CN106755389A - 用于鉴定瘿椒树性别的基因序列及其应用 - Google Patents

用于鉴定瘿椒树性别的基因序列及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于鉴定瘿椒树性别的基因序列，该基因序列用于鉴定瘿椒树的雄性及两性性别，利用该基因序列获取的SCAR分子标记引物，可快速简单判断瘿椒树雄性及两性性别。本发明提供的鉴定瘿椒树性别的SCAR标记引物，包括正向引物TS‑SCAR‑F和反向引物TS‑SCAR‑R，具体序列为：TS‑SCAR‑F：5＇‑ATCTTCATAGCCGCATAGCAAA‑3＇，TS‑SCAR‑R：5＇‑CCAAATCCTTCAACAATATACCTG‑3＇。本发明将获得的雄性特异性的SRAP分子标记成功转化为可以100％对瘿椒树不同性别进行鉴定的稳定，准确，简单的SCAR标记。应用本发明所提供的SCAR引物组合可以对人工栽培及不同地区野生居群瘿椒树性别进行准确鉴定，应用范围广泛。

Description

用于鉴定瘿椒树性别的基因序列及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学DNA分子标记检测技术领域，具体涉及到利用SCAR快速鉴定瘿椒树性别的方法。
背景技术
瘿椒树(Tapiscia sinensis Oliver.),也称银鹊树，为雄全异株繁育系统，雄全异株(Androdioecy)繁育系统是被子植物中最为罕见的一类，所以其又是研究被子植物繁育系统演化及植物进化生活史方面的重要材料。确定瘿椒树早期的性别有助于研究雄全异株植物性别决定的遗传原理，有助于理解植物繁育系统的进化与维持。另外，不同性别的瘿椒树具有不同的经济价值，因此在实际应用中，根据目的的不同可选择合适的性别比例进行栽培。
SRAP(Sequence Related Amplified Polymorphism，相关序列扩增多态性)标记是美国加州大学Li与Quiros于2001年在芸薹属植物中开发出来，一种基于PCR的新型分子标记技术。该标记具有简便、稳定、产率高、便于克隆目标片段等特点。SRAP分子标记电泳结果分辨率高，稳定性好，易于测序，被广泛使用在遗传多样性分析等分子生物学领域，但SRAP分子标记应用于植物性别鉴别研究很少。SCAR(Sequence Charactered AmplifiedRegion，序列特征化扩增区域)标记是1993年在RAPD等分子标记技术的基础上发展起来的。在获得一个与目标性状连锁的SRAP特异扩增 条带后，进行条带回收测序，重新设计一对特异性的引物，并利用此特异性引物进行基因组PCR，从而将SRAP标记转化为更加直观的通过“有和无”条带判别的稳定，简便，重复性好的固定标记SCAR标记。获得与瘿椒树性别决定基因紧密连锁的SCAR分子标记，目前未见有报道。
发明内容
鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种利用SCAR分子标记快速进行瘿椒树性别鉴定的方法，从而解决现有技术中无法准确快速进行瘿椒树早期性别鉴定的问题。
为解决上述问题，本发明采用以下技术方案来实现：
一种用于鉴定瘿椒树性别的基因序列：
ATTTCGCTAGGGTTTATAGCTTCTTACATCCTCTTCAGTCTTCTCAGTACCTCCCTTCCTATATAATCTTCATAGCCGCATAGCAAACCCTGGCTAGGGCTTCTTCTAATTTTCTCCGGTACTTTCTCTGTACTTTTCTCTGCATCTACCACTTTCAATATGATTTCTCTTTCCATTTTTTCATTTTGATCTGTTGATTTCAATTTTTTAGCTATGCATTTCTCTGTTTGTTTCGCGGGAAAACACTGAAAGTGAAAAAGAAAGAAAATTTTGGATCTCGAACTGATTCTGAGTGCCGATAGTATAAGACATTCCTTGTTTTAGTTATCCTTTTTATAGTAAATGTTCTAACTTTCAGTGATTGGTTTTTTTGATTTAGATCAGGTATATTGTTGAAGGATTTGGGTGTTATTGAATGTGTGTTTTGATGTATTG
所述基因序列用于鉴定瘿椒树的雄性及两性性别。
一种利用所述基因序列获取的SCAR标记引物，包括正向引物TS-SCAR-F和反向引物TS-SCAR-R，具体序列为：
TS-SCAR-F：5＇-ATCTTCATAGCCGCATAGCAAA-3＇；
TS-SCAR-R：5＇-CCAAATCCTTCAACAATATACCTG-3＇。
其中，TS为瘿椒树拉丁名Tapiscia sinensis首字母的缩写，F为正向引物，R为反向引物。
所述应用包括，建立SCAR-PCR标记体系，利用正向引物TS-SCAR-F和反向引物TS-SCAR-R，通过SCAR-PCR产物的检测鉴定瘿椒树的雄性及两性性别。
所述SCAR-PCR标记体系中的SCAR-PCR扩增体系包括：
所述DNA模板为瘿椒树叶片的基因组DNA。
所述SCAR-PCR产物的检测采用1％琼脂糖凝胶检测，以在分子量340bp位置处是否出现DNA条带来鉴别瘿椒树雄性和两性性别。若在分子量为340bp位置处出现DNA条带，为瘿椒树雄性植株的标志。如果在分子量为340bp位置处未出现DNA条带，为瘿椒树两性植株的标志。
本发明的有益效果是：
(1)本发明获得了一种用于鉴定瘿椒树性别的基因序列，并最终将该基因序列用于设计出SCAR标记引物，可以进行简单快速的鉴别。
(2)本发明将获得的雄性特异性的SRAP分子标记成功转化为可以100％对瘿椒树不同性别稳定，准确鉴定的简单的SCAR标记。
(3)应用本发明所提供的SCAR引物组合可以对人工栽培及不同地区野生居群瘿椒树性别进行准确鉴定，应用范围广泛。
(4)SCAR-PCR结束后利用琼脂糖凝胶肉眼就可以完成鉴定，大大节约了时间成本，实验室操作只需要2小时左右即可鉴定完成。
(5)SRAP标记序列为与瘿椒树性别决定基因紧密连锁的分子标记，这个标记的获得对于后续性别决定基因的定位及雄全异株植物形成的分子机制研究具有重要理论意义。
附图说明
图1是利用TS-F2和TS-R6结合进行SRAP-PCR产生一条只在雄性中出现的特异性条带的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图2是利用TS-SCAR-F，TS-SCAR-R结合进行SCAR-PCR对校园12棵人工栽培已知性别的植株进行引物准确性验证的琼脂糖凝胶电泳图。
图3是利用TS-SCAR-F，TS-SCAR-R结合进行SCAR-PCR对野外六个不同居群已知性别的植株进行引物准确性验证的琼脂糖凝胶电泳图。
图4是利用TS-SCAR-F，TS-SCAR-R结合进行SCAR-PCR对校园14棵未知性别的小苗植株进行引物准确性验证的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
本发明图2，图3，图4中M为DL2000Marker(TAKARA),表示雄性植株，表示两性植株，图2中1-12代表12课已知性别的植株。图3中1和2分别代表在不同居群取雄性植株两棵，两性植株两棵进行准确性验证。图4中1-14代表未知性别的14棵小苗植株进行准确性验证。图1-4中大写字母均为不同采样地的汉语首字母大写：XY校园，NS宁陕，SN神农，YS永顺，YL炎陵，XF息烽，YN云南。
实施例1
本实施例提供一种用于鉴定瘿椒树性别的基因序列，该基因序列的获取方法为：
1、采用TIANGEN的Plant Genomic DNA Kit对采集自七个地区(如表1所示)的瘿椒树雄性及两性植株进行基因组DNA提取。
具体步骤为：
(1)取硅胶干燥保存的植物叶片约30mg，加入液氮充分碾磨；
(2)将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μl 65℃预热缓冲液GP1的离心管中(实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1％)，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次；
(3)加入700μl氯仿，充分混匀，12,000rpm离心5min；
(4)小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700μl缓冲液GP2，充分混匀；
(5)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000rpm离心30sec，弃掉废液；
(6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
(7)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
(8)重复操作步骤7；
(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于37℃烘箱5分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
表1采自不同地区的供实验材料
字母编号 样地 材料采集详细地点
XY 校园 西北大学太白校区校园
NS 宁陕 陕西省宁陕县秦岭中段南麓
SN 神农 湖北省神农架林区
YS 永顺 湖南省永顺县小溪国家自然保护区
YL 炎陵 湖南省炎陵县大院农场
XF 息烽 贵州省息烽县永靖镇
YN 云南 云南省昆明市昆明市植物园
2.按照BSA(bulked segerant analysis，群体分离分析方法)将采集自不同地区的雄性及两性植株各两株的DNA取等量混合分别构建雄性DNA池和两性DNA池。
3.进行SRAP-PCR扩增及检测。SRAP-PCR扩增体系及扩增程序由本实验室预先优化方法获得(具体引物如表2所示)：
SRAP-PCR扩增体系如下：
SRAP-PCR扩增程序如下：
表2 SRAP引物列表
TS-F1 TGAGTCCAAACCGGATA TS-R1 GACTGCGTACGAATTAAT
TS-F2 TGAGTCCAAACCGGAGC TS-R2 GACTGCGTACGAATTTGC
TS-F3 TGAGTCCAAACCGGAAT TS-R3 GACTGCGTACGAATTGAC
TS-F4 TGAGTCCAAACCGGACC TS-R4 GACTGCGTACGAATTTGA
TS-F5 TGAGTCCAAACCGGAAG TS-R5 GACTGCGTACGAATTAAC
TS-F6 TGAGTCCAAACCGGACA TS-R6 GACTGCGTACGAATTGCA
TS-F7 TGAGTCCAAACCGGACG TS-R7 GACTGCGTACGAATTCAA
TS-F8 TGAGTCCAAACCGGACT TS-R8 GACTGCGTACGAATTCAC
TS-F9 TGAGTCCAAACCGGAGG TS-R9 GACTGCGTACGAATTCAG
TS-F10 TGAGTCCAAACCGGAAA TS-R10 GACTGCGTACGAATTCAT
TS-F11 TGAGTCCAAACCGGAAC TS-R11 GACTGCGTACGAATTCTA
TS-F12 TGAGTCCAAACCGGAGA TS-R12 GACTGCGTACGAATTCTC
TS-F13 TGAGTCCAAACCGGTTA TS-R13 GACTGCGTACGAATTCTG
TS-F14 TGAGTCCAAACCGGTCC TS-R14 GACTGCGTACGAATTCTT
TS-F15 TGAGTCCAAACCGGTGC TS-R15 GACTGCGTACGAATTGGT
TS-F16 TGAGTCCAAACCGGTAA TS-R16 GACTGCGTACGAATTGTC
TS-F17 TGAGTCCAAACCGGTAG TS-R17 GACTGCGTACGAATTTCG
TS-F18 TGAGTCCAAACCGGTTG TS-R18 GACTGCGTACGAATTATG
TS-F19 TGAGTCCAAACCGGTGT TS-R19 GACTGCGTACGAATTAGC
TS-F20 TGAGTCCAAACCGGTCA TS-R20 GACTGCGTACGAATTTAG
4.PCR产物用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。电泳、染色与显影简化程序步骤如下：
(1)用自来水将电泳仪的玻璃板冲洗干净，玻璃板第一次使用前要用先洗涤剂擦洗，然后冲洗干净，晾干备用；
(2)将晾干的带耳朵的玻璃板放在内侧，另一玻璃板在外侧，放入电泳槽；
(3)用TBE配制1％的琼脂糖溶液，加热溶解后，用玻璃棒引流，倒入电泳槽底部，将玻璃板封底。约20分钟后凝固；
(4)配制8％的聚丙烯酰胺凝胶，缓缓倒入两层玻璃板之间的缝隙。速度均匀，注意不要有气泡。插入梳子后，静置30分钟凝固后取下梳子进行 点样；
(5)设置稳压300V进行电泳，2小时；
(6)取出并分离玻璃板，将凝胶小心揭下，放入染色盘中，用清水冲洗一遍，在染色盘中倒入200ml染色液，放在摇床上匀速染色15分钟；
(7)将染色后的凝胶转移放入装有清水的显影盘中，用清水冲洗2-3遍，倒入显影液。将显影托盘放在摇床上，约10分钟后出现清晰条带；
(8)将显影的凝胶在胶片观察灯上拍照。
所用试剂配方：30％聚丙烯酰胺凝胶母液：聚丙烯酰胺145g，甲叉双丙烯酰胺5g，加纯水定容至500mL；8％聚丙烯酰胺凝胶工作液：纯水52.7mL，30％母液26.6mL，5×TBE溶液20mL，10％过硫酸铵溶液0.7mL，TEMED 0.065mL。
5.进行初步建池筛选获得84对可以在雄性DNA池或者两性DNA池出现特异差异条带的引物组合。具体引物组合列表如表3所示：
表3 84对可以在雄性DNA池或者两性DNA池出现特异差异的引物组合列表
F1 R6 R10 R17 R18
F2 R6 R10 R15
F3 R1 R2 R5 R9 R11 R16 R17
F4 R11 R12
F5 R4 R6 R7 R11
F6 R5 R6 R13 R17
F7 R1 R4 R5 R7 R11 R16
F8 R14
F9 R2 R3 R15
F10 R2 R3 R10 R13 R14 R15 R16 R18
F11 R1 R3 R6 R9 R13 R15
F12 R3 R4 R6 R7 R8 R13 R15
F13 R4 R9 R14 R16 R19
F14 R3 R4 R11 R17
F15 R1 R19
F16 R12
F17 R10 R12 R16 R17
F18 R3 R6 R7 R12 R13
F19 R3 R4 R11 R15 R19
F20 R9 R11 R19
6.对筛选获得的84对能够在雄性DNA池或者两性DNA池之间扩增产生明显，清晰，稳定的条带的引物进行验证。具体验证方法为：用10株已知性别的雄性及10株已知性别的两性进行SRAP-PCR，并用步骤4中8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。筛选结果表明TS-F2和TS-R6结合进行PCR能产生一条只在雄性中出现的特异性条带，雄性特异性条带位置如图1黑色箭头所示。如图1所示，M为DL2000Marker(TAKARA)，表示雄性植株，表示两性植株，数字1-10代表10棵不同的树。
TS-F2和TS-R6引物序列如下：
TS-F2：5′-TGAGTCCAAACCGGAGC-3′
TS-R6：5′-GACTGCGTACGAATTGCA-3′
7.对雄性特异性条带进行切胶回收，对胶回收产物直接送上海生工生物工程有限公司进行测序。测序获得的只在雄性植株中存在的基因序列。
实施例2
本实施例提供一种SCAR标记引物，具体步骤为：
1、将实施例1的测序结果利用Primer PREMIER 5.0进行特异性引物设计引物，从而将获得的雄性特异性的SRAP分子标记转化为SCAR标记。
特异性引物如下：
TS-SCAR-F：5＇-ATCTTCATAGCCGCATAGCAAA-3＇
TS-SCAR-R：5＇-CCAAATCCTTCAACAATATACCTG-3＇
2、SCAR-PCR扩增体系及扩增程序。将PCR产物用1％琼脂糖凝胶检测并进行切胶回收，连接到PMD19-T(TAKARA)载体，转化到DH5α感受态细胞，送上海生工测序，以确定所设计的SCAR特异引物可以扩增出实施例1中步骤7所获得的只在雄性植株中存在的基因序列。测序结果显示所设计的SCAR特异性引物可以成功扩增出实施例1中步骤7所获得的只在雄性植株中存在的基因序列。测序结果如附表中两下划线之间序列(前面下划线部分为TS-SCAR-F，后面下划线部分为TS-SCAR-R)：
SCAR-PCR扩增体系如下：
SCAR-PCR扩增程序如下：
实施例3
本实施例对所获得的基因序列以及按照该基因序列设计的TS-SCAR引物进行性别鉴定的正确性验证，具体验证方法如下：
1用已知性别植株进行引物正确性验证，DNA提取方法同实施例1，SCAR-PCR扩增体系及扩增程序同实施例2。
首先用12棵XY(校园)人工栽培居群中已知性别的植株进行验证，如图2所示，TS-SCAR引物准确的对校园12棵已知性别的植株进行了区分。然后用野外不同居群的雄性植株两棵，两性植株两棵进行准确性验证。如图3所示，TS-SCAR引物准确的对不同野外居群已知性别的植株进行了区分。图2,3中大写字母均为不同采样地的汉语首字母大写：XY校园，NS宁陕，SN神农，YS永顺，YL炎陵，XF息烽，YN云南。性别判断标准为：若在分子量为340bp位置处出现DNA条带，为瘿椒树雄性植株的标志。如果在分子量为340bp位置处未出现DNA条带，为瘿椒树两性植株的标志。
2.用14棵未知性别的小苗植株进行引物正确性验证，DNA提取方法同实施例1，SCAR-PCR扩增体系及扩增程序同实施例2。
用XY(校园)14棵未知性别的小苗植株进行验证，如图4所示，TS-SCAR引物可以准确的对校园14棵未性别的植株进行区分。
3.综合以上结果，应用本发明获取的基因序列及所提供的SCAR引物组合可以100％对人工栽培及不同地区野生居群瘿椒树性别进行准确鉴定。
用于鉴定瘿椒树性别的基因序列及其应用
正向引物TS-SCAR-F的核苷酸序列
5＇-ATCTTCATAGCCGCATAGCAAA-3＇
反向引物TS-SCAR-R的核苷酸序列
5＇-CCAAATCCTTCAACAATATACCTG-3＇
测序所得用于鉴定瘿椒树性别的基因序列为：
ATTTCGCTAGGGTTTATAGCTTCTTACATCCTCTTCAGTCTTCTCAGTACCTCCCTTCCTATATAATCTTCATAGCCGCATAGCAAACCCTGGCTAGGGCTTCTTCTAATTTTCTCCGGTACTTTCTCTGTACTTTTCTCTGCATCTACCACTTTCAATATGATTTCTCTTTCCATTTTTTCATTTTGATCTGTTGATTTCAATTTTTTAGCTATGCATTTCTCTGTTTGTTTCGCGGGAAAACACTGAAAGTGAAAAAGAAAGAAAATTTTGGATCTCGAACTGATTCTGAGTGCCGATAGTATAAGACATTCCTTGTTTTAGTTATCCTTTTTATAGTAAATGTTCTAACTTTCAGTGATTGGTTTTTTTGATTTAGATCAGGTATATTGTTGAAGGATTTGGGTGTTATTGAATGTGTGTTTTGATGTATTG 。
核苷酸序列表电子文件
<110>西北大学
<120>用于鉴定瘿椒树性别的基因序列及其应用
<141>
<160>
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>正向引物TS-SCAR-F
<220>
<223>
<400>1
ATCTTCATAGCCGCATAGCAAA
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>反向引物TS-SCAR-R
<220>
<223>
<400>2
CCAAATCCTTCAACAATATACCTG
<210>3
<211>435
<212>核苷酸
<213>用于鉴定瘿椒树性别的基因序列别
<220>
<223>
<400>3
ATTTCGCTAGGGTTTATAGCTTCTTACATCCTCTTCAGTCTTCTCAGTACCTCCCTTCCTATATA
ATCTTCATAGCCGCATAGCAAACCCTGGCTAGGGCTTCTTCTAATTTTCTCCGGTACTTTCTCTG
TACTTTTCTCTGCATCTACCACTTTCAATATGATTTCTCTTTCCATTTTTTCATTTTGATCTGTT
GATTTCAATTTTTTAGCTATGCATTTCTCTGTTTGTTTCGCGGGAAAACACTGAAAGTGAAAAAG
AAAGAAAATTTTGGATCTCGAACTGATTCTGAGTGCCGATAGTATAAGACATTCCTTGTTTTAGT
TATCCTTTTTATAGTAAATGTTCTAACTTTCAGTGATTGGTTTTTTTGATTTAGATCAGGTATAT
TGTTGAAGGATTTGGGTGTTATTGAATGTGTGTTTTGATGTATTG

Claims (6)

1.一种用于鉴定瘿椒树性别的基因序列，其特征在于，所述基因序列为SEQ ID No.3所示核苷酸序列。
2.权利要求1所述基因序列用于鉴定瘿椒树的雄性及两性性别的应用。
3.一种利用权利要求1所述基因序列获取的SCAR标记引物，其特征在于，所述SCAR标记引物包括SEQ ID No.1所示正向引物TS-SCAR-F和SEQ ID No.2所示反向引物TS-SCAR-R。
4.如权利要求2所述应用，其特征在于，建立SCAR-PCR标记体系，利用正向引物TS-SCAR-F和反向引物TS-SCAR-R，通过SCAR-PCR产物的检测鉴定瘿椒树的雄性及两性性别。
5.如权利要求4所述应用，其特征在于，所述SCAR-PCR标记体系中的SCAR-PCR扩增体系包括：
所述DNA模板为瘿椒树叶片的基因组DNA。
6.如权利要求4所述应用，其特征在于，所述SCAR-PCR产物的检测采用1％琼脂糖凝胶检测，以在分子量340bp位置处是否出现DNA条带来鉴别瘿椒树雄性和两性性别。
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