CN107475427A - 一种利用ssr技术鉴别核桃品种的方法 - Google Patents

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李燕
张志华
赵书岗
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Abstract

本发明涉及植物品种技术领域，尤其是一种利用SSR技术鉴别核桃品种，包括以下步骤：S1：根据目的基因序列设计特异性的引物；S2：使用S1制得的引物对不同核桃品种的DNA进行PCR扩增；S3：PCR扩增产物使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测；S4：使用硝酸银染色法进行染色；S5：根据扩增产物在电泳凝胶上的相对位置，在相同迁移位置上有带的记为“A”，无带的记为“B”；S6：使用S1制得的引物分别对待检核桃品种的DNA进行PCR扩增；S7：按照引物顺序进行编码，将得到的编码与其他核桃品种的特征代码进行比对，确定待测核桃品种。本发明能够快速完成核桃品种鉴定，具有高效、准确、低成本、操作简便等优势。

Description

一种利用SSR技术鉴别核桃品种的方法
技术领域
本发明涉及植物品种鉴别技术领域，是一种利用SSR技术鉴别核桃品种的方法。
背景技术
核桃，又称胡桃，羌桃，为胡桃科植物。与扁桃、腰果、榛子并称为世界著名的“四大干果”。核桃仁含有丰富的营养素，每百克含蛋白质15～20克，脂肪较多，碳水化合物10克；并含有人体必需的钙、磷、铁等多种微量元素和矿物质，以及胡萝卜素、核黄素等多种维生素。对人体有益。是深受老百姓喜爱的坚果类食品之一。
核桃树一般高达3～5米，树皮灰白色，浅纵裂，枝条髓部片状，幼枝先端具细柔毛(2年生枝常无毛)。树皮幼时灰绿色，老时则灰白色而纵向浅裂。小枝无毛，具有光泽。
由于地域间引种利用，核桃品种同种异名现象十分严重，地方品种遗传相似性高，传统的形态学和细胞学鉴定方法很难做到准确而真实的鉴定核桃的品种差别，为此需要在分子水平上进行分析鉴定。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种利用SSR技术鉴别核桃品种的方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
设计一种利用SSR技术鉴别核桃品种的方法，包括以下步骤：
S1：根据目的基因序列设计特异性的引物如下：
引物A：5’-ACGCATGACGCTATAGGCTACGAT-3’；
引物B：5’-AGCTTAAGATTAAATGGGAACCTCCT-3’；
引物C：5’-TGATATGATAACTGGGCTAGAAAG-3’；
引物D：5’-AGTGATAGAATCTGAACCAATAAC-3’；
并将制得的引物分装在试剂盒中，引物浓度维持在0.2-0.5mol/L；
S2：使用上一步制得的引物对不同核桃品种的DNA进行PCR扩增；
S3：以非变性聚丙烯酰胺凝胶为介质，并加入TEMD和过硫酸铵作为催化剂，聚合形成线状长链，加入交联剂，发生聚合反应后，聚丙烯胺的链与链之间交叉联接而形成三维带状网络结构的凝胶；
S4：通过上述凝胶电泳进行检测，使用硝酸银染色法进行染色，根据标准DNA分子量和引物的迁移率记录电泳结果，依据扩增产物在电泳凝胶上的相对位置，在相同迁移位置上有带的记为“A”，无带的记为“B”，建立SSR基因型信息数据，按照引物顺序进行编码，得到的代码即为该核桃品种的特征代码；
S5：提取待检核桃品种的DNA，使用制得的引物分别对待检核桃品种的DNA进行PCR扩增；
S6：扩增产物通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，使用硝酸银染色法进行染色，根据扩增产物在电泳凝胶上的相对位置，在相同迁移位置上有带的记为“A”，无带的记为“B”，按照引物顺序进行编码，将得到的编码与S4中得的核桃品种的特征代码进行比对，确定待测核桃品种。
优选的，PCP扩增，其程序为：
A1：94℃预变性3min(1个循环)；
A2：94℃变性30s，53～59℃退火30s，72℃延伸45s(25—30个循环)；
A3：72℃延伸5min(1个循环)，最后4℃保持。
优选的，SSR的扩增反应体系各组分为：
DNA模板(50ng/ul)0.5μL
Taq MasterMix 6.25μL
Forward primer(10umol/L) 0.5μL
Reverse primer(10umol/L) 0.5μL
dd水4.75μL
优选的，所述交联剂为N，N-甲叉双丙烯酰胺。
本发明提出的一种利用SSR技术鉴别核桃品种的方法，有益效果在于：本发明能够快速完成核桃品种鉴定，具有高效、准确、低成本、操作简便等优势。同时本发明的检测方法可以有效的对核桃真伪进行监控，防止假冒伪劣品种进入市场。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，当然，所描述的实施例会根据电泳效果而进行改变，例如，根据条带的深浅，来增加PCR的循环数或者调整退火温度。
一种利用SSR技术鉴别核桃品种的方法，包括以下步骤：
S1：提取不同核桃品种和待测核桃的DNA，利用琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和浓度，之后保存在4℃条件下，待用；
S2：根据目的基因序列设计特异性的引物；
S3：将核桃DNA的浓度稀释至50ng/ul，将引物的浓度稀释至10umol/L，用制得的引物对不同核桃品种的DNA进行PCR扩增，扩增反应采用常规的反应体系。
SSR的体系各组分为：
DNA模板(50ng/ul)0.5μL
Taq MasterMix 6.25μL
Forward primer(10umol/L) 0.5μL
Reverse primer(10umol/L) 0.5μL
dd水4.75μL
总体积 12.5μL
SSR反应的基本程序为：
94℃预变性3min(1个循环)；
94℃变性30s，53～59℃退火30s，72℃延伸45s(25—30个循环)；
72℃延伸5min(1个循环)，最后4℃保持。
其中，不同的引物退火温度不同，循环数不同。
S4：PCR扩增产物使用10％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行产物的检测和多态性的观察，其具体步骤为：
(1)装板：玻璃板洗净晾干后，将带耳朵的玻璃板放于长方形的玻璃板之上，两侧用铁夹固定，最后调节梳子的紧密度。
(2)灌胶：每一对长板需要70mL配好的10％聚丙烯酰胺溶液。配方如下：蒸馏水32.2mL，30％Acr-Bis 23.275mL，5×TBE 14mL，1％AP 980μL，TEMED 43.75μL。将上述药品依次加入灌胶瓶中，在平面上摇动瓶子，等气泡消失后均匀的灌胶，最后迅速的插入128齿梳子静置。
(3)点样：约40min后，将两对长板垂直放于电泳槽中，用夹子固定，灌入1×TBE缓冲液，慢慢地、均匀地拔出梳子，点样。
(4)电泳：使用DYY-12型电泳仪进行时间为60min，恒压为180V的电泳。
S5：使用硝酸银染色法进行染色，染色方法如下：
电泳结束后，将玻璃板从电泳槽中拆除，用工具撬开玻璃板，将胶小心地剥至盛有蒸馏水的长盘中，水洗15-20s。倒掉水洗液后，将其置于摇床上，加入0.1％硝酸银溶液，轻轻振荡10min进行银染。银染结束后，水洗2遍。最后加入1％的氢氧化钠显色液(用前加入2.5mL甲醛溶液)振荡，条带出现即停。显色结束后，加入适量蒸馏水洗5-10s后，将胶捞于灯箱上，照相保存；
S6：染色后，根据标准DNA分子量和引物的迁移率记录电泳结果，依据扩增产物在电泳凝胶上的相对位置，在相同迁移位置上有带的记为“A”，无带的记为“B”，建立SSR基因型信息数据，按照引物顺序进行编码，得到的代码即为该核桃品种的特征代码；
S7：提取待检核桃品种的DNA，使用上一步制得的引物分别对待检核桃品种的DNA进行PCR扩增；
S8：扩增产物通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，使用硝酸银染色法进行染色，根据扩增产物在电泳凝胶上的相对位置，在相同迁移位置上有带的记为“A”，无带的记为“B”，按照引物顺序进行编码，将得到的指纹代码S4中所得的核桃品种的特征代码进行比对，确定待测核桃品种。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种利用SSR技术鉴别核桃品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：根据目的基因序列设计特异性的引物如下：
引物A：5’-ACGCATGACGCTATAGGCTACGAT-3’；
引物B：5’-AGCTTAAGATTAAATGGGAACCTCCT-3’；
引物C：5’-TGATATGATAACTGGGCTAGAAAG-3’；
引物D：5’-AGTGATAGAATCTGAACCAATAAC-3’；
将制得的引物分装在试剂盒中，引物浓度维持在0.2-0.5mol/L；
S2：使用上一步制得的引物对不同核桃品种的DNA进行PCR扩增；
S3：以非变性聚丙烯酰胺凝胶为介质，并加入TEMD和过硫酸铵作为催化剂，聚合形成线状长链，加入交联剂，发生聚合反应后，聚丙烯酰胺的链与链之间交叉联接而形成三维带状网络结构的凝胶；
S4：通过S3中凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，使用硝酸银染色法进行染色，根据标准DNA分子量和引物的迁移率记录电泳结果，依据扩增产物在电泳凝胶上的相对位置，在相同迁移位置上有带的记为“A”，无带的记为“B”，建立SSR基因型信息数据，按照引物顺序进行编码，得到的代码即为该核桃品种的特征代码；
S5：提取待检核桃品种的DNA，使用制得的引物分别对待检核桃品种的DNA进行PCR扩增；
S6：扩增产物通过10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，使用硝酸银染色法进行染色，根据扩增产物在电泳凝胶上的相对位置，在相同迁移位置上有带的记为“A”，无带的记为“B”，按照引物顺序进行编码，将得到的编码与S4中得的核桃品种的特征代码进行比对，确定待测核桃品种。
2.根据权利要求1所述的一种利用SSR技术鉴别核桃品种的方法，其特征在于：
SSR的扩增反应体系各组分为：
3.根据权利要求1所述的一种利用SSR技术鉴别核桃品种的方法，其特征在于：PCP扩增，其程序为：
A1：94℃预变性3min(1个循环)；
A2：94℃变性30s，53～59℃退火30s，72℃延伸45s(25～30个循环)；
A3：72℃延伸5min(1个循环)，最后4℃保持。
其中，不同的引物退火温度不同，A2过程循环数不同。
4.根据权利要求1所述的一种利用SSR技术鉴别核桃品种的方法，其特征在于：所述交联剂为N，N-甲叉双丙烯酰胺。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN111057784A (zh) * 2020-01-14 2020-04-24 四川农业大学 一种与核桃黑斑病相关的ssr分子标记引物及其应用
BE1030727B1 (de) * 2022-07-25 2024-02-20 Res Institute Of Forestry Chinese Academy Of Forestry Verfahren zur Identifizierung von Walnusssorten durch die Markierungstechnologie mit repetitiver Sequenz

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