CN110487939A - 一种测定壳聚糖含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于多糖类及其衍生物领域，涉及壳聚糖含量测定的方法，具体地说是一种高效液相色谱法测定壳聚糖含量的方法。将待测原料壳聚糖进行乙酰化处理生成甲壳素，而后对乙酰化制备的甲壳素进行酸水解得到氨基葡萄糖盐酸盐，通过对水解后得到的氨基葡萄糖盐酸盐进行高效液相色谱法测定，得其含量，进而转化计算得出原料壳聚糖的含量。本发明在于把壳聚糖衍生为甲壳素，再水解成单糖，解决了壳聚糖解离不彻底的问题。另外，该测定方法采用了蒸发光散射检测器‑‑高效液相色谱法，不仅灵敏度高、检出限低、准确性好、分离效果明显，可以排除壳聚糖分子量和脱乙酰度差异带来的干扰，是现代应用较为广泛的一种检测方法。

Description

一种测定壳聚糖含量的方法

技术领域

本发明属于多糖类及其衍生物领域，涉及壳聚糖含量测定的方法，具体地说是一种高效液相色谱法测定壳聚糖含量的方法。

背景技术

壳聚糖是甲壳素在碱性条件下的脱乙酰产物，其化学名称为聚葡萄糖胺(1,4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖，是除纤维素外，自然界含量最大的天然有机高分子化合物。壳聚糖在自然界中广泛存在于昆虫壳、虾蟹壳、软体动物的骨骼以及真菌的细胞壁中，其中，海洋节肢动物的虾蟹外壳是目前壳聚糖最容易获取，并且也是含量最为丰富的资源。壳聚糖具有良好的生物相容性、生物可降解性和成膜性等理化性质，是重要的生物活性物质，具有抑菌、抗氧化、抗肿瘤、抗凝血、减肥降脂和增强免疫力等功能，并且安全无毒，因此，广泛应用于食品、医药、日化等领域。

目前，测定壳聚糖含量的方法有：分光光度法、高效毛细管电泳法、电化学分析法和高效液相色谱法等。分光光度法测定壳聚糖含量具有操作简单、方便、快速、经济的优点，但壳聚糖本身不具有发色基团，不能通过分光光度法直接检测，灵敏度较低，选择性较差，部分金属元素对体系可能存在干扰，影响壳聚糖的准确定量。高效毛细管电泳法具有快速，高效，简便，试样、溶剂消耗少及灵敏度高等优点，在近十几年内成为分离和分析生物活性物质的有力工具之一，但在糖类的分析上存在着一些难点，主要为多数糖类解离程度十分微弱，且具有较强的亲水性，致使利用试样淌度差异的毛细管区带电泳和利用试样疏水性差异的胶束毛细管电动色谱都难以直接解决糖的分离问题。电化学分析法具有装置简单，响应快、成本低、线性范围宽等特点，较早应用于壳聚糖的定量分析。但是由于壳聚糖没有电化学活性，需要与电化学探针如染料、指示剂等发生氧化还原反应，因此，电化学方法灵敏度较低，稳定性不佳，近年来采用电化学法测定壳聚糖的报道较少。

高效液相色谱法具有专属性较强、灵敏度高、检出限低、准确性好、快速高效、分离效果明显等特点，其突出优势在于可以排除壳聚糖分子量和脱乙酰度差异带来的干扰，是现代应用较为广泛的一种检测方法。

另外，由于壳聚糖的分子结构复杂多样，分子量较大，影响测试的稳定性和准确性，因此，一般很难直接对壳聚糖分子进行测定得到其含量，近年来仍多采用将壳聚糖水解成单糖的方式来对其含量进行测定。但是由于壳聚糖结构中含有氨基，直接酸水解壳聚糖存在解离不测底的问题，不能准确测定壳聚糖的含量，而甲壳素结构中不含有氨基，酸水解更彻底，因此，采用将壳聚糖乙酰化制备成甲壳素的方法，能较准确地得到壳聚糖的含量。

查阅文献，发现目前采用高效液相色谱法检测壳聚糖含量的报道较少，而将壳聚糖乙酰化制备成甲壳素，再进一步酸水解的研究几乎没有报道。我国目前仍缺乏专门检测壳聚糖含量的方法，因此，建立准确的壳聚糖定量分析方法，对保障壳聚糖产品质量的稳定性和可控性，推动壳聚糖在医药、食品、农业、工业等领域的应用，具有重要的社会效益和经济效益。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高效液相色谱法测定壳聚糖含量的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种高效液相色谱法测定壳聚糖含量的方法，将待测原料壳聚糖进行乙酰化处理生成甲壳素，而后对乙酰化制备的甲壳素进行酸水解得到氨基葡萄糖盐酸盐，通过对水解后得到的氨基葡萄糖盐酸盐进行高效液相色谱法测定，由标准曲线中查得氨基葡萄糖盐酸盐的含量，进而转化计算得出原料壳聚糖的含量。

其中，HPLC色谱条件为：采用氨基色谱柱，检测器为蒸发光散射检测器，流动相为乙腈-水溶液（60:40，V/V），流速为0.5-1.0 mL/min，进样量为10-50 μL，柱温为25-45 ℃。

所述标准曲线的绘制：以氨基葡萄糖盐酸盐为标准品，加去离子水溶解，配制成不同浓度的一系列标准溶液，对所得不同浓度的标准溶液采用HPLC色谱条件进样检测，而后以氨基葡萄糖盐酸盐浓度为横坐标，对应的峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。

所述配制一系列氨基葡萄糖盐酸盐标准溶液，其浓度分别为1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL、3.0 mg/mL、3.5 mg/mL、；所述HPLC色谱条件为：采用氨基色谱柱，检测器为蒸发光散射检测器，流动相为乙腈-水溶液（60:40，V/V），流速为0.5-1.0 mL/min，进样量为10-50 μL，柱温为25-45 ℃。

进一步的说：

1）试样准备：取壳聚糖试样置于烘箱中，烘干至恒重，备用；取烘干至恒重的壳聚糖试样适量，酸碱滴定法测定壳聚糖的脱乙酰度值；以甲醇为溶剂，取烘干至恒重的壳聚糖试样适量，加入乙酸酐，进行乙酰化反应，浓缩，将所得浓缩液冷冻干燥，得壳聚糖乙酰化制备甲壳素；

2）试样溶液的制备：取干燥至恒重的壳聚糖试样适量，加入浓盐酸和去离子水，进行酸水解，得壳聚糖酸水解试样溶液；取冷冻干燥得到的壳聚糖乙酰化制备甲壳素，加入浓盐酸和去离子水进行酸水解，得壳聚糖乙酰化制备甲壳素的酸水解试样溶液；

3）试样的测定：取水解液试样溶液适量，过0.45 μm有机滤膜，HPLC进样检测，由标准曲线获得氨基葡萄糖盐酸盐的浓度，通过公式一、二计算得到壳聚糖的含量。

(公式一)

式中:

w ——壳聚糖含量，%；

C ——由标准曲线获得的氨基葡萄糖盐酸盐的浓度，mg/mL；

V ——酸水解溶液体积，mL；

Mr _i——不同脱乙酰度壳聚糖的摩尔质量，g/mol；

m ₁——样品质量，mg；

Mr ₁——氨基葡萄糖盐酸盐的摩尔质量，g/mol。

其中，Mr _i是根据壳聚糖的脱乙酰度值计算得到，具体计算公式为：

(公式二)

式中:

D.D. ——壳聚糖的脱乙酰度值，%；

161.2 ——壳聚糖单元的摩尔质量，g/mol；

203.2 ——甲壳素单元的摩尔质量，g/mol。

由计算所得的含量可得出壳聚糖的纯度，当直接水解壳聚糖所得水解率α和壳聚糖乙酰化制备甲壳素的水解率β的比例系数γ（γ=β/α）为1时表示壳聚糖为纯品。另外，通过该系数γ结合壳聚糖直接水解率值α，在无需进行乙酰化反应的条件下可验证壳聚糖样品是否为纯品，即当γ与α的乘积为100%时，表示壳聚糖为纯品。

所述壳聚糖试样需用粉碎机粉碎，过10-200目筛子，四分法采样至50-300 g，置于30-150 ℃烘箱中干燥至恒重，备用。

所述步骤1）测定壳聚糖的脱乙酰度值，是将干燥后的壳聚糖试样溶解于5-80 mL浓度为0.05-1.0 mol/L的盐酸标准滴定溶液中，加入2-10滴甲基橙-苯胺蓝指示剂，而后用浓度为0.05-1.0 mol/L的氢氧化钠标准滴定溶液滴定过量的盐酸，通过公式三计算得到壳聚糖的脱乙酰度值。

(公式三)

式中：

D.D.—壳聚糖的脱乙酰度值，%；

c ₁ ——盐酸标准滴定溶液的浓度，mol/L；

c ₂ ——氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，mol/L；

V ₁ ——加入盐酸标准滴定溶液的体积，mL；

V ₂ ——滴定消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；

G ——壳聚糖样品质量，g；

0.016——与1 ml 1 mol/L盐酸标准滴定溶液相当的氨基量，g；

0.0994—理论氨基含量，16/161。

所述0.05-1.0 mol/L的盐酸标准滴定溶液，是由质量分数为36%-38%的浓盐酸稀释配制，再由基准碳酸钠溶液滴定计算而得。

所述0.05-1.0 mol/L的氢氧化钠标准滴定溶液，是由1.0-2.0 g氢氧化钠固体溶于500 mL去离子水中，再由盐酸标准滴定溶液滴定计算而得。

所述步骤1）对壳聚糖进行乙酰化处理得到乙酰化制备甲壳素，是以甲醇为反应溶剂，加入乙酸酐，室温搅拌反应2-48 h，而后减压浓缩回收溶剂，浓缩液冷冻干燥得壳聚糖乙酰化制备甲壳素。

所述步骤2）取干燥至恒重的壳聚糖试样10-90 mg，加入2-8 mL盐酸和1-5 mL水，梯度升温酸水解，反应结束，去除剩余盐酸，加水溶解，配制得酸水解待测溶液；取壳聚糖乙酰化制备甲壳素10-90 mg，按照上述相同方法进行水解，配制得壳聚糖乙酰化制备甲壳素的酸水解试样溶液。

所述梯度升温过程为20-50 ℃反应0.5-3 h，50-80 ℃反应0.5-3 h，80-120 ℃反应2-7 h。

与现有技术相比，本发明有益效果在于：

1、本发明测定方法将壳聚糖进行了乙酰化处理，制备成甲壳素，而后对乙酰化制备的甲壳素进行酸水解，而不是以往的衍生化引入其它杂质，进而实现测定的准确性。另外，本发明方法酸水解乙酰化制备的甲壳素，解决了直接酸水解壳聚糖不能被完全解离的问题，为测定壳聚糖含量提供了新的思路和方法，使测定得到的壳聚糖含量更接近于实际含量，测定结果更加准确。

2、本发明乙酰化处理采用甲醇为溶剂，可回收再利用，反应在常温下进行，容易操作，且试样使用量少，成本较小，有较好的经济效益、环境效益和社会效益。

3、本发明采用高效液相色谱法测定壳聚糖含量，具有专属性较强、灵敏度高、检出限低、准确性好、快速高效、分离效果明显等优势，具有较好的应用前景。

4、本发明采用的检测器为蒸发光散射检测器，属于通用型质量检测器，抗环境干扰性强，对流速、温度无苛刻要求，可进行梯度洗脱，对紫外吸收弱或无紫外吸收的糖类物质有较好的分析效果，在高效液相色谱上具有比紫外检测器和示差折光检测器更广泛的应用。

5、本发明提供了高纯度壳聚糖试样直接水解的水解率α和壳聚糖乙酰化制备甲壳素的水解率β，进而得到比例系数γ(γ=β/α)，通过比例系数结合壳聚糖直接水解率值，在无需进行乙酰化反应的条件下可以验证壳聚糖试样是否为纯品，解决了壳聚糖乙酰化制备甲壳素过程中乙酰化反应不完全、不易操作的难题，方便使用，应用前景广，具有较高的实际意义。

附图说明

图1为实施例1所得的氨基葡萄糖盐酸盐标准曲线；

图2为实施例1所得的氨基葡萄糖盐酸盐标准品色谱图；

图3为实施例1所得的壳聚糖水解试样溶液色谱图；

图4为实施例1所得的壳聚糖乙酰化制备甲壳素水解试样溶液色谱图；

图5为壳聚糖的脱乙酰度值与比例系数关系曲线图。

具体实施方式

以下实施实例是对本发明的进一步说明，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。

本发明在于把壳聚糖衍生为甲壳素，再水解成单糖，解决了壳聚糖解离不彻底的问题。另外，该测定方法采用了蒸发光散射检测器--高效液相色谱法，不仅灵敏度高、检出限低、准确性好、分离效果明显，可以排除壳聚糖分子量和脱乙酰度差异带来的干扰，而且克服了壳聚糖本身不具有发光基团，紫外吸收弱，不易被检测的困难，是现代应用较为广泛的一种检测方法，为实现壳聚糖产品的质量控制提供参考依据，对于推动壳聚糖产业发展具有重要的理论和现实意义。

实施例1

一种高效液相色谱法测定壳聚糖含量的方法：

标准曲线的绘制：精密称量氨基葡萄糖盐酸盐标准品0.5 g，加少量去离子水溶解并转移至25 mL容量瓶中，清洗转移三次，定容，摇匀，配制成浓度为20 mg/mL的标准品储备液，分别取储备液适量，稀释配制成浓度为0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5mg/mL、3.0 mg/mL的一系列标准溶液。分别取上述不同浓度的标准溶液适量，过0.45 μm有机滤膜，按照既定HPLC色谱条件进样检测，以氨基葡萄糖盐酸盐浓度X为横坐标，对应的峰面积积分值Y为纵坐标绘制标准曲线，得标准曲线的线性方程为Y=12358.15X-2755.56，相关系数R²为0.9988。所得氨基葡萄糖盐酸盐标准曲线如图1所示。从图中可以看出，当氨基葡萄糖盐酸盐在1.0~3.5 mg/mL浓度范围内时，标准曲线呈现较好的相关性。

HPLC色谱条件具体为：采用氨基色谱柱，检测器为蒸发光散射检测器，流动相为乙腈-水溶液（60:40，V/V），流速为0.8 mL/min，进样量为30 μL，柱温为35 ℃。

壳聚糖试样及壳聚糖乙酰化制备甲壳素试样的准备及检测过程具体为：

1）试样准备

取壳聚糖试样100 g置于烘箱中，烘干至恒重，备用。称取壳聚糖试样0.5 g，加入0.2mol/L的盐酸标准滴定溶液40 mL，充分搅拌溶解，而后加入4-8滴甲基橙-苯胺蓝指示剂，用氢氧化钠标准滴定溶液滴定过量的盐酸，至指示剂由紫色变为淡绿色，记录消耗氢氧化钠的体积，进而计算得到壳聚糖的脱乙酰度值。而后通过上述测试过程测定不同壳聚糖的脱乙酰度值。

对上述测定的不同脱乙酰度的壳聚糖试样分别进行乙酰化处理，得到相应的壳聚糖乙酰化制备甲壳素试样；具体乙酰化制备甲壳素的过程为：

取干燥至恒重的壳聚糖试样2.0 g，加入100 mL甲醇、0.5 mL乙酸酐，进行乙酰化反应，反应结束减压浓缩回收甲醇，浓缩液冷冻干燥，得壳聚糖乙酰化制备甲壳素。

2）试样溶液的制备

对上述测定的不同脱乙酰度的壳聚糖试样，分别进行酸水解，得到不同脱乙酰度壳聚糖的水解液；同时相应对不同脱乙酰度的壳聚糖所制备得甲壳素进行酸水解得其水解液；具体为：

取壳聚糖试样80 mg，加入2 mL浓盐酸、3 mL去离子水，在30 ℃条件下水解2 h，60 ℃条件下水解2 h，100℃条件下水解5 h，反应结束后，减压浓缩去除剩余盐酸，加水配制，得到壳聚糖酸水解试样溶液。

类似操作，取冷冻干燥得到的壳聚糖乙酰化制备甲壳素试样80 mg，加入3 mL浓盐酸、4 mL去离子水，在30 ℃条件下水解2 h，60 ℃条件下水解2 h，100 ℃条件下水解5 h，反应结束减压浓缩去除剩余盐酸，加水配制，得到壳聚糖乙酰化制备甲壳素的酸水解试样溶液。

3）试样的测定：取上述壳聚糖酸水解得到的水解试样溶液和壳聚糖乙酰化制备甲壳素酸水解得到的水解试样溶液适量，过0.45 μm有机滤膜，按照HPLC色谱条件进样检测，具体测试为：

HPLC色谱条件具体为：采用氨基色谱柱，检测器为蒸发光散射检测器，流动相为乙腈-水溶液（60:40，V/V），流速为0.8 mL/min，进样量为30 μL，柱温为35 ℃。

由上述HPLC色谱条件进样检测所测定的峰面积，由标准曲线中获得水解试样溶液中氨基葡萄糖盐酸盐的浓度，带入下述公式计算，进而得到不同脱乙酰度壳聚糖的含量。具体计算公式为：

式中:

w ——壳聚糖含量，%；

C ——由标准曲线获得的氨基葡萄糖盐酸盐的浓度，mg/mL；

V ——酸水解溶液体积，mL；

Mr _i——不同脱乙酰度壳聚糖的摩尔质量，g/mol；

m ₁——样品质量，mg；

Mr ₁——氨基葡萄糖盐酸盐的摩尔质量，g/mol。

其中，Mr _i是根据壳聚糖的脱乙酰度值计算得到，具体计算公式为：

式中:

D.D. ——壳聚糖的脱乙酰度值，%；

161.2 ——壳聚糖单元的摩尔质量，g/mol；

203.19 —甲壳素单元的摩尔质量，g/mol。

壳聚糖含量测定结果如表1所示。

表1 壳聚糖含量测定结果

并由上述表1记载的一系列不同脱乙酰度壳聚糖水解得到的比例系数，即可得出壳聚糖的脱乙酰度值与比例系数在一定范围内的参考值如表2所示。

表2 壳聚糖含量测定结果

实施例2

取某一未知壳聚糖原料50 g置于烘箱中，烘干至恒重，备用。准确称取干燥至恒重的壳聚糖试样1.0 g，按照上述酸碱滴定法测定其脱乙酰值为97.93%。

准确称取干燥至恒重的壳聚糖试样2.0 g，加入100 mL甲醇、0.5 mL乙酸酐，进行乙酰化反应，反应结束后，减压浓缩回收甲醇，浓缩液冷冻干燥，得壳聚糖乙酰化制备甲壳素。

取干燥至恒重的壳聚糖试样65 mg，加入2 mL浓盐酸、2 mL去离子水，置于集热式磁力恒温搅拌器中，在35 ℃条件下水解2.5 h，60 ℃条件下水解2.5 h，100℃条件下水解4.5 h，反应结束后，用旋转蒸发仪减压浓缩去除剩余盐酸，加水配制，定容于50 mL容量瓶中，得到壳聚糖酸水解试样溶液。

取冷冻干燥得到的壳聚糖乙酰化制备甲壳素试样65 mg，加入2 mL浓盐酸、2 mL去离子水，置于集热式磁力恒温搅拌器中，在35 ℃条件下水解2.5 h，60 ℃条件下水解2.5h，100℃条件下水解4.5 h，反应结束后，用旋转蒸发仪减压浓缩去除剩余盐酸，加水配制，定容于50 mL容量瓶中，得到壳聚糖乙酰化制备甲壳素的酸水解试样溶液。

取上述壳聚糖酸水解得到的水解试样溶液和壳聚糖乙酰化制备甲壳素酸水解得到的水解试样溶液适量，过0.45 μm有机滤膜，按照HPLC色谱条件分别进样检测其峰面积，代入线性方程Y=12358.15X-2755.56得到氨基葡萄糖盐酸盐的浓度，再通过壳聚糖计算公式计算，分别得到壳聚糖酸水解率α为60.23%，壳聚糖乙酰化制备甲壳素酸水解率β为99.50%，进而得到比例系数γ为1.65。

实施例3

对本发明高效液相方法进行了方法学验证，开展了精密度实验。取氨基葡萄糖盐酸盐标准样品溶液（2.0 mg/ml）适量，过0.45 μm有机滤膜，HPLC进样，重复5次，测定氨基葡萄糖盐酸盐峰面积积分值，外标法测定氨基葡萄糖盐酸盐的浓度，RSD为0.62%，表明仪器的精密度和进样方法良好。结果如表3所示。

表3 精密度实验结果

实施例4

对本发明高效液相方法进行了方法学验证，开展了重现性实验。取氨基葡萄糖盐酸盐50 mg，5份，配制氨基葡萄糖盐酸盐水溶液，HPLC进样，测定氨基葡萄糖盐酸盐的峰面积，利用外标法计算其浓度，计算出RSD为1.76%，表明该方法具有良好的重现性，结果如表4所示。

表4 重现性实验结果

实施例5

对本发明高效液相方法进行了方法学验证，开展了稳定性实验。取氨基葡萄糖盐酸盐标准样品溶液（2.0 mg/ml）适量，过0.45 μm有机滤膜，分别在0、2、8、12、24 h进样检测，观察峰面积变化，RSD为1.08%。稳定性实验表明，在4℃保存条件下，氨基葡萄糖盐酸盐样品溶液24 h之内稳定性良好。结果如表5所示。

表5 稳定性实验结果

实施例6

对本发明对高效液相方法进行了方法学验证，开展了加标回收实验。取壳聚糖50 mg和氨基葡萄糖盐酸盐标准品15 mg，混合共5份，制备样品溶液，利用高效液相色谱测定氨基葡萄糖盐酸盐，观察其峰面积，并计算浓度以及样品的回收率，结果如表6所示，平均回收率为99.89%，RSD为2.23%，表明该方法测定的样品回收率高，稳定可靠。

表6 加标回收率实验结果

Claims (10)

1.一种测定壳聚糖含量的方法，其特征在于：将待测原料壳聚糖进行乙酰化处理生成甲壳素，而后对乙酰化制备的甲壳素进行酸水解得到氨基葡萄糖盐酸盐，通过对水解后得到的氨基葡萄糖盐酸盐进行高效液相色谱法测定，得其含量，进而转化计算得出原料壳聚糖的含量；

其中，HPLC色谱条件为：采用氨基色谱柱，检测器为蒸发光散射检测器，流动相为乙腈-水溶液（60:40，V/V），流速为0.5-1.0 mL/min，进样量为10-50 μL，柱温为25-45 ℃。

2.按权利要求1所述的测定壳聚糖含量的方法，其特征在于：所述通过高效液相色谱法测定数据由氨基葡萄糖盐酸盐标准曲线获得其含量；其中，标准曲线的绘制以氨基葡萄糖盐酸盐为标准品，加去离子水溶解，配制成不同浓度的一系列标准溶液，对所得不同浓度的标准溶液采用HPLC色谱条件进样检测，而后以氨基葡萄糖盐酸盐浓度为横坐标，对应的峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。

3.按权利要求2所述的测定壳聚糖含量的方法，其特征在于：所述配制一系列氨基葡萄糖盐酸盐标准溶液，其浓度分别为1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL、3.0 mg/mL、3.5 mg/mL；所述HPLC色谱条件为：采用氨基色谱柱，检测器为蒸发光散射检测器，流动相为乙腈-水溶液（60:40，V/V），流速为0.5-1.0 mL/min，进样量为10-50 μL，柱温为25-45℃。

4.按权利要求1或2所述的测定壳聚糖含量的方法，其特征在于：

1）试样准备：取壳聚糖试样置于烘箱中，烘干至恒重，备用；取烘干至恒重的壳聚糖试样适量，酸碱滴定法测定壳聚糖的脱乙酰度值；以甲醇为溶剂，取烘干至恒重的壳聚糖试样适量，加入乙酸酐，进行乙酰化反应，浓缩，将所得浓缩液冷冻干燥，得壳聚糖乙酰化制备甲壳素；

2）试样溶液的制备：取干燥至恒重的壳聚糖试样适量，加入浓盐酸和去离子水，进行酸水解，得壳聚糖酸水解试样溶液；取冷冻干燥得到的壳聚糖乙酰化制备甲壳素，加入浓盐酸和去离子水进行酸水解，得壳聚糖乙酰化制备甲壳素的酸水解试样溶液；

3）试样的测定：取水解液试样溶液适量，过0.45 μm有机滤膜，HPLC进样检测，由标准曲线获得氨基葡萄糖盐酸盐的浓度，计算得到壳聚糖的含量。

5.按权利要求4所述的测定壳聚糖含量的方法，其特征在于：所述壳聚糖试样需用粉碎机粉碎，过10-200目筛子，四分法采样至50-300 g，置于30-150 ℃烘箱中干燥至恒重，备用。

6.按权利要求4所述的测定壳聚糖含量的方法，其特征在于：所述步骤1）测定壳聚糖的脱乙酰度值，是将干燥后的壳聚糖试样溶解于5-80 mL浓度为0.05-1.0 mol/L的盐酸标准滴定溶液中，加入2-10滴甲基橙-苯胺蓝指示剂，而后用浓度为0.05-1.0 mol/L的氢氧化钠标准滴定溶液滴定过量的盐酸，计算得到壳聚糖的脱乙酰度值。

7.按权利要求6所述的测定壳聚糖含量的方法，其特征在于：所述0.05-1.0 mol/L的氢氧化钠标准滴定溶液，是由1.0-2.0 g氢氧化钠固体溶于500 mL去离子水中，再由盐酸标准滴定溶液滴定计算而得。

8.按权利要求4所述的测定壳聚糖含量的方法，其特征在于：所述步骤1）对壳聚糖进行乙酰化处理得到乙酰化制备甲壳素，是以甲醇为反应溶剂，加入乙酸酐，室温搅拌反应2-48h，而后减压浓缩回收溶剂，浓缩液冷冻干燥得壳聚糖乙酰化制备甲壳素。

9.按权利要求4所述的测定壳聚糖含量的方法，其特征在于：所述步骤2）取干燥至恒重的壳聚糖试样10-90 mg，加入2-8 mL盐酸和1-5 mL水，梯度升温酸水解，反应结束，去除剩余盐酸，加水溶解，配制得酸水解待测溶液；取壳聚糖乙酰化制备甲壳素10-90 mg，按照上述相同方法进行水解，配制得壳聚糖乙酰化制备甲壳素的酸水解试样溶液。

10.按权利要求9所述的测定壳聚糖含量的方法，其特征在于：所述梯度升温过程为20-50 ℃反应0.5-3 h，50-80 ℃反应0.5-3 h，80-120 ℃反应2-7 h。