CN109374715A - 一种分子标记鉴定用聚丙烯酰胺凝胶制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分子标记多态性鉴定用聚丙烯酰胺凝胶制备方法，包括一下步骤：1)26％聚丙烯酰胺母液制备及贮存；2)1.5M的Tris‑HCl(pH 8.8)配制及贮存；3)10％g/ml的APS的配制及贮存；4)聚丙烯酰胺凝胶工作液制备及贮存；5)使用前在聚丙烯酰胺凝胶工作液中加入10％APS和TEMED得到混合物，所述聚丙烯酰胺凝胶工作液、10％APS以及TEMED的比例为30ml：200μL：50μL；6)进行电泳。本发明工艺简单、效率高，聚丙烯酰胺凝胶稳定性高，工作液能够长时间储存，将会大大节省药品成本，提高制胶效率，极大地确保分子标记鉴定的简易型和稳定性，为分子标记的多态性鉴定提供保障；同时利用本发明能够提高实验的精度和准确性，降低实验成本和实验人员工作量。

Description

一种分子标记鉴定用聚丙烯酰胺凝胶制备方法

技术领域

本发明涉及分子标记鉴定技术领域，尤其涉及一种简单、稳定、耐贮存的分子标记鉴定用聚丙烯酰胺凝胶制备方法。

背景技术

分子标记的鉴定是分子标记辅助选择、品种纯度筛选、基因克隆中最简便和常用的方法。目前，常用的分子标记有AFLP、RFLP、SSR、SNP以及Indel等。上述分子标记中，除SNP分子标记可通过荧光定量PCR仪根据熔解曲线鉴定之外，其他分子标记的鉴定几乎都依赖于聚丙烯凝胶电泳。在现有技术的实际实验中，由于熔解曲线鉴定SNP所需要的试剂耗材费用较高，一般情况下采用CAPS或dCAPS进行SNP分子标记的鉴定，同样依赖于电泳分离。因此，聚丙烯酰胺凝胶电泳在分子标记的鉴定中极其重要。

现有技术的分子标记的鉴定所用的聚丙烯酰胺凝胶制做存在着以下的问题：胶浓度不合适导致电泳分离不好，存在电泳条带弥散的现象，制胶过程复杂，工作液不能长期储存等，影响了实验的精度和准确性，增加了实验成本和实验人员工作量。因此，创制一种简单、稳定的聚丙烯酰胺凝胶制备技术体系，将会大大节省药品成本，提高制胶效率，为分子标记的多态性鉴定提供保障。

发明内容

本发明的目的就是为了解决现有技术存在的上述问题，提供一种分子标记鉴定用聚丙烯酰胺凝胶制备方法。本发明工艺简单、效率高，聚丙烯酰胺凝胶稳定性高，工作液能够长时间储存，将会大大节省药品成本，提高制胶效率，极大地确保分子标记鉴定的简易型和稳定性，为分子标记的多态性鉴定提供保障；同时利用本发明能够提高实验的精度和准确性，降低实验成本和实验人员工作量。

本发明所采用的技术方案为：

一种分子标记多态性鉴定用聚丙烯酰胺凝胶制备方法，包括以下步骤：

1)26％聚丙烯酰胺母液制备及贮存；

2)1.5M的Tris-HCl(pH 8.8)配制及贮存；

3)10％g/ml的APS的配制及贮存；

4)聚丙烯酰胺凝胶工作液制备及贮存；

5)使用前在聚丙烯酰胺凝胶工作液中加入10％APS和TEMED得到混合物，所述聚丙烯酰胺凝胶工作液、10％APS以及TEMED的比例为30ml:200μL:50μL；

6)进行电泳。

所述步骤1)称量8g的甲叉双丙烯酰胺，加入到2000ml的烧杯烧杯底部，称量252g丙烯酰胺单体加入到烧杯中，加入600ml的水，搅拌直至完全溶解，最后在量筒中定容至1000ml，避光在4℃条件下保存。

所述步骤2)在另一个烧杯里加入磁棒，将烧杯置于搅拌仪器上，称取181.5g的Tris放入烧杯，烧杯中加入800ml水并搅拌，加入浓盐酸，用PH计调节PH至8.8，形成Tris-HCl(pH 8.8)液。

所述Tris-HCl(pH 8.8)液在高温高压灭菌后，在4℃条件下保存。

所述步骤3)中10％g/ml的APS通过称取1g过硫酸铵定容至10ml得到，APS在4℃条件下保存。

所述步骤4)将26％聚丙烯酰胺母液、1.5M的Tris-HCl(PH 8.8)以及纯水按1:1:1等体积混匀，得到可凝胶，可凝胶避光在4℃条件下保存。

所述步骤5)在室温条件下，混合物经过10～30min得到可凝胶。

本发明的有益效果：

1.本发明公开一种简单、稳定的聚丙烯酰胺凝胶制备的方法和体系，用于分子标记的筛选和鉴定。主要包括丙烯酰胺母液、10％APS、1.5M Tris-HCl(pH8.5)、Tris-Gly电泳缓冲液的配制以及聚丙烯酰胺工作液的配制等。本发明工艺简单，工作液能够长时间储存，大大节省药品成本，提高制胶效率，为分子标记的多态性鉴定提供保障。

2.本发明能够提高实验的精度和准确性，降低实验成本和实验人员工作量。本发明中所采用的的聚丙烯酰胺凝胶浓度，在20cm的电泳槽中，可以区分5个碱基的差异，在鉴定分子标记的多态性中具有极高的精度和准确性。

3.本发明聚丙烯酰胺凝胶制备方法及体系方法简单且稳定，所用药品均可在4℃冰箱中保存较长时间(除10％APS不能长久放置之外，其他药品均可放置半年以上)，避免每次配制时的繁琐步骤，降低实验成本和实验人员工作量。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

一种分子标记多态性鉴定用聚丙烯酰胺凝胶制备技术体系，包括以下步骤:

1)26％聚丙烯酰胺母液制备，具体方式为：

取一个2000ml的烧杯，称量8g的甲叉双丙烯酰胺，加入到烧杯中(其不易溶解，易形成团，所以要将其加到底部)；称量252g丙烯酰胺单体加入到烧杯中，加入600ml的水，搅拌直至完全溶解。最后在量筒中定容至1000ml。避光和4℃条件下，可保存半年以上。

2)1.5M的Tris-HCl(pH 8.8)配制及贮存，具体方式为：

取一个烧杯，里面加入磁棒，置于搅拌仪器上，称取181.5g的Tris，加入800ml水，搅拌，加入约20ml浓盐酸，用PH计调节PH至8.8。高温高压灭菌后(也可以不灭)，4℃条件下可保存半年以上。

3)10％(W/V即质量体积比；g/ml)APS(过硫酸铵)，具体方式为：

称取1g过硫酸铵定容至10ml，4℃条件下保存，有效期控制在10天以内。

4)聚丙烯酰胺凝胶工作液制备，具体方式为：

将26％聚丙烯酰胺母液、1.5M的Tris-HCl(PH 8.8)以及纯水按1:1:1等体积混匀，避光和4℃条件下，可保存3个月。

5)使用前加入APS和TEMED，聚丙烯酰胺凝胶工作液、10％APS以及TEMED的比例为30ml：200μL：50μL。在室温条件下，大约10～30min，可凝胶。

6)进行电泳。

本发明聚丙烯酰胺凝胶制备方法及体系方法简单且稳定，所用药品均可在4℃冰箱中保存较长时间(除10％APS不能长久放置之外，其他药品均可放置半年以上)，避免每次配制时的繁琐步骤。

本发明用于分子标记的筛选和鉴定，方法简单、稳定可靠性高。主要通过丙烯酰胺母液、10％APS、1.5M Tris-HCl(pH 8.5)、Tris-Gly电泳缓冲液的配制以及聚丙烯酰胺工作液的配制完成，本发明简化了聚丙烯酰胺工作液配制方法，且能够长期保存。本发明可节约成本，简单高效、稳定地制备聚丙烯酰胺凝胶，极大程度上确保了分子标记鉴定的简易型和稳定性。

基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

Claims (7)

1.一种分子标记多态性鉴定用聚丙烯酰胺凝胶制备方法，其特征是，包括以下步骤：

1)26％聚丙烯酰胺母液制备及贮存；

2)1.5M的Tris-HCl(pH 8.8)配制及贮存；

3)10％g/ml的APS的配制及贮存；

4)聚丙烯酰胺凝胶工作液制备及贮存；

5)使用前在聚丙烯酰胺凝胶工作液中加入10％APS和TEMED得到混合物，所述聚丙烯酰胺凝胶工作液、10％APS以及TEMED的比例为30ml：200μL：50μL；

6)进行电泳。

2.如权利要求1所述的一种分子标记多态性鉴定用聚丙烯酰胺凝胶制备方法，其特征是，所述步骤1)称量8g的甲叉双丙烯酰胺，加入到2000ml的烧杯烧杯底部，称量252g丙烯酰胺单体加入到烧杯中，加入600ml的水，搅拌直至完全溶解，最后在量筒中定容至1000ml，避光在4℃条件下保存。

3.如权利要求1所述的一种分子标记多态性鉴定用聚丙烯酰胺凝胶制备方法，其特征是，所述步骤2)在另一个烧杯里加入磁棒，将烧杯置于搅拌仪器上，称取181.5g的Tris放入烧杯，烧杯中加入800ml水并搅拌，加入浓盐酸，用PH计调节PH至8.8，形成Tris-HCl(pH8.8)液。

4.如权利要求3所述的一种分子标记多态性鉴定用聚丙烯酰胺凝胶制备方法，其特征是，所述Tris-HCl(pH 8.8)液在高温高压灭菌后，在4℃条件下保存。

5.如权利要求1所述的一种分子标记多态性鉴定用聚丙烯酰胺凝胶制备方法，其特征是，所述步骤3)中10％g/ml的APS通过称取1g过硫酸铵定容至10ml得到，APS在4℃条件下保存。

6.如权利要求1所述的一种分子标记多态性鉴定用聚丙烯酰胺凝胶制备方法，其特征是，所述步骤4)将26％聚丙烯酰胺母液、1.5M的Tris-HCl(PH 8.8)以及纯水按1:1:1等体积混匀，得到可凝胶，可凝胶避光在4℃条件下保存。

7.如权利要求1所述的一种分子标记多态性鉴定用聚丙烯酰胺凝胶制备方法，其特征是，所述步骤5)在室温条件下，混合物经过10～30min得到可凝胶。