométrica . Para este fin, la Hb se trata como se describe más adelante con un surfactante me orador de corriente.

El grupo heme liberado muestra características de oxidación-reducción significativas en el electrodo sin un mediador de oxidación-reducción. El grupo heme también puede liberarse de la molécula de Hb usando sonicación seguido por centrifugación o proporcionando a la molécula de Hb un enlace químico a mediadores de oxidación-reducción (tal como ferroceno, metilviologeno, etc.). Por lo tanto la señal de corriente puede amplificarse usando el surfactante iónico y se convierte a g/dL de Hb y se visualiza en la pantalla del medidor.

Medición de HbAlc HbAlc es la forma glucosilada de Hb que resulta de la reacción de condensación entre azúcares de hexosa y Hb. En la presente invención, HbAlc se ha analizado usando un enfoque potenciométrico a diferencia de métodos óptico, de amperometría mediado por oxidación-reducción, inmunoensayo y otros métodos, tales como métodos de balance de masa de cristal de cuarzo.

El compuesto de ácido borónico insoluole en agua añadido como se describe más adelante resulta en la formación de un complejo entre boronato y grupos cis-diol de azúcares presentes en la HbAlc. Durante estos cambios químicos, se desarrolla un potencial de equilibrio de la superficie del electrodo que depende de la concentración de HbAlc en la muestra. La diferencia de potencial surge debido al cambio en el valor pKa del compuesto de ácido borónico en la superficie del electrodo. Esto resulta en una relación lineal entre la concentración de HbAlc y la diferencia de potencial medida al usar el intervalo de respuesta Nernstiana de la técnica potenciométrica . Esta diferencia de potencial se mide con respecto al electrodo de referencia y se convierte a %HbAlc y se visualiza en la pantalla de un medidor.

Después de que la tira de SPE (la cual se conecta directamente o indirectamente a un medidor) se humedece con la solución que contiene glóbulos rojos (RBCs, por sus siglas en inglés), la presencia de Hb y HbAlc se detecta por amperometría o voltametría de pulsos diferencial, y potenciometría , respectivamente. La señal de corriente puede amplificarse usando un surfactante iónico, el cual se convierte a g/dL de Hb y se visualiza en la pantalla del medidor .

Descripción de la tira de SPE La tira de SPE incluye placas de contacto que son la porción superior de los electrodos y se ilustran como 12 en la figura 3; material aislante, el cual es el sustrato, y película no porosa aislante, la cual es la película aislante eléctrica. La tira, que puede ser desechable, se usa para la detección no enzimática de Hb y %HbAlc. Ésta comprende : (i) un sustrato, el cual es un aislante eléctrico. Los tipos de aislantes eléctricos que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, un tablero de epoxi vitreo; material de polímero eléctricamente no conductor tal como poliestireno ; o sustratos de epoxi reforzado con fibra (FRE, por sus siglas en inglés) de espesor variable desde 0.3 mm hasta 1.0 mm. En un aspecto de la presente invención, el sustrato es FRE. (ii) Una película conductora, la cual se recubre sobre un lado del sustrato para formar cuatro electrodos independientes, a decir, (a) un contraelectrodo, (b) un electrodo de trabajo, (c) un electrodo de referencia y (d) un electrodo modificado. (iii) Una película aislante. La película aislante eléctrica se recubre sobre una parte de la película conductora de tal manera que un extremo de todos los electrodos está descubierto para conectar con el dispositivo de medición y el extremo opuesto está descubierto y se pretende que esté en contacto con la solución que contiene la muestra a probar. La película aislante eléctrica tiene propiedades de aislamiento eléctrico con una impedancia muy alta mayor que 1012 ohmios. Este material se usa para recubrir la película conductora para proporcionar el aislamiento eléctrico. La película aislante eléctrica puede ser un material comercialmente disponible. Un ejemplo de una película aislante eléctrica es XV1300U.V. "NOTACIÓN BLANCA", TINTA NO. CFSN6022, suministrada por Sun Chemical, UK.

En un aspecto de la presente invención, la tira de SPE comprende cuatro electrodos, en donde el electrodo 1 (contraelectrodo) , el electrodo 2 (electrodo de trabajo) y el electrodo 3 (electrodo de referencia) se usan para la estimación de Hb por amperometría o voltametría de pulsos diferencial; y el electrodo 3 y el electrodo 4 (electrodo modificado) se usan para la estimación de HbAlc por potenciometría . El electrodo 3 es un electrodo de referencia común tanto para amperometría como para potenciometría. Los electrodos son independientes uno del otro y no están en contacto entre sí. Los electrodos 1, 2, 3 y 4 se muestran en la figura 3.

De conformidad con un aspecto de la presente invención, se marcan los sitios para los electrodos y un 52-713 lado del sustrato se recubre con una película conductora usando impresión por serigrafía o un método de impresión similar para formar los electrodos. También pueden usarse otros métodos para formar los electrodos. En este proceso solo se recubren los electrodos y no todo el sustrato. La película conductora se selecciona de oro, platino, paladio, plata, carbón o grafito o una tinta de impresión la cual tiene la propiedad de adherirse a la superficie del sustrato sin ninguna mancha de tal manera que los electrodos permanecen independientes uno del otro. La película conductora acepta o dona electrones y puede usarse como el mediador para transferir electrones entre el analito y el electrodo en la reacción de oxidación-reducción .

En una modalidad de la presente invención, la tinta de impresión se usa como la película conductora y la tinta de impresión típicamente utilizada es una tinta de carbón o grafito o una mezcla de una tinta de carbón y plata. En un aspecto de la presente invención, el material para recubrir los electrodos es una película de carbón conductora o una tinta de carbón imprimible. Puede usarse cualquier tinta de carbón comercialmente disponible que proporcione una respuesta electroquímica para experimentos de voltametría cíclica estándar. Un material que puede usarse para recubrir el sustrato usando impresión por 52-713 serigrafia es una pasta de carbón conductora obtenida de Coates Inc. (EE.UU.). Esta pasta de carbón conductora puede usarse como tinta para imprimir sobre áreas predeterminadas del sustrato para formar los electrodos.

En un aspecto de la presente invención, el espesor de la película conductora sobre el sustrato es de entre 20 a 60 micrometros. En otro aspecto de la presente invención, el espesor de la película conductora es de aproximadamente 30 micrometros.

El intervalo de las dimensiones de cada electrodo de la tira de SPE, la cual se expone a la solución que contiene los glóbulos rojos (RBC's) (región 15 en la figura 3) , puede ser: Electrodo 1 (contraelectrodo) : Longitud: 3.0 mm a 10.0 mm, preferentemente 5.0 mm Ancho: 0.3 mm a 2.0 mm, preferentemente 0.5 mm Espesor: 20 micrometros a 150 micrometros, preferentemente 60 micrometros.

Electrodo 2 (electrodo de trabajo): Longitud: 2.0 mm a 9.0 mm, preferentemente .0 mm Ancho: 0.3 mm a 2.0 mm, preferentemente 1.0 mm Espesor: 20 micrometros a 150 micrometros, preferentemente 60 micrometros. 52-713 Electrodo 3 (electrodo de referencia) : Longitud: 3.0 mm a 10.0 mm, preferentemente 5.0 mm Ancho: 0.3 mm a 2.0 mm, preferentemente 0.5 mm Espesor: 20 micrómetros a 150 micrómetros, preferentemente 60 micrómetros.

Electrodo 4 (electrodo de modificado) : Longitud:. 3.0 mm a 10.0 mm, preferentemente 5.0 mm Ancho: 0.3 mm a 2.0 mm, preferentemente 0.5 mm Espesor: 20 micrómetros a 150 micrómetros, preferentemente 60 micrómetros.

Después de que se recubre el sustrato con la película conductora, éste se seca a una temperatura de 90 °C a 150 °C, preferentemente de aproximadamente 120 °C, durante aproximadamente 30 minutos a 60 minutos, preferentemente durante aproximadamente 45 minutos. Después de secar, el sustrato se sumerge en un ácido seleccionado de ácido crómico al 10%, ácido sulfúrico al 10%, ácido nítrico al 5-10% ó solución de ácido clorhídrico al 10% durante 10 minutos. En un aspecto de la presente invención, el sustrato recubierto se sumerge en una solución de ácido crómico al 10%. El sustrato se remueve de la solución de ácido crómico y se lava con agua tres veces durante 2 a 15 minutos por lavado, preferentemente, aproximadamente 10 52-713 minutos por lavado. El sustrato se seca de nuevo, preferentemente a aproximadamente 70 °C durante aproximadamente 20 minutos.

Se aplica una película aislante eléctrica a la tira por impresión serigráfica u otro método excepto sobre las placas de contacto y la sección de la tira identificada como la región 15 en la figura 3.

La película conductora del cuarto electrodo (electrodo modificado) , se modifica mediante un compuesto de ácido borónico insoluble en agua usando impresión por serigrafía o similar en la porción del electrodo que se sumergirá en la muestra de RBCs mostrada como 16 en la figura 3. Este recubrimiento modificado permite cambios tales como el potencial, la resistencia por reacción electroquímica entre el electrodo modificado y el electrodo de referencia que se utilizará para determinar el %HbAlc.

La modificación del electrodo no es posible con la forma soluble de compuestos de ácido borónico, porque el electrodo perderá su capacidad de detección debido a la infiltración del ácido borónico selectivo a HbAlc y los grupos funcionales asociados. Por lo tanto, en la presente invención, se han usado compuestos de ácido borónico insolubles en agua para modificar el cuarto electrodo (electrodo 4) . El compuesto de ácido borónico insoluble en agua puede seleccionarse de ácido 4-fenil-vinil borónico, 52-713 ácido amino fenil borónico o ácido tiofeno borónico. En un aspecto de la presente invención se usa ácido 4-fenil-vinil borónico como un ácido borónico insoluble en agua.

El cuarto electrodo puede modificarse de acuerdo con los siguientes procedimientos: (a) Se disuelve un compuesto de ácido borónico insoluble en agua en un solvente de baja volatilidad adecuado que puede disolver el compuesto de ácido borónico insoluble en agua. El solvente se selecciona de alcohol isopropilico, etanol, propanol o acetona. La solución obtenida puede mezclarse con una pasta de carbón conductor en una relación en peso de 1:0.5 a 1:4, preferentemente en una relación de aproximadamente 1:1 y usarse para imprimir sobre el sustrato para la estimación potenciométrica de HbAlc. (b) En una configuración alternativa (para potenciometria) , el electrodo de carbón impreso se modifica con una película (espesor: aproximadamente 5-10 ym) de un compuesto de ácido borónico insoluble en agua, por electrodeposición sobre el electrodo de carbón usando procedimientos/condiciones de electropolimerización. El compuesto de ácido borónico insoluble en agua y fluoruro de sodio se disuelven en solución de ácido clorhídrico. La polimerización se efectúa sumergiendo el cuarto electrodo de carbón impreso por serigrafía en esta solución sin 52-713 agitación. El potencial del cuarto electrodo se escanea entre 0.0 y 1.1 V hasta que la carga en el escaneo catódico alcanza 10 mC cm~2. Se obtiene una película verde-azulosa profunda y se lava con agua. El electrodo se modifica por lo tanto y después se enjuaga con agua, seguido por remojo en solución salina amortiguada con fosfatos (PBS, por sus siglas en inglés) .

Pueden usarse otros procesos para preparar el electrodo modificado.

Solamente se modifica la porción del cuarto electrodo que se sumergirá en la muestra de RBCs.

La figura 3 describe una tira de electrodo impresa por serigrafía (SPE) . Ésta consiste de cuatro electrodos, a decir, un contraelectrodo (1), un electrodo de trabajo (2), un electrodo de referencia (3) y un electrodo modificado (4). Básicamente, los electrodos están impresos por serigrafía sobre el sustrato (13) usando una película conductora. Preferentemente, se usa la tinta de carbón conductor que tiene resistencia en el intervalo de 15 ohmios a 25 ohmios para imprimir por serigrafía los electrodos (1), (2), (3) y (4) sobre el sustrato (13). Las placas de contacto (12) están en el extremo superior de los electrodos y se usan para proveer la conexión eléctrica con el conector (8) en la figura 1. Preferentemente, la anchura de las placas de contacto es la misma para los cuatro 52-713 electrodos. Una película eléctricamente aislante (14) se imprime por serigrafía sobre todas las superficies de los electrodos excepto las placas de contacto y la sección de los electrodos identificada como la región (15). La región (15) es la porción de los electrodos que se pone en contacto con la muestra que contiene los RBCs (5 en la figura 1) para la determinación de la concentración de hemoglobina y hemoglobina glucosilada. Solo la porción del electrodo (4) que va a sumergirse en la muestra se modifica usando un compuesto de ácido borónico insoluble en agua y se muestra como (16) en la figura 3.

Adicionalmente, la presente invención también se relaciona con un método electroquímico no enzimático para la medición simultánea de Hb total y ¾HbAlc en una muestra sanguínea utilizando la tira de SPE (como se describió anteriormente) comprendiendo las etapas de: (a) tratar una muestra de sangre con una solución de lisis; (b) remover el plasma para obtener glóbulos rojos (RBCs) ya sea por decantación del plasma o sumergiendo una tira de papel de transferencia por absorción en la muestra obtenida en la etapa (a) ; (c) tratar la muestra que contiene RBCs obtenida en la etapa (b) con una solución de surfactante ; (d) poner en contacto la muestra obtenida en la 52-713 etapa (c) con la tira de SPE; (e) medir la Hb total por amperometria o voltametria de pulsos diferencial; y medir la HbAlc por potenciometria ; y (f) calcular el %HbAlc en relación con la Hb total en la muestra de sangre.

La muestra de sangre recolectada del paciente se somete a pretratamiento para separar glóbulos rojos (RBCs) del plasma por adición a una solución de lisis. El plasma se remueve ya sea por decantación o sumergiendo un papel de transferencia por absorción en la muestra sanguínea con solución de lisis y los RBCs obtenidos se tratan con la solución de surfactante. La solución de lisis puede seleccionarse de etanol al 50%; ácido acético 1 M (en agua), ácido acético 0.2 M (en agua), ácido cítrico 0.2 M (en agua); alcohol etílico/agua (1:1) o NaCl (en agua). La relación de la solución de lisis con respecto a la muestra es 1:1 a 1:20 (v/v) , preferentemente 1:10 (v/v) .

El surfactante puede seleccionarse de todo tipo de surfactantes catiónicos, aniónicos, por ejemplo surfactantes iónicos y preferentemente se selecciona de surfactantes gemínales, bromuro de didodecildimetilamonio, bromuro de cetiltrimetilamonio, bromuro de benciltrimetilamonio, bromuro de fenaciltiazolio, hidrocloruro de aminoguanidina, tiourea, bromuro de 52-713 fenacil-tiazolio/-piridinio, dodecilsulfato de sodio, poliestirenosulfonato de sodio, o sales de sodio de ácidos benceno/naftaleno-mono-/di-/tri-sulfónicos . La relación del surfactante con respecto a la muestra de RBCs es 1:1 a 1:20 (v/v) y preferentemente 1:10 (v/v) .

La tira de SPE se introduce en la muestra que contiene RBCs tratados. Se genera una diferencia de potencial debido a la reacción de HbAlc sobre la superficie del electrodo modificado con ácido borónico. La diferencia de potencial se mide con respecto al electrodo de referencia y se convierte a %HbAlc y se visualiza en la pantalla de un medidor. Similármente, se genera una corriente entre los electrodos 1, 2 y 3 proporcional a la concentración de hemoglobina en donde tiene lugar la reacción de Fe2+/Fe3+ sobre la superficie del electrodo. La señal de corriente se convierte a g/dL de Hb y se visualiza en la pantalla del medidor. Los detalles funcionales del medidor se muestran en la figura 2. La linea punteada separa los componentes del Tablero de Circuitos Impresos (PCB, por sus siglas en inglés) que comprende módulos de preamplificador y de Unidad Microcontroladora (MCU, por sus siglas en inglés) . Los electrodos de Hb (electrodo 1, 2 y 3) generan la señal de corriente, la cual enseguida se convierte a una señal de voltaje equivalente a través de un convertidor de corriente a voltaje. El electrodo modificado 52-713 genera directamente una diferencia de potencial, el cual a su vez se mide como una señal de voltaje. Ambas señales de voltaje que corresponden a Hb y HbAlc respectivamente se amplifican a través de un Amplificador de Instrumentación. El Convertidor de Analógico a Digital (ADC, por sus siglas en inglés) convierte las señales de voltaje amplificadas a señales digitales equivalentes. La CU procesa los datos digitales y visualiza directamente el valor de Hb en términos de g/dL y HbAlc como un valor de porcentaje en una Pantalla Alfanumérica . En un aspecto de la presente invención, se requieren tanto los valores de Hb total como de HbAlc para calcular el valor de %HbAlc. El porcentaje de HbAlc se calcula de la siguiente manera: %HbAlc = [ (HbAlc/Hb total) x 100] Todo el análisis puede completarse de cinco a diez minutos después de la recolección de la sangre. Como se muestra, en la figura 7, de conformidad con la presente invención, Hb y HbAlc pueden medirse y cuantificarse cada uno y no existe ninguna interferencia entre las mediciones y la cuantificación de cada uno en relación con el otro.

La figura 1 muestra un diagrama de bloques de cómo se lleva a cabo un análisis típico cuando se conecta la tira de SPE con el medidor. La muestra en el vial (6) contiene glóbulos rojos (RBCs) (5), que han sido separados del plasma. La solución de surfactante, preferentemente una 52-713 solución de surfactante iónico se añade al vial (6) para liberar preferentemente proteínas Heme. Los RBCs se mezclan con la solución de surfactante y se pueden analizar. La tira de SPE (7) se conecta al extremo del conector (8) del medidor (10), a través del cable (9). El sensor mide la concentración de Hb y HbAlc en el vial, la MCU calcula tanto Hb como HbAlc en unidades g/dL y %, respectivamente. El medidor (10) indica estos valores en la pantalla (11).

La presente invención también se relaciona con un kit para mediciones simultáneas de Hb total y %HbAlc en una muestra de sangre comprendiendo una tira de SPE (como se describió arriba) , una solución de lisis, y una solución de surfactante. El kit también puede incluir una lanceta, una tira de papel de transferencia por absorción, un vial vacío y un inserto con instrucciones.

En una modalidad de la presente invención, la lanceta se usa para perforar la piel de tal manera que puede recolectarse sangre en el vial vacío.

El inserto con instrucciones proporciona instrucciones para usar el kit. El inserto puede incluir instrucciones que describen las etapas necesarias para medir Hb y %HbAlc en la muestra incluyendo la descripción de como se extrae la sangre, y se mezcla con las soluciones de lisis y de surfactante.

La presente invención proporciona por lo tanto un método para la estimación de %HbAlc y Hb total en una sola etapa utilizando una tira de electrodo impresa por serigrafia no enzimática desechable, la cual incorpora electrodos para amperometria o voltametria de pulsos diferencial y potenciometria .

Un ejemplo de un aparato que puede usarse es un dispositivo de mesa que puede usarse en una oficina del practicante médico. En algunas modalidades, un aparato que puede utilizarse puede ser operado por una persona técnicamente no entrenada.

La descripción anterior describe en general la presente invención. Más detalles de la invención anterior se pueden entender a partir de los siguientes ejemplos. Estos ejemplos se proporcionan aquí con el propósito de ilustración y no pretenden limitar el alcance de la invención .

EJEMPLOS Ejemplo 1 Preparación de Electrodos El material de partida utilizado para la preparación de electrodos de la tira de sensor impreso por serigrafia fue pasta de carbón conductor adquirida de Coates, Inc. (EE.UU.). Esta pasta de carbón conductor se utilizó como una tinta para imprimir sobre las áreas predeterminadas de los sustratos de epoxi reforzados con fibra (FRE) usando un proceso de impresión por serigrafia.

Ejemplo 2 Modificación del Electrodo 4 Como se muestra en la Figura 3, la región 16 del electrodo 4 de la tira de SPE preparada en el Ejemplo 1 se modificó disolviendo ácido 4-vinilfenil borónico en alcohol isopropilico (aproximadamente 10 mi) y se mezcló con la pasta de carbón conductor en una relación 1:1 (en peso) y se usó para impresión por serigrafia para la estimación potenciométrica de HbAlc de la muestra de sangre.

Ejemplo 3 Proceso para Modificación del Electrodo 4 En este proceso el electrodo de carbón impreso por serigrafia del Ejemplo 1 se modificó con una película de polímero conductor (espesor: aproximadamente 5-10 µp?) de ácido amirio fenil borónico (PABA, por sus siglas en inglés) . Se electrodepositó sobre el electrodo de carbón usando el procedimiento y las condiciones de electropolimerización, las cuales se describen brevemente a continuación: se disolvieron 87.0 mg de ácido 3-amino fenil borónico (0.04 M) y 105.0 mg de fluoruro de sodio (0.2 M) en 12.5 mi de solución de HC1 0.2 M. La polimerización se realizó sumergiendo uno de los electrodos de carbón impresos por serigrafia en la solución anterior bajo condiciones sin agitación y se escaneó el potencial del electrodo entre 0.0 y 1.1 V hasta que la carga en el escaneo catódico alcanzó 10 mC cm"2. Se obtuvo una película verde-azulosa profunda y se lavó con agua. De esta manera se modificó el electrodo y se enjuagó con agua, seguido por solución de PBS y estuvo listo para usarse.

Ejemplo 4 Curva de Calibración para la Estimación de Hb por Amperometría Usando Bromuro de Didodecildimetil Amonio (DDDMAB, por sus siglas en inglés) como Surfactante La muestra de hemoglobina estándar (Catálogo No. 400294022, Nicholas Piramal India Limited) (15 g/dl) se diluyó en un intervalo de concentración de 0.5 g/dl a 1.9 g/dl usando la solución de surfactante conteniendo DDD AB disuelta en solución de cloruro de potasio 0.1 M. La tira de SPE, preparada en el Ejemplo 1, se introdujo en la solución de muestra anterior. Después los electrodos se conectaron al potenciostato usando conectores apropiados y se hizo un barrido del potencial entre 0.1 a 0.8 voltios a una velocidad de escaneo de 100 mV/s. Se midió la corriente de pico en el intervalo de potencial pico de 0.25 a 0.30 V. 52-713 Esto se repitió con cinco muestras estándar y se trazó una gráfica de calibración de "corriente de pico vs. concentración de Hb" . De la gráfica de calibración, se calculó la pendiente de la gráfica y ésta última se utilizó para la determinación de Hb total en la muestra de prueba. Una gráfica de calibración típica y la respuesta del electrodo para Hb en DDDMAB 5 mM - solución de C1 1M se muestra en las Figuras 4A y 4B.

La gráfica de calibración experimental para Hb, realizada por amperometría, se ajusta linealmente por medio de una linea recta. La ecuación y = 0.3759x proporciona el mejor ajuste con un coeficiente de regresión R2 = 0.9857. Esta ecuación se usa para determinar la concentración de Hb presente en la muestra.

Ejemplo 5 Curva de Calibración para la Estimación de Hb por Voltametría de Pulsos Diferencial Usando DDDMAB como Surfactante La muestra de hemoglobina estándar (Catálogo No. 400294022, Nicholas Piramal India Limited) (15 g/dl) se diluyó en un intervalo de concentración de 0.5 g/dl a 1.9 g/dl usando la solución de surfactante conteniendo bromuro de didodecildimetil amonio (DDDMAB) disuelta en solución de cloruro de potasio 0.1 M. La tira de SPE, preparada en el 52-713 Ejemplo 1, se introdujo en la solución de muestra anterior. Después los electrodos se conectaron al potenciostato usando conectores apropiados en el modo de voltametria de pulsos diferencial (DPV). Se hizo un barrido del potencial entre -0.2 y 0.4 V a una velocidad de escaneo de 5 mV/s usando los parámetros: potencial escalonado: 2 mV; ancho de pulso: 50 mV; periodo de pulsos: 200 ms . Se midió la corriente de pico DPV en el intervalo de potencial anterior. Esto se repitió con cinco muestras estándar y se trazó una gráfica de calibración de "corriente pico vs . concentración de Hb". De la gráfica de calibración, se calculó la pendiente de la gráfica y ésta última se utilizó para la determinación de Hb total en la muestra de prueba. Una gráfica de calibración típica y la respuesta del electrodo para Hb en DDDMAB .5 mM - solución de KC1 1M se muestra en las Figuras 5A y 5B.

La gráfica de calibración experimental para Hb, realizada por voltametria de pulsos diferencial, se ajusta linealmente por medio de una línea recta. La ecuación y = 3.2409x proporciona el mejor ajuste con un coeficiente de regresión R2 = 0.9952. Esta ecuación se usa para determinar la concentración de Hb presente en la muestra.

Ejemplo 6 Curva de Calibración para la Estimación de Hb por 52-713 Voltametria de Pulsos Diferencial Usando Dodecil Sulfato de Sodio como Surfactante La muestra de hemoglobina estándar (Catálogo No. 400294022, Nicholas Piramal India Limited) (15 g/dl) se diluyó en un intervalo de concentración de 0.5 g/dl a 1.9 g/dl usando la solución de surfactante conteniendo dodecil sulfato de sodio (SDS, por sus siglas en inglés) disuelta en solución de cloruro de potasio 0.1 M. La tira de SPE, preparada en el Ejemplo 1, se introdujo en la solución de muestra anterior. Después los electrodos se conectaron al potenciostato usando conectores apropiados y se hizo un barrido del potencial entre 0.1 y 0.8 voltios a una velocidad de escaneo de 100 mV/s . Se midió la corriente de. pico en el intervalo de potencial pico de 0.25 a 0.30 V. Esto se repitió con cinco muestras estándar y se trazó una gráfica de calibración de "corriente de pico vs. concentración de Hb" . De la gráfica de calibración, se calculó la pendiente de la gráfica y ésta última se utilizó para la determinación de Hb total en la muestra de prueba. Una gráfica de calibración típica y la respuesta del electrodo para Hb en SDS 5 mM - solución de KC1 1M se muestra en la Figura 6.

La gráfica de calibración experimental para Hb, realizada por voltametria de pulsos diferencial, se ajusta linealmente por medio de una linea recta. La ecuación y = 52-713 O .475x+0.4199 proporciona el mejor ajuste con un coeficiente de regresión R2 = 0.9802.

Ejemplo 7 Curva de Calibración para la Estimación de %HbAlc por Potenciometría Usando una Tira de SPE Modificada con Ácido Aminofenilborónico Se depósito una película de ácido aminofenilborónico (PABA) sobre el electrodo de carbón vitreo. Se disolvieron ácido 3-amino fenil borónico (0.04 M) y fluoruro de sodio (0.2 M) en solución de ácido clorhídrico (0.2 M) . Se efectuó la polimerización manteniendo el electrodo de trabajo en esta solución junto con hoja de platino como contraelectrodo y calomel saturado como electrodo de referencia. Se escaneó el potencial del electrodo entre 0.0 y 1.1 V para 3-5 escaneos. El electrodo modificado se enjuagó después con agua seguido por solución de PBS y se usó para experimentos posteriores.

Con base en estos resultados, se estableció una relación lineal entre la concentración de HbAlc y la diferencia de potencial, permitiendo la estimación potenciométrica de la HbAlc como se muestra en la Figura 7.

La línea de la gráfica en la figura 7 que tiene símbolos cuadrados (¦) indica el cambio en la diferencia de potencial de HbAlc como función de la concentración de 52-713 HbAlc. La linea de la gráfica en la figura con símbolos de triángulo (A) indica el cambio en la concentración de Hb sola. La separación de estas dos líneas de la gráfica muestra que no hay ninguna interferencia de Hb en la detección y cuantificación de HbAlc cuando Hb y HbAlc se miden simultáneamente.

Ejemplo 8 Curva de Calibración para la Estimación de %HbAlc por Potenciometría Usando una Tira de SPE Modificada con Ácido Aminofenilborónico soluble en agua Para este experimento se utilizó una tira de SPE, preparada en el Ejemplo 1. Se disolvió ácido aminofenilborónico (APBA) soluble en agua en una solución electrolítica conteniendo la muestra y se midió el cambio consecuente en el potencial del electrodo debido a la adición de HbAlc. El ácido aminofenilborónico en solución interactúa con HbAlc, dando una relación entre la concentración de HbAlc y la diferencia de potencial medida. Esta diferencia de potencial surge debido a un cambio en el valor de pKa en la superficie del electrodo. Con base en estos resultados, se estableció una relación lineal (Figura 8) entre la concentración de HbAlc y la diferencia de potencial, permitiendo la estimación potenciométrica de HbAlc. 52-713 Ejemplo 9 Curva de Calibración para la Estimación de %HbAlc por Potenciometria Usando una Tira de SPE Modificada con Ácido Vinilfenilborónico Este método estima el potencial de un electrodo modificado por una tinta de carbón de ácido vinilfenilborónico (insoluble en agua), el cual se sumergió en una solución electrolítica conteniendo la muestra (TruLab HbAlc nivel de líquido 1 a nivel 4; Diagnostic System GmbH, Alemania) y se midió el cambio consecuente en el potencial del electrodo debido a la adición de HbAlc. Este electrodo modificado interactúa con HbAlc, dando una relación entre la concentración de HbAlc y la diferencia de potencial medida. Esta diferencia de potencial surge debido a un cambio en el valor de pKa en la superficie del electrodo. Con base en estos resultados, se estableció una relación lineal entre la concentración de HbAlc y la diferencia de potencial, permitiendo la estimación potenciornétrica de HbAlc como se muestra en la Figura 9. Este experimento muestra la relación lineal entre HbAlc y la diferencia de potencial.

La Figura 9 muestra la estimación potenciornétrica de HbAlc usando un electrodo que ha sido modificado con tinta de carbón usando ácido 4-fenil-vinil borónico insoluble en agua (la línea de la gráfica que tiene 52-713 símbolos cuadrados ¦) y un electrodo que ha sido modificado con tinta de carbón usando ácido 3-tiofeno borónico (la línea de la gráfica con símbolos de triángulo ^).

Ejemplo 10 Curva de Calibración para la Estimación de %HbAlc por Potenciometría Usando una Tira de SPE Modificada con Ácido Tiofenoborónico Un electrodo modificado con una tinta de carbón de ácido tiofenoborónico (insoluble en agua) se sumergió en una solución electrolítica conteniendo la muestra (TruLab HbAlc nivel de líquido 1 a nivel 4 Diagnostic System GmbH, Alemania) y se midió el cambio consecuente en el potencial del electrodo debido a la adición de HbAlc. Este electrodo modificado interactúa con HbAlc, dando una relación entre la concentración de HbAlc y la diferencia de potencial medida. Esta diferencia de potencial surge debido a cambios en el, valor de pKa en la superficie del electrodo. Con base en estos resultados, se estableció una relación lineal entre la concentración de HbAlc y la diferencia de potencial, permitiendo la estimación potenciométrica de HbAlc como se muestra en la Figura 9.

Ejemplo 11 Medición de Hb Total y %HbAlc de una Muestra de 52-713 Sangre de un Paciente Se recolectó una muestra de sangre de un paciente diabético en un laboratorio clínico. Se tomaron 20 µ?, de muestra de sangre en un vial de prueba y se añadieron 200 de solución de lisis consistiendo de 50% de etanol. El vial se mantuvo durante dos minutos sin agitación de tal manera gue se separó el plasma de los RBCs. El plasma separado se decantó inclinando el vial. Los RBCs, siendo un fluido espeso, no fluyó fuera del vial mientras se decantaba el plasma. Después, se añadieron 200 µ?, de surfactante iónico 5 mM bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB, por sus siglas en inglés) y la solución se agitó manualmente aproximadamente durante un minuto para mezclar los RBCs con la solución de surfactante. La solución estuvo lista para análisis. La tira de SPE modificada con ácido 4-fenil-vinil-borónico se insertó en el vial. Se generó una diferencia de potencial debido a la reacción de HbAlc sobre la superficie del electrodo modificado con ácido borónico la cual se midió con respecto al electrodo de referencia y se convirtió a %HbAlc y se visualizó en la pantalla del medidor. Similarmente, una señal de corriente generada entre los electrodos 1, 2 y 3 proporcional a la concentración de hemoglobina se convirtió a g/dL de Hb y se visualizó en la pantalla del medidor. La concentración de Hb fue de 10.52 g/dl y el valor de %HbAlc fue de 9.3%. Se 52-713 analizó la muestra del mismo paciente usando el sistema pruebas Chloestech GDX AlC y se estimó HbAlc en 9.2%. 2-713

Claims (18)

R—E—IVIN^D-^I—CA^C-^I—O—NE—S \

1. Una tira de electrodo impreso por serigrafia (SPE, por sus siglas en inglés) para la medición simultánea de hemoglobina total (Hb) y porcentaje de hemoglobina glucolsilada (HbAlc) en una muestra de sangre que incluye cuatro electrodos que comprenden un contraelectrodo, un electrodo de trabajo, un electrodo de referencia y un electrodo modificado por medio de un compuesto de ácido borónico insoluble en agua; en donde el contraelectrodo, el electrodo de trabajo y el de referencia, se usan para la estimación de Hb por amperometria o voltametria de pulsos diferencial; los electrodos de referencia y modificado se usan para la estimación de HbAlc por potenciometria ; y el electrodo de referencia se usa tanto para amperometria como para potenciometria.

2. La tira de electrodo impreso por serigrafia según la reivindicación 1, en donde los electrodos están recubiertos con un material seleccionado de carbón, grafito, oro, platino, paladio, plata o una tinta de impresión .

3. La tira de electrodo impreso por serigrafia según la reivindicación 2, en donde los electrodos están recubiertos con tinta de impresión de carbón o de grafito.

4. La tira de electrodo impreso por serigrafia 52-713 según la reivindicación 2, en donde los electrodos están recubiertos con tinta de impresión de carbón.

5. La tira de electrodo impreso por serigrafia según la reivindicación 1, en donde los electrodos se forman usando impresión por serigrafia.

6. La tira de electrodo impreso por serigrafia según la reivindicación 1, en donde la tira es no enzimática .

7. La tira de electrodo impreso por serigrafia según la reivindicación 1, en donde la tira es desechable.

8. La tira de electrodo impreso por serigrafia según la reivindicación 1, en donde el compuesto de ácido borónico se selecciona de ácido 4-fenil-vinil borónico, ácido aminofenil borónico o ácido tiofeno borónico.

9. La tira de electrodo impreso por serigrafia según la reivindicación 1, en donde la tira se prepara por medio de un proceso que comprende las etapas de: a) recubrir con una película conductora sobre un lado del sustrato para formar los electrodos que comprenden un contraelectrodo, un electrodo de trabajo, un electrodo de referencia y un electrodo modificado, en donde los electrodos están aislados y desconectados; b) lavar el sustrato en una solución ácida y secar; c) recubrir una película aislante sobre una 52-713 parte de los electrodos en donde un extremo de los electrodos está sin recubrir para hacer contacto con el medidor y el otro extremo de los electrodos, el cual es opuesto al extremo en donde puede conectarse al medidor, también está sin recubrir; d) modificar la porción del electrodo 4, el cual es opuesto al extremo que puede conectarse al medidor, usando un compuesto de ácido borónico insoluble en agua.

10. Un kit para la medición simultánea de Hb total y %HbAlc en una muestra de sangre comprendiendo una tira de SPE de la reivindicación 1.

11. El kit según la reivindicación 10, en donde adicionalmente comprende una solución de lisis y una solución de surfactante.

12. El kit según la reivindicación 11, en donde adicionalmente comprende una lanceta, una tira de papel de transferencia por absorción, un vial vacio y un inserto con instrucciones .

13. El kit según la reivindicación 11, en donde la solución de lisis se selecciona de etanol al 50%; ácido acético 1 M (en agua), ácido acético 0.2 M (en agua), ácido cítrico 0.2 M (en agua); alcohol etílico/agua (1:1) o NaCl (en agua) .

14. El kit según la reivindicación 13, en donde la solución de lisis es etanol al 50%. 52-713

15. El kit según la reivindicación 11, en donde la solución de surfactante es un surfactante iónico seleccionado de surfactantes gemínales, bromuro de didodecildimetilamonio, bromuro de cetiltrimetilamonio, bromuro de benciltrimetilamonio, bromuro de fenaciltiazolio, hidrocloruro de aminoguanidina, tiourea, bromuro de fenacil-tiazolio/-piridinio, dodecilsulfato de sodio, poliestirenosulfonato de sodio, o sales de sodio de ácidos benceno-/naftaleno-mono-/di-/tri-sulfónicos .

16. Un método para la medición simultánea de Hb total y %HbAlc en una muestra de sangre que comprende: (a) tratar una muestra de sangre con una solución de lisis; (b) remover el plasma para obtener glóbulos rojos (RBCs, por sus siglas en inglés) ya sea por decantación del plasma o mediante la inmersión de una tira de papel de transferencia por absorción en una muestra obtenida en la etapa (a) ; (c) tratar la solución obtenida en la etapa (b) con una solución de surfactante; (d) poner en contacto la solución obtenida en la etapa (c) con el electrodo impreso por serigrafía de la reivindicación 1; (e) medir la Hb total por amperometría o voltametría de pulsos diferencial; y medir HbAlc por 52-713 potenciometria ; y (f) calcular el %HbAlc en relación con la Hb total en la solución de glóbulos rojos.

17. El método según la reivindicación 16, en donde la solución de lisis se selecciona de etanol al 50%; ácido acético 1 M (en agua), ácido acético 0.2 M (en agua), ácido cítrico 0.2 M (en agua); alcohol etílico/agua (1:1) o NaCl (en agua) .

18. El método según la reivindicación 16, en donde la solución de surfactante es un surfactante iónico seleccionado de surfactantes gemínales, bromuro de fenacil-tiazolio/-piridinio, hidrocloruro de aminoguanidina , tiourea, bromuro de didodecildimetilamonio, bromuro de cetiltrimetilamonio, bromuro de benciltrimetilamonio, bromuro de fenaciltiazolio, dodecilsulfato de sodio o poliestirenosulfonato de sodio. 52-713