CN111057784A

CN111057784A - 一种与核桃黑斑病相关的ssr分子标记引物及其应用

Info

Publication number: CN111057784A
Application number: CN202010034627.4A
Authority: CN
Inventors: 韩珊; 阮若玉; 王明; 万雪琴; 朱天辉; 李姝江; 谯天敏; 衣建民; 姜耀荣
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2020-01-14
Filing date: 2020-01-14
Publication date: 2020-04-24
Anticipated expiration: 2040-01-14
Also published as: AU2020103706A4; CN111057784B

Abstract

本发明公开了一种与核桃黑斑病相关的SSR分子标记引物及其应用。本发明基于转录组数据，对核桃SSR引物进行抗性鉴定分析，结果表明：本发明基于不同黑斑病抗性核桃转录组测序结果，筛选出可能与黑斑病相关的SSR引物63对，再以抗病品种‘铁核桃’和感病品种‘香玲’的叶片基因组DNA为模板，对63对SSR引物进行了多态性筛选，使用多态性良好的15对SSR标记，以抗病株系和感病株系基因组DNA为模板，进一步验证，最终获得1对与核桃抗黑斑病相关的SSR引物RJR‑18。本发明基于核桃转录组数据开发和筛选出与核桃黑斑病抗性直接相关的SSR分子标记，为核桃黑斑病抗性种质的筛选和鉴定提供快速准确的分子生物学方法。

Description

一种与核桃黑斑病相关的SSR分子标记引物及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学分子标记技术领域，具体涉及一种与核桃黑斑病相关的SSR分子标记引物及其应用。

背景技术

核桃黑斑病由核桃黄单胞杆菌(Xanthomonas campestris pv.Juglandis(Pierce)Dye)引起。该病害潜伏期长、发病迅速，导致核桃果实腐烂、早落，从而引起减产，出仁率和含油量降低等。据统计，全国各产区核桃黑斑病植株发病率平均60％～65％，果实发病率平均为30％～40％，严重达95％以上。关于核桃黑斑病抗性的鉴定，目前普遍采用传统的人工接种病原物方法和田间试验鉴定方法。人工接种结果不如田间自然发病情况准确，田间鉴定又有着生长周期较长、受环境因素影响大等缺点。随着分子标记辅助选择技术的兴起，为建立快速、准确的检测植物病害的技术体系提供了依据。目前分子标记技术广泛运用于植物种植资源抗病性的研究，由于SSR分子标记技术在筛选目标性状的连锁标记方面灵敏、关联程度高等优点，国内外学者筛选出与棉花、木麻黄、花生、柑橘等抗病基因相关联的SSR分子标记，为植物种质资源抗病性鉴定及抗病新品种的选育提供了高效、可靠、简便的新方法。与作物相比，像核桃这种基因组较大的林木的分子生物学进展相对缓慢，目前，已有学者对SSR标记进行了核桃遗传多样性分析和种质资源鉴定，但尚未见到开发筛选与核桃黑斑病抗性基因连锁的SSR分子标记的报道。核桃黑斑病是核桃的主要病害之一，造成严重的经济损失，而目前针对植物病害，进行抗病育种是最为经济有效的方式，因此急需开发和筛选出与核桃黑斑病抗性基因连锁的分子标记，用于不同核桃品种(系)抗病性检测，能够为核桃黑斑病抗性鉴定和核桃抗病育种提供准确快速的研究方法。

发明内容

针对上述现有技术，本发明基于核桃转录组数据开发和筛选出与核桃黑斑病抗性直接相关的SSR分子标记，为核桃黑斑病抗性种质的筛选和鉴定提供快速准确的分子生物学方法。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种与核桃黑斑病相关的SSR分子标记引物RJR-18，SSR分子标记引物由上游引物和下游引物组成，其核苷酸序列分别如SEQ.ID NO.1和SEQ.ID NO.2所示，具体如下：

RJR-18F：5'-TACTGCTGCTTGGCATTTGC-3'(SEQ.ID NO.1)；

RJR-18R：5'-TGTGGGCCAATTGAGAGCTC-3'(SEQ.ID NO.2)。

本发明所提供的SSR分子标记引物RJR-18可用于核桃抗黑斑病品系的鉴定。

用本发明的SSR分子标记引物RJR-18鉴定核桃抗黑斑病品的方法具体包括：

S1：提取待鉴定样品的总DNA；

S2：以待鉴定样本的总DNA为模板，用权利要求1所述的SSR分子标记引物进行PCR扩增；扩增体系25μL，包括：2×T5 Super PCR Mix 12.5μL，30ng/μL模板DNA 1.0μL，10μM上下游引物各1.0μL，ddH₂O补足至25μL；反应程序为：98℃预变性120s，98℃变性10s，50/55/60℃退火10s，72℃延伸10s，循环29次；72℃延伸120s；

S3：取扩增产物进行电泳，读取扩增出的引物片段大小；

S4：核桃抗黑斑病品系在315～325bp范围内出现DNA扩增条带，据此实现对甘草物种和刺果甘草物种的鉴别。

本发明的有益效果是：本发明通过开发SSR分子标记并发掘物种特有的分子特征，可以为核桃种质资源的分子鉴定、构建遗传图谱及分子辅助育种提供技术支撑，为今后优质核桃的栽培生产提供分子保障。

附图说明

图1为筛选出的63对SSR引物的琼脂糖凝胶电泳结果；

图2为SSR分子标记引物RJR-18的电泳结果；其中，泳道1～6为抗病品种，M为分子量标记，泳道7～12为感病品种。

具体实施方式

本发明中所用材料来源如下：

本发明抗感差异材料‘铁核桃’、‘香玲’、‘清香’、‘蜀江1号’、‘川早1号’、‘川早2号’、‘辽核1号’、‘64号’、‘65号’、‘71号’、‘86号’和‘199号’由四川农业大学现代农业研发基地提供。于2018年4月初核桃刚发芽时采健康幼嫩叶片，用于DNA提取。

核桃黄单胞杆菌由四川农业大学林学院林木病理学实验室保存。

核桃转录组数据来源于四川农业大学林学院森林保护学林木病理课题组2016年对核桃材料叶片进行Illumina高通量深度测序的结果。

下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

实施例一：SSR引物设计与筛选，同时检测SSR引物的有效性

根据核桃转录组结果，基于健康铁核桃、发病铁核桃、健康香玲和发病香玲四个转录本中基因表达水平分析，筛选出差异基因，筛选阈值为padj＜0.05。根据Unigene序列在Nr，Nt，Pfam，KOG/COG，Swiss-prot，KEGG，GO七大数据库中的比对结果，查找差异基因分析后筛选的378个基因在七大数据库中的基因功能注释结果。

用MISA软件在符合以上条件的unigenes上检索SSR位点，Primer 6引物批量设计程序对含有SSR位点的Unigenes序列设计引物。引物命名为RJR加序号，如RJR-1。

37份不同品种(系)核桃叶片基因组DNA提取方法参考天根植物组织DNA提取试剂盒说明书，采用超微分光光度计和1％琼脂糖凝胶电泳检测所提取的DNA浓度和纯度，根据所测得浓度使用无菌去离子水将其稀释至30ng/μL，-20℃储存备用。

SSR引物有效性检测以‘铁核桃’幼嫩叶片基因组DNA为模板。采用的25μL反应体系，包括1×T3 Super PCR Mix 22.0μL，30ng/μL模板DNA1.0μL，10μM上下游引物各1.0μL。PCR反应程序：98℃预变性120s；98℃变性10s，50/55/60℃退火10s，72℃延伸10s，循环29次；72℃延伸120s。扩增产物使用3％琼脂糖凝胶电泳检测。

根据核桃转录组结果，筛选并设计的63对引物，均能有效扩增，扩增率为100％，结果如图1所示。可见基于转录组开发的SSR标记有效可靠。

实施例二：多态性SSR标记开发

以对黑斑病表型性状差异显著的抗病材料‘铁核桃’和感病材料‘香玲’基因组DNA为模板，对能够有效扩增的SSR引物进行多态性筛选，采用的25μL反应体系，包括2×T5Super PCR Mix 12.5μL，30ng/μL模板DNA1.0μL，10μM上下游引物各1.0μL，ddH₂O补足至25μL。反应程序：98℃预变性120s；98℃变性10s，50/55/60℃退火10s，72℃延伸10s，循环29次；72℃延伸120s。扩增产物采用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显影后统计分析。

银染显影结果表明，2、3、4、6、7、9、11、13、17、18、23、25、27等24对引物在抗感基因池间具有多态性，多态性引物比例为39.3％。各引物的多态性条带强弱和条带大小有所差异，其中，2、3、6、7、11、13、17、18、23、25、45、46、50、55、60等15对引物在抗感基因池有较大差异，是理想的多态性引物，可进一步验证。这15对SSR引物的序列如表1所示。

表1 15对多态性SSR引物的编码与序列分析

实施例三：抗病相关SSR引物验证

结合前期对四川农业大学崇州基地不同品种(系)的核桃进行田间核桃黑斑病抗性鉴定基础上，以不同品种(系)抗病材料和感病材料基因组DNA为模板，对上述抗感差异材料具有多态性的引物进行进一步的验证。银染法检验。分子标记检测时，扩增条带与‘铁核桃’带型一致的表示该品种(系)可能为抗病，与‘香玲’带型一致的表示该品种(系)可能为感病。抗病类型用“1”表示，感病类型用“0”表示，抗性相关分析采用Pearson相关分析(P≤0.05，P≤0.01)，对核桃SSR标记基因型与黑斑病抗病性进行相关分析，利用Pearson相关系数判断SSR标记与黑斑病抗性关联度是否达到显著水平，并计算标记对核桃黑斑病抗性鉴定的符合率(符合率(％)＝(核桃黑斑病抗性正确鉴定的个数/品种总数)*100％)。

分别以6份抗黑斑病和6份感黑斑病核桃株系的DNA为模板，对上述15对具有良好多态性的引物进行进一步验证。经验证，15对引物中，仅有1对与核桃抗病表型相关联，其余引物在抗感材料间缺乏统一性和代表性，结果如表2所示。图2表明，RJR-18在抗病材料中都能够扩增出大小约为320bp的条带，而感病材料中除了‘辽核1号’，其余皆不能扩增出此大小条带，符合率为91.7％。

表2 Validation of SSR polymorphism

M：HR：Highly resistant；R:Resistant；S:susceptible；HS:highly susceptible

Pearson相关分析结果表明，RJR-18引物与核桃黑斑病相关程度达到极显著水平(P＜0.01)，Pearson相关系数为0.846，表明RJR-18与核桃黑斑病抗性相关，能够用于之后不同核桃品种抗性早期筛选和鉴定。

实施例四：SSR标记用于核桃抗黑斑病品系的鉴定

使用筛选出的与核桃黑斑病相关的SSR标记RJR-18，对从德昌县核桃、山核桃国家林木种质资源库采集的25份的核桃材料进行鉴定，检测它们对黑斑病的抗性，为今后黑斑病抗性鉴定作参照。统计结果见表3。结果显示，雷溪核桃、石棉巨型核桃、德昌3号、和田16号、西昌柑桠1号等16个品种为抗病品种，川核早、石棉指核桃、和田18号、云新14号、华宁大白壳、河南2号等9个品种为感病品种。

Table3 Result of resistance identification amplificated by molecularmarkers

虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种与核桃黑斑病相关的SSR分子标记引物及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tactgctgct tggcatttgc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgtgggccaa ttgagagctc 20

Claims

1.一种与核桃黑斑病相关的SSR分子标记引物RJR-18，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ.ID NO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ.ID NO.2所示的下游引物。

2.权利要求1所述的SSR分子标记引物RJR-18在核桃抗黑斑病品系鉴定中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：核桃抗黑斑病品系在315～325bp范围内出现DNA扩增条带。

4.采用权利要求1所述的与核桃黑斑病相关的SSR分子标记引物RJR-18鉴别核桃抗黑斑病品系的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：提取待鉴定样品的总DNA；

S2：以待鉴定样本的总DNA为模板，用权利要求1所述的SSR分子标记引物进行PCR扩增；

S3：取扩增产物进行电泳，读取扩增出的引物片段大小；

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：S2中进行PCR扩增时扩增体系总量为25μL，包括：2×T5 Super PCR Mix 12.5μL，30ng/μL模板DNA 1.0μL，10μM上下游引物各1.0μL，ddH₂O补足至25μL。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，S2中进行PCR扩增时反应程序为：98℃预变性120s，98℃变性10s，50/55/60℃退火10s，72℃延伸10s，循环29次；72℃延伸120s。