CN104059971A - 一种芸薹属异源六倍体的ssr分子标记方法及其引物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种芸薹属异源六倍体的SSR分子标记方法及其引物。芸薹属异源六倍体的SSR分子标记方法包括：取芸薹属异源六倍体亲本进行杂交，对获得的子代进行小孢子培养，获得DH群体；提取芸薹属异源六倍体亲本及DH群体的基因组DNA，以各基因组DNA为模板，利用引物进行PCR扩增；根据PCR扩增结果构建芸薹属异源六倍体的遗传图谱；所述引物包括217对，其碱基序列分别如SEQ ID No.1/2～433/434所示本发明构建了第一个芸薹属异源六倍体的遗传图谱，为进一步进行QTL定位以及分子标记辅助育种提供依据。

Description

一种芸薹属异源六倍体的SSR分子标记方法及其引物
技术领域
本发明涉及植物分子标记技术，具体涉及一种芸薹属异源六倍体的SSR分子标记方法及其引物。
背景技术
芸薹属(Brassica spp.)是十字花科(Brassicaceae,曾名Cruciferae)植物中最为重要的一个属。在我国，芸薹属作物的种植非常广泛，包括许多重要的蔬菜、油料、药用及饲料作物。由禹氏三角(U N.Genomic analysis in Brassica with special reference to the experimental formation of B.napusand peculiar mode of fertilization[J].The Journal of Japanese Botany,1935,7:389-452)可知，三个异源四倍体【甘蓝型油菜(B.napus，2n＝38，AACC)、芥菜型油菜(B.juncea，2n＝34，AABB)和埃塞俄比亚芥(B.carinata，2n＝36，BBCC)】分别是来源于三个二倍体种【白菜型油菜(B.rapa，2n＝20，AA)、甘蓝(B.oleracea,2n＝18，CC)、黑芥(B.nigra，2n＝16，BB)】的基因组。植物多倍化后由于多个染色体组的累积效应使其表现出许多新的表型，更适合农业生产上的需要。芸薹属A、B、C三个基因组被认为是起源于一个古老的六倍体的祖先(Lysak M A,et al.Chromosometriplication found across the tribe Brassiceae[J].Genome Research,2005,15:516–525)。在自然界中，不存在含有A、B和C三个基因组的六倍体芸薹属植物(AABBCC)，然而可以通过人工方法合成出包含三个基因组的芸薹属新植物。
在近期研究中，Pradhan等人在文献(Successful induction of trigenomic hexaploid Brassica froma triploid hybrid of B.napus.and B.nigra Koch.Euphytica,2010,176:87–98)及文献(Synthesis of aBrassica trigenomic allohexaploid(B.carinata×B.rapa)de novo and its stability in subsequentgenerations.Theor Appl Genet,2010,121:1431–1440)中，通过芸薹属不同物种之间的杂交(B.napus×B.nigra,B.carinata×B.rapa)人工合成了包含A、B、C全部基因组的异源六倍体芸薹属新植物。据推测，这些异源六倍体芸薹属新植物将能够适应较强的气候变化，具有抗热和抗干旱的能力，耐重金属或耐盐碱地上生长缓冲能力可能会比传统的二倍体或四倍体的亲属物种高得多。
芸薹属很多农艺性状都受多基因控制，其遗传改良较为复杂。通过分子标记对异源六倍体芸薹属新植物进行早期选择、预测，利用遗传图谱，把优良的基因分离出来，对多基因控制的复杂的性状进行遗传改良，可以提高目标基因的选择效率，加速育种进程。常见的分子标记包括AFLP、RAPD、SRAP、SSR，其中SSR(Simple Sequence Repeat，简单重复序列)标记，又叫微卫星(Microsatellites)标记，具有数量丰富、共显性、重复性、实验操作简单等优点，越来越多的应用在遗传图谱的构建、遗传多样性分析、指纹图谱分析中。
迄今为止，虽然芸薹属二倍体和四倍体物种的分子标记及遗传图谱的构建已有报道，但是异源六倍体芸薹属新植物的分子标记及遗传图谱的构建尚未见报道。
发明内容
本发明提供了一组用于构建芸薹属异源六倍体遗传图谱的引物，这些引物能特异性地扩增出芸薹属异源六倍体中含有的SSR分子标记，利用这些SSR分子标记能构建出芸薹属异源六倍体的遗传图谱。
用于构建芸薹属异源六倍体遗传图谱的引物，包括217对，其碱基序列分别如SEQ IDNo.1/2～433/434所示。
与常见的芸薹属二倍体和四倍体相比，芸薹属异源六倍体中含有更多的同源序列，通过常规方法设计SSR分子标记的扩增引物会产生更多的非特异性条带，扩增结果不可信。本发明的这组引物是通过如下方法设计并筛选获得的：
1)从美国国家生物技术信息中心(NCBI)中搜索芸薹属近缘种的CDS序列；
2)利用Clustal W等软件对序列进行处理：根据相似性程度剔除冗余的CDS序列，再剔除过短的CDS序列(小于100bp)和过长的CDS序列(大于700bp)；
3)利用Repeatmasker等软件结合人工搜索，获得含有SSR的CDS序列；
4)根据CDS序列中的SSR序列，利用Primer primer5.0设计了341对引物；
5)利用上述设计的341对引物对芸薹属异源六倍体(AABBCC，n＝27)亲本进行PCR扩增，筛选出了在父母本中均具有SSR多态性的223对核心引物，其碱基序列分别如SEQ IDNo.1/2～445/446所示。
在筛选核心引物时，可采用梯度PCR或Touch Down PCR进行。其中，若采用梯度PCR进行筛选，则先利用梯度PCR筛选出每一对引物的最佳退火温度，然后在最佳退火温度下，利用相应的引物分别对父母本进行普通PCR扩增，检测目标条带是否存在差异，若存在差异，则该引物为核心引物，反之则不是。若采用Touch Down PCR进行筛选，则无需筛选引物的最佳退火温度，直接利用引物分别对父母本进行Touch Down PCR，检测目标条带是否存在差异，若存在差异，则该引物为核心引物，反之则不是。
梯度PCR能够筛选出相应引物的最佳退火温度，在该最佳退火温度下进行扩增时产生的非特异性条带最少；而Touch Down PCR能显著提高目标条带的亮度，从而与非特异性条带区分开来，提高扩增特异性。
本发明还提供了所述引物在制备用于构建芸薹属异源六倍体遗传图谱的试剂盒中的应用。所述用于构建芸薹属异源六倍体遗传图谱的试剂盒中包含有本发明所述的223对引物。
本发明还提供了一种芸薹属异源六倍体的SSR分子标记方法，包括：
(1)取芸薹属异源六倍体(AABBCC，n＝27)亲本进行杂交，对获得的杂交子代进行小孢子培养，获得DH群体；
本发明中，所述芸薹属异源六倍体(AABBCC，n＝27)亲本均在文献(Successful induction oftrigenomic hexaploid Brassica from a triploid hybrid of B.napus.and B.nigra Koch.Euphytica,2010,176:87–98)及文献(Synthesis of a Brassica trigenomic allohexaploid(B.carinata×B.rapa)de novoand its stability in subsequent generations.Theor Appl Genet,2010,121:1431–1440)有所报道。其中，父本为芸薹属异源六倍体(AABBCC，n＝27)7H170-1，由白菜型油菜(B.rapa，AA，n＝10，)和埃塞俄比亚芥(B.carinata，BBCC，n＝18)杂交获得；母本为芸薹属异源六倍体(AABBCC，n＝27)Y54-2，由甘蓝型油菜(B.napus，AACC，n＝19)和黑芥(B.nigra，BB，n＝8)杂交获得。
芸薹属异源六倍体7H170-1和Y54-2之间的遗传差异性大，对杂交子代进行细胞遗传学研究发现其染色体数目稳定、均为54条，且花粉活性较高，种子产量也高。对杂交子代进行小孢子培养时发现，其产生的DH群体较大，明显优于其他组合，因而选用这个杂交组合。
(2)提取芸薹属异源六倍体(AABBCC，n＝27)亲本及DH群体的基因组DNA，以各基因组DNA为模板，利用所述的SSR引物进行PCR扩增；
作为优选，采用CTAB法提取基因组DNA；并且，由于植物的次生代谢物对核酸提取有干扰作用，但幼嫩的新生组织次生代谢物较少、DNA含量高、易于破碎，因此选取芸薹属异源六倍体(AABBCC，n＝27)亲本及DH群体的幼嫩叶片进行基因组DNA的提取。
进行PCR扩增时，可采用普通PCR或Touch Down PCR，视筛选核心引物时采用的PCR方法而定。若此前是采用梯度PCR进行核心引物筛选的，则此时采用普通PCR进行扩增即可；若此前是采用Touch Down PCR进行核心引物筛选的，则此时仍旧采用Touch Down PCR进行扩增。
当采用Touch Down PCR进行扩增时，优选采用下述扩增体系(10μL)：
1μL 10×PCR Buffer(含Mg2+)，1μL dNTP(2.5mmol/L)，1μL模板DNA(50ng/μL)，0.1μLTaq DNA聚合酶(5U/μL)，正反向引物各0.5μL(10ng/μL)，ddH2O补足至10μL；
以及下述扩增程序：
94℃预变性3min，94℃变性30s，65℃退火45s，72℃延伸1min，每2个循环降1℃，共20个循环；94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，共10个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
与常规的Touch Down PCR相比，本发明降低了反应体系中引物和Taq DNA聚合酶的浓度，减少了非特异性引物的产生；提高了反应程序中退火温度的上限(本发明为65℃，常规的为60～62℃)、降低了循环次数(本发明为10次，常规的为12～20次)，提高扩增特异性，有效减少了非特异性产物的产生。
(3)根据PCR扩增结果构建芸薹属异源六倍体(AABBCC，n＝27)杂交子代的遗传连锁图谱。
对PCR扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据电泳结果剔除偏分离的SSR分子标记，再利用生物学软件JoinMap4.0构建芸薹属异源六倍体(AABBCC，n＝27)杂交子代的遗传连锁图谱。
进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)时，PCR扩增产物的泳动速度主要由其分子量决定，因此可较为准确地反应出PCR扩增产物的长度大小，保证扩增结果的准确性。
作为优选，进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时通过银染显色。与其他的染色方法相比，银染的灵敏性更高。具体染色方法为：
①染色：电泳完毕以后，小心撬开两块玻璃板，除去琼脂糖密封条，将凝胶放入银染液中染色30min；
②水洗：用双蒸水冲洗两次，每次30s；
③显色：加入显影液至出现清晰条带为止；
④保存：在蒸馏水中终止反应，观察并拍照保存。
与传统的染色方法相比，本发明通过“四步法”获得的胶版显色更为均匀，条带更加清晰，便于观察和记录，并且染色步骤大大简化，减少实验耗时。
本发明中，剔除偏分离SSR分子标记的方法是：对DH群体的电泳结果进行χ2检验，分析每一SSR分子标记是否符合孟德尔分离定律，在5％的显著水平下找到偏分离的SSR分子标记并将其剔除。筛选出6个偏分离的SSR分子标记，这6个SSR分子标记所对应的扩增引物分别如SEQID No.435/436～445/446所示。与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明针对现有芸薹属异源六倍体提供了一种分子标记的方法，由于芸薹属异源六倍体是一种人工合成的芸薹属新品种，本发明构建了第一个芸薹属异源六倍体的遗传图谱，为进一步进行QTL定位以及分子标记辅助育种提供依据；
(2)本发明针对芸薹属异源六倍体，筛选出核心引物217对，这217对核心引物能对芸薹属异源六倍体的SSR分子标记进行特异性扩增，建立了高效、准确的分子标记技术体系；
(3)本发明的PCR扩增采用了Touch Down PCR扩增程序，不用根据具体引物设定具体的退火温度，提高了PCR扩增效率；并采用10μL的反应体系，提高了实验效率和准确性。
附图说明
图1为随机选取的父母本及DH群体中的7个样品的基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图；
图2a为利用梯度PCR筛选引物BrGMS3124的最佳退火温度时的电泳图；
图2b为低退火温度上限和高循环次数下的琼脂糖电泳对比图；
图3为利用引物BrGMS139扩增亲本及DH群体的变性聚丙烯酰氨凝胶电泳图；
图4a～图4j为薹属异源六倍体杂交子代A基因组中的第一至十条染色体的遗传图谱；
图5a～图5h为薹属异源六倍体杂交子代B基因组中的第一至八条染色体的遗传图谱；
图6a～图6i为薹属异源六倍体杂交子代C基因组中的第一至九条染色体的遗传图谱。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
1、主要试剂配制
(1)DNA提取试剂配方
①0.5mol/L EDTA(pH＝8)：称取Na2EDTA·2H2O 186.1g，加入去离子水800mL，置于磁力搅拌器上充分搅拌，用NaOH调节pH至8.0(约20g NaOH)，当pH接近8.0时，EDTA方可完全溶解，加入去离子水定容至1L，分装后高压灭菌，室温保存。
②1mol/L Tris–HCL(pH＝8.0)：在800mL水中溶解121.1g Tris，待溶液冷却至室温后加入42mL浓HCl调节pH至8，加水定容至1L，分装后高压灭菌。
③DTT：在32.4mL水中溶解5g DTT，分装后储存于-20℃冰箱。
④CTAB抽提缓冲液：量取1mol/L Tris-HCl 10mL，0.5mol/L EDTA4mL，称取CTAB2g，NaCl8.2g，加水定容成100mL，高压灭菌。
(2)PCR扩增试剂配制
引物：将引物离心数秒，使DNA沉积到管底。用ddH2O分别配置上引物和下引物至终浓度为10ng/μL。
(3)琼脂糖凝胶电泳试剂配制
50×TAE：称取Tris242g，量取冰乙酸57.2mL，0.5mol/L EDTA100mL，定容至1L，高压灭菌。使用时稀释50倍。
(4)变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳试剂配制
①10×TBE：称取Tris108g，硼酸55g，量取EDTA(0.5mol/L，PH＝8.0)40mL，双蒸水定容至1L。
②10％过硫酸铵(APS)：称取APS10g，加水定容到100mL。
③Binding Silence：量取95％乙醇200mL，冰醋酸1mL，Binding Silence 600μL，定容至200mL。
④Repel Silence：量取190mL氯仿(三氯甲烷)，10mL Repel试剂，混匀。
⑤变性Buffer：量取甲酰胺49mL，0.5mol/L EDTA2mL，称取二甲苯青0.125g，溴酚蓝0.125g，加水定容至50mL。
⑥变性Marker：用移液枪吸取DL500DNA Ladder10μL，变性Buffer4μL，混匀。
⑦10×TBE：称取Tris108g，硼酸55g，量取0.5mol/L EDTA40mL，定容至1L。
⑧胶溶液：称取尿素420g，量取40％丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺150mL，10×TBE100mL，定容至1L。
(5)银染试剂配制
①染色液(ACS试剂)：称取AgNO3 1.5g，加水1.5L。
②显影液：称取NaOH22.5g，量取甲醛6mL，加水1.5L。
2、材料获取
亲本7H170-1和Y54-2的人工杂交方法参见文献(Successful induction of trigenomic hexaploidBrassica from a triploid hybrid of B.napus.and B.nigra Koch.Euphytica,2010,176:87–98)及文献(Synthesis of a Brassica trigenomic allohexaploid(B.carinata×B.rapa)de novo and its stability insubsequent generations.Theor Appl Genet,2010,121:1431–1440)。
根据公开号为CN 102362579B的中国专利文献公开的方法构建DH群体，包括196个DH系。
3、提取DNA
(1)DNA提取
采用CTAB法提取供试样品的DNA，具体步骤为：
①取适量2％CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热；
②取少量异源六倍体芸薹属新植物叶片(约2g)置于研钵中，用液氮磨至粉状，转移至装有4mL的2％CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；
③取800mL上层混合液转入至2mL灭菌管内，加等体积氯仿异戊醇混合液(氯仿：异戊醇＝24:1)摇匀，65℃水浴15-20min，12000rpm离心5min；
④取上清液至2mL灭菌离心管中，加等倍体积异丙醇(-20℃)，轻轻颠倒，置于-20℃冰箱中沉淀20min；
⑤挑出絮状沉淀至2mL离心管中，用70％的乙醇洗涤2次，每次20min，5000rpm瞬时离心，用小枪头吸干多余乙醇，放超净台上吹干。
⑥粗提DNA溶于200μL灭菌双蒸水，充分溶解后加入RNA消化酶37℃水浴1h，放入-20℃备用。
(2)检测DNA
取3μL DNA样品液，分别在超微紫外分光光度计上测量其DNA含量，A260nm/A280nm的值，及其在260nm处的吸收峰，检测DNA的纯度。
检测结果表明DNA含量在2000-4000ng/μL之间，A260nm/A280nm的值在1.8左右，在260nm处有吸收峰，表明提取的DNA浓度较高，纯度较好。
取5μL DNA样品，加入1μL6×Loading Buffer，用浓度为1％含核酸染料的琼脂糖凝胶电泳检测，TAE缓冲液作为电泳缓冲液，120mV电泳30min后在BIO-RAD凝胶成像仪中检测DNA的完整性。检测结果见图1。
由图1可见，DNA条带都比较亮，并且无杂带和二聚体产生；表明提取的DNA完整性较好。
4、引物筛选
(1)引物设计
①从美国国家生物技术信息中心(NCBI)中搜索芸薹属近缘种的CDS序列；
②利用Clustal W等软件对序列进行处理：根据相似性程度剔除冗余的CDS序列，再剔除过短的CDS序列(小于100bp)和过长的CDS序列(大于700bp)；
③利用Repeatmasker等软件结合人工搜索，获得含有SSR的CDS序列；
④根据CDS序列中的SSR序列，利用Primer primer5.0设计了341对引物。
(2)核心引物筛选
可通过下列两种方法筛选核心引物：
1)梯度PCR筛选核心引物
①确定引物的最佳退火温度
PCR反应体系为10μL反应体系，含Taq DNA聚合酶0.5U，dNTP0.25mmol/L，正反向引物各0.5μmol/L，1×PCR Buffer(含Mg2+)，模板DNA50ng。
PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，48℃退火45s，梯度＝10℃，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
取出反应管，分别取各退火温度下的PCR产物，加入1μL6×Loading Buffer，用浓度为1％含核酸染料的琼脂糖凝胶电泳检测，TAE缓冲液作为电泳缓冲液，120mV电泳30min后在BIO-RAD凝胶成像仪中检测产物特异性及产量，确定最佳退火温度。
以引物BrGMS3124(SEQ ID No.83/84)为例，其最佳退火温度的筛选结果见图2a。
②筛选核心引物
在最佳退火温度下，利用相应的引物分别对父母本进行普通PCR扩增，检测目标条带是否存在差异，若存在差异，则该引物为核心引物，反之则不是。
PCR反应体系为10μL反应体系，含Taq DNA聚合酶0.5U，dNTP0.25mmol/L，正反向引物各0.5μmol/L，1×PCR Buffer(含Mg2+)，模板DNA50ng。
PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，相应的最佳退火温度下退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
筛选出223对核心引物，碱基序列见序列表中所示的SEQ ID No.1/2～445/446。
2)Touch Down PCR筛选核心引物
以父母本的基因组DNA为模板，分别利用各引物，按照下列反应体系和反应程序进行TouchDown PCR扩增，选取能在父母本中扩增出特异性条带，并且特异性强的引物作为核心引物。
PCR反应体系为10μL反应体系，含Taq DNA聚合酶0.5U，dNTP0.25mmol/L，正反向引物各0.5μmol/L，1×PCR Buffer(含Mg2+)，模板DNA50ng。
PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，65℃退火45s，72℃延伸1min，每2个循环降1℃，共20个循环；94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，共10个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
以60℃作退火温度上限为对比例，引物采用BrGMS2969，与上述PCR扩增程序进行比较，见图2b。由图2b可见，1-8号是60℃作为退火温度上限的扩增结果，9到16号是上述扩增程序的扩增结果，可见上述扩增程序下目标条带更亮且无非特异性条带。
以循环次数为20次作对比例，引物采用BrGMS2969，与上述PCR扩增程序进行比较，见图2b。由图2b可见，9到16号是上述扩增程序的扩增结果，17到24号是20次循环的结果，可见上述扩增程序下目标条带更亮且无非特异性条带。
5、芸薹属异源六倍体的SSR分子标记方法
利用筛选获得的核心引物，构建芸薹属异源六倍体杂交子代的遗传图谱。具体包括：
(1)根据第1部分的方法提取芸薹属异源六倍体亲本和DH群体的基因组DNA，以各基因组DNA为模板，利用筛选获得的核心引物，进行Touch Down PCR；
PCR反应体系为10μL反应体系，含Taq DNA聚合酶0.5U，dNTP0.25mmol/L，正反向引物各0.5μmol/L，1×PCR Buffer(含Mg2+)，模板DNA50ng。
PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，65℃退火45s，72℃延伸1min，每2个循环降1℃，共20个循环；94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，共10个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
(2)对PCR扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；
具体包括：
1)PAGE凝胶制作
①清洗玻璃板：用去离子水擦洗2次玻璃板，然后用无水乙醇擦洗2次；
②擦拭硅烷：干燥后，短玻璃板用剥离硅烷擦拭均匀，长玻璃板用亲和硅烷擦拭均匀。
③制胶：安装好制胶板，缓缓灌入6％PAGE序列分析胶溶液，凝胶成分包括6％聚丙烯酰胺、0.1％过硫酸铵、0.1％TEMED，避免产生气泡。倒插鲨鱼齿梳子，用夹子夹住玻璃板，水平仪调水平，聚合1h以上备用。
2)电泳
①预电泳：将聚合好胶的玻璃板安装在电泳槽上，拧紧卡槽，防止漏液，在上下电泳槽中加入足量的1×TBE缓冲液，拔出梳子，并观察加样孔是否有气泡产生，如有气泡，需要用移液枪赶走所有气泡，以免影响上样。然后顺插100孔鲨鱼齿梳子形成点样孔，1000V恒电压预电泳30min。
②上样与电泳：电泳之前，将10μLPCR扩增产物加入4μL变性Buffer充分混合，95℃变性5min，立刻转移到冰中冰浴，每个样品取3μL点样。用DL500DNA Ladder作为Marker，以标识目标片段的大小。电泳槽(仪)选择DYCZ-20C，电源采用DYY-10C，1500V下电泳1h。
3)银染
①染色：电泳完毕以后，小心撬开两块玻璃板，除去琼脂糖密封条，将凝胶放入银染液(0.2％AgNO3)中染色30min；
②水洗：用双蒸水冲洗两次，每次30s；
③显色：加入显影液(NaOH1.5％+HCHO0.4％)至出现清晰条带为止；
④保存：在蒸馏水中终止反应,在灯座上观察并拍照保存；
每一对核心引物要都对亲本和DH群体进行扩增，获得两张(共198个样品，每张点样99个)变性聚丙烯酰氨凝胶电泳图，共获得223张变性聚丙烯酰氨凝胶电泳图。
图3所示的是采用引物BrGMS139(SEQ ID No.145/146)对亲本和DH群体(第1～98号DH系)进行扩增后的变性聚丙烯酰氨凝胶电泳图。
(3)根据电泳结果构建芸薹属异源六倍体杂交子代的遗传图谱；
DH群体中，若与父本7H170-1分离出相同片段，则记录为“A”；若与母本Y54-2分离出相同片段，则记录为“B”；看不清或者缺失的，则记录为“U”。对于能被扩增出多位点或者双位点的SSR分子标记来说，根据DNA片段的大小顺序在SSR分子标记的名称后面加上小写字母(a、b、c等)来区别。
对记录的数据进行χ2检验，分析每一SSR分子标记是否符合孟德尔分离定律(理论分离比是1:1)，在5％的显著水平下找到偏分离的SSR分子标记并将其剔除；筛选出6个偏分离的SSR分子标记，这6个SSR分子标记所对应的扩增引物分别如SEQ ID No.435/436～445/446所示。
剔除偏分离分子标记后，利用JoinMap4.0来构建遗传图谱，利用Kosambi功能将重组频率转换为图距(厘摩，cM)，将大多数的连锁群的LOD值设定在4-9之间。杂交子代中，A基因组的遗传图谱见图4a～4j，B基因组的遗传图谱见图5a～5h，C基因组的遗传图谱见图6a～6i。

Claims (9)

1.用于构建芸薹属异源六倍体遗传图谱的引物，其特征在于，包括217对，其碱基序列分别如SEQ ID No.1/2～433/434所示。
2.一种用于构建芸薹属异源六倍体遗传图谱的试剂盒，其特征在于，包含有如权利要求1所述的引物。
3.一种芸薹属异源六倍体的SSR分子标记方法，包括：
(1)取芸薹属异源六倍体亲本进行杂交，对获得的杂交子代进行小孢子培养，获得DH群体；
(2)提取芸薹属异源六倍体亲本及DH群体的基因组DNA，以各基因组DNA为模板，利用如权利要求1所述的引物进行PCR扩增；
(3)根据PCR扩增结果构建芸薹属异源六倍体杂交子代的遗传图谱。
4.如权利要求3所述的SSR分子标记方法，其特征在于，所述芸薹属异源六倍体亲本中，父本为芸薹属异源六倍体7H170-1，由白菜型油菜(Brassica.rapa)和埃塞俄比亚芥(B.carinata)杂交获得；母本为芸薹属异源六倍体Y54-2，由甘蓝型油菜(B.napus)和黑芥(B.nigra)杂交获得。
5.如权利要求3所述的SSR分子标记方法，其特征在于，步骤(2)中，选取芸薹属异源六倍体亲本及DH群体的幼嫩叶片进行基因组DNA的提取。
6.如权利要求3所述的SSR分子标记方法，其特征在于，步骤(2)中，采用CTAB法提取基因组DNA。
7.如权利要求3所述的SSR分子标记方法，其特征在于，步骤(2)中，所述PCR扩增的方法为普通PCR或Touch Down PCR。
8.如权利要求7所述的SSR分子标记方法，其特征在于，当采用Touch Down PCR进行扩增时，采用下述扩增体系：
1μL 10×PCR Buffer(含Mg2+)，1μL dNTP(2.5mmol/L)，1μL模板DNA(50ng/μL)，0.1μLTaq DNA聚合酶(5U/μL)，正反向引物各0.5μL(10ng/μL)，ddH2O补足至10μL；
以及下述扩增程序：
94℃预变性3min，94℃变性30s，65℃退火45s，72℃延伸1min，每2个循环降1℃，共20个循环；94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，共10个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
9.如权利要求3所述的SSR分子标记方法，其特征在于，步骤(3)中，对PCR扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据电泳结果剔除偏分离的SSR分子标记，再利用生物学软件JoinMap4.0构建芸薹属异源六倍体杂交子代的遗传连锁图谱。
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