BE1030727B1 - Verfahren zur Identifizierung von Walnusssorten durch die Markierungstechnologie mit repetitiver Sequenz - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft der Identifizierung von Pflanzensorten, insbesondere ein Verfahren zur Identifizierung von Walnusssorten durch die Markierungstechnologie mit repetitiver Sequenz, umfassend die folgenden Schritte:S1: Entwerfen der spezifischen Primer gemäß der Zielgensequenz;S2: Durchführen einer PCR-Amplifikation für die DNA verschiedener Walnusssorten unter Verwendung der in S1 erhaltenen Primer;S3: Verwenden von nicht denaturierender Polyacrylamidgelelektrophorese, um das PCR-Amplifikationsprodukt zu erkennen; S4: Färben; S5: gemäß der relativen Position des amplifizierten Produkts auf dem Elektrophoresegel wird es als "A", wenn ein Band an der gleichen Migrationsposition besteht, und als "B", wenn kein Band besteht, markiert; S6: jeweiliges Durchführen einer PCR-Amplifikation für die DNA der zu erkennenden Walnusssorten unter Verwendung;S7: Durchführen einer Codierung gemäß der Primersequenz,. Die vorliegende Erfindung kann die Identifizierung von Walnusssorten schnell vervollständigen und verfügt über hohe Effizienz, Genauigkeit, niedrige Kosten, einfache Bedienung und andere Vorteile.
Description
1 BE2022/5591
Verfahren zur Identifizierung von Walnusssorten durch die Markierungstechnologie mit repetitiver Sequenz
TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft das technische Gebiet der Identifizierung von Pflanzensorten und ein
Verfahren zur Identifizierung von Walnusssorten durch die Markierungstechnologie mit repetitiver
Sequenz.
STAND DER TECHNIK
Der Walnuss ist eine Pflanze aus der Familie der Jugaceae. Zusammen mit Mandeln, Cashewnüssen und
Haselnüssen ist der Walnuss als die weltberühmten "vier Nüsse" bekannt. Die Walnusskerne sind reich an
Nährstoffen, jedes Hektogramm enthält 15-20 Gramm Eiweiß, mehr Fett und 10 Gramm Kohlenhydrate; außerdem enthalten sie lebensnotwendiges Calcıum, Phosphor, Eisen und andere Spurenelemente und
Mineralstoffe sowie Carotin, Riboflavin und andere Vitamine. Der Walnuss ist wohltuend für den menschlichen Körper. Er ist eines der beliebtesten Nuss-Lebensmittel.
Die Walnussbäume werden in der Regel 3 bis 5 Meter hoch, die Rinde ist grauweiß und flach längsgelappt, das Mark der Äste ist schuppig und die Spitze der jungen Äste ist behaart (die 2-jährigen Äste sind oft nicht behaart) . Die junge Rinde ist graugrün und die alt Rinde ist grauweif und flach längsgelappt. Die
Zweige sind nicht behaart und glänzen.
Aufgrund der Einführung und Verwendung von Walnusssorten zwischen Regionen ist das Phänomen der
Synonymie von Walnusssorten sehr ernst und die genetische Ähnlichkeit lokaler Sorten ist hoch. Es ist schwierig für tradıtionelle morphologische und zytologische Identifizierungsmethoden, die Unterschiede der Walnusssorten genau und wirklich zu identifizieren, aufgrund dessen sind die Analyse und
Identifizierung auf molekularer Ebene gefordert.
INHALT DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Der Zweck der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Identifizierung von Walnusssorten durch die Markierungstechnologie mit repetitiver Sequenz zu entwickeln, um die Mängel im Stand der
Technik zu lösen.
Um den obigen Zweck zu erreichen, verwendet die vorliegende Erfindung die folgende technische Lösung: ein Verfahren zur Identifizierung von Walnusssorten durch die Markierungstechnologie mit repetitiver
Sequenz, umfassend die folgenden Schritte:
S1: Entwerfen der folgenden spezifischen Primer gemäß der Zielgensequenz:
Primer A: 5-ACGCATGACGCTATAGGCTACGAT-3';
Primer B: 5-AGCTTAAGATTAAAATGGGAACCTCCT-3';
Primer C: 5'-TGATATGATAACTGGGCTAGAAAG-3";
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Primer D: 5'-AGTGATAGAATCTGAACCAATAAC-3'; wobei die hergestellten Primer mn Kits ausgeteilt werden, und wobei die Primerkonzentration auf 0,2-0,5 mol/L gehalten wird;
S2: Durchführen einer PCR-Amplifikation (Polymerase Cham Reaction Amplifikation) für die DNA verschiedener Walnusssorten unter Verwendung der im vorherigen Schritt erhaltenen Primer;
S3: Verwenden des nicht denaturierenden Polyacrylamidgels als Medium und Hinzufügen von TEMD (tetramethylethylene diamine) und Ammoniumpersulfat als Katalysatoren, um durch die Polymerisation lange lineare Ketten zu bilden, Hinzufügen eines Vernetzungsmittels, wobei nach der
Polymerisationsreaktion sich die Ketten des Polyacrylams kreuzend verbmden, um em Gel emer dreidimensionalen Bandnetzwerkstruktur zu bilden;
S4: Erkennen unter Verwendung der obigen Gelelektrophorese, Färben unter Verwendung der
Silbernitrat-Färbemethode, Aufzeichnen der Elektrophoreseergebnisse gemäß dem Standard-DNA-
Molekulargewicht und der Mobilität der Primer, wobei es gemäß der relativen Position des amplifizierten
Produkts auf dem Elektrophoresegel als "A", wenn em Band an der gleichen Migrationsposition besteht, und als "B", wenn kein Band besteht, markiert wird, und wobei die SSR (Simple Sequence Repeats)-
Genotyp-Informationsdatenerstellt werden und die Codierung gemäß der Primersequenz durchgeführt wird, und wobei der erhaltene Code der charakteristische Code der Walnusssorte ist; 55: Extrahieren der DNA der zu erkennenden Walnusssorte und jeweiliges Durchführen einer PCR-
Amplifikation für die DNA der zu erkennenden Walnusssorten unter Verwendung der hergestellten Primer;
S6: Erkennen des amplifizierten Produkts unter Verwendung der nicht denaturierenden
Polyacrylamidgelelektrophorese, Färben unter Verwendung der Silbernitrat-Färbemethode, wobei es gemäß der relativen Position des amplifizierten Produkts auf dem Elektrophoresegel als "A", wenn em
Band an der gleichen Migrationsposition besteht, und als "B", wenn kein Band besteht, markiert wird, und wobei die Codierung gemäß der Primersequenz durchgeführt wird, und wobei der erhaltene Code mit dem m S4 erhaltenen charakteristischen Code der Walnusssorte verglichen wird, um die zu erkennende
Walnusssorte zu bestimmen.
Bevorzugt ist der Ablauf der PCR-Amplifikation wie folgt:
A1: Vordenaturiern bei 94°C für 3 mm (1 Zyklus);
A2: Denaturiern bei 94°C für 30 s, Glühen bei 53-59°C für 30 s und Verlängern bei 72°C für 45 s (25- 30 Zyklen);
A3: Verlängem bei 72°C für 5 min (1 Zyklus) und abschlieBendes Halten bei 4°C.
Bevorzugt sind die Komponenten des SSR-Amplifikationsreaktionssystems wie folgt:
DNA-Template (50 ng/uL) 0,5 uL
Taq-MasterMix 6,25 uL
Forward-Primer (10 umol/L) 0,5 uL
Reverse-Primer (10 umol/L) 0,5 uL dd Wasser 4,75 uL
Bevorzugt ist das Vernetzungsmittel N,N-Methylenbisacrylamid.
3 BE2022/5591
Das Verfahren zur Identifizierung von Walnusssorten durch die Markierungstechnologie mit repetitiver
Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung hat die folgenden Vorteile: dass die vorliegende Erfindung die Identifizierung von Walnusssorten schnell vervollständigen kann und über hohe Effizienz,
Genauigkeit, niedrige Kosten, einfache Bedienung und andere Vorteile verfügt. Gleichzeitig kann das
Erkennungsverfahren der vorliegenden Erfindung die Authentizität von Walnüssen wirksam überwachen, um zu verhindern, dass gefälschte und minderwertige Sorten auf den Markt kommen.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Die technischen Lösungen in den Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung werden unten klar und vollständig erläutert. Natürlich werden die erläuterten Ausführungsbeispiele gemäß dem
Elektrophoreseeffekt geändert, beispielsweise wird gemäß der Tiefe des Bandes die Anzahl der PCR-
Zyklen erhöht oder die Glühtemperatur angepasst.
Ein Verfahren zur Identifizierung von Walnusssorten durch die Markierungstechnologie mit repetitiver
Sequenz, umfassend die folgenden Schritte:
S1: Extrahieren der DNA verschiedener Walnusssorten und der zu erkennenden Walnuss, Verwenden der
Agarose-Gelelektrophorese, um ihre Reinheit und Konzentration festzustellen, anschließendes Lagern bei 4°C für die spätere Verwendung;
S2: Entwerfen der spezifischen Primer gemäß der Zielgensequenz;
S3: Verdünnen der Konzentration von Walnuss-DNA auf 50 ng/uL, Verdünnen der Konzentration von
Primern auf 10 umol/L, Durchführen einer PCR-Amplifikation für die DNA verschiedener Walnusssorten unter Verwendung der hergestellten Primern, wobei die Amplifikationsreaktion em herkömmliches
Reaktionssystem annımmt.
Die Komponenten des SSR-Systems sind wie folgt:
DNA-Template (50 ng/uL) 0,5 uL
Taq-MasterMix 6,25 uL
Forward-Primer (10 umol/L) 0,5 uL
Reverse-Primer (10 umol/L) 0,5 uL dd Wasser 4,75 uL
Gesamtvolumen 12,5 uL
Der grundlegende Ablauf der SSR-Reaktion ist wie folgt:
Vordenaturiern bei 94°C für 3 min (1 Zyklus);
Denaturiern bei 94°C für 30 s, Glühen bei 53-59°C für 30 s und Verlängern bei 72°C für 45 s (25-30
Zyklen);
Verlängern bei 72°C für 5 min (1 Zyklus) und abschließendes Halten bei 4°C.
Dabei haben unterschiedliche Primer unterschiedliche Glühtemperaturen und unterschiedliche
Zyklenzahlen.
4 BE2022/5591
S4: Verwenden von 10%iger nicht denaturierender Polyacrylamidgelelektrophorese an dem PCR-
Amplifikationsprodukt, um das Produkt zu erkennen und den Polymorphismus des Produkts zu beobachten. Die spezifischen Schritte smd wie folgt: (1) Plattenbeladung: nachdem die Glasplatte gewaschen und getrocknet wurde, wird die Glasplatte mit
Ohren auf die rechteckige Glasplatte gelest, wobei die beiden Seiten mit Eisenklammern befestigt werden und schließlich die Festigkeit des Kamms eingestellt wird; (2) Leimfüllung: 70 mL vorbereitete 10%ige Polyacrylamidlösung werden für jedes Paar von langen
Platten benötigt; die Rezeptur lautet wie folgt: destilliertes Wasser 32,2 mL, 30%iges Acr-Bis (Acrylamide/Bis Solution) 23,275 mL, 5xTBE 14 ml, 1%iges AP (Ammonium persulfate) 980 uL,
TEMED (tetramethylethylene diamme) 43,75 uL; Zugeben der oben genannten Chemikalien nacheinander in die Leimfüllflasche, Schütteln der Flasche auf einer ebenen Fläche und gleichmäfiges
Emgiefen des Lems, nachdem die Blasen verschwunden sind, schließlich schnelles Einlegen eines 128-
Zahn-Kamms und Stehenlassen; (3) Tüpfeln: nach etwa 40 Minuten werden zwei Paare von langen Platten senkrecht in den
Elektrophoresetank gelest und mit Klammern befestigt, Emfüllen von 1xTBE-Puffer, langsames und gleichmäfiges Herausziehen des Kamms und Tüpfeln; (4) Elektrophorese: Verwenden eines DY Y-12-Elektrophoresegeräts, um die Elektrophorese mit einer
Zeitdauer von 60 min und einer konstanten Spannung von 180 V durchzuführen;
S5: Färben unter Verwendung der Silbernitrat-Färbemethode, wobei die Färbmethode wie folgt ist:
Entfernen nach der Elektrophorese der Glasplatte aus dem Elektrophoresetank, Aufbrechen der Glasplatte mit Werkzeugen, vorsichtiges Abziehen des Leims auf einen langen Teller, der mit destilliertem Wasser gefüllt ist, und Waschen für 15-20 s mit Wasser; nachdem die Wasserwaschlösung ausgegossen war, wird sie auf eme Schüttelmaschine gestellt, Zugeben von 0,1%iger Silbernitratlôsung und leichtes Vibrieren für 10 mm zum Silberfärben; nachdem die Silberfärbung beendet war, wird es zweimal mit Wasser gewaschen; am Ende wird 1%ige chromogene Natrumhydroxidlösung (vor Gebrauch 2,5 mL
Formaldehydlösung hinzugefügt) zum Vibrieren zugegeben, und es wird damit aufgehört, wenn das Band erscheint; nachdem die Farbentwicklung abgeschlossen war, wird eine angemessene Menge an destilliertem Wasser zugegeben, um es für 5-10 s zu waschen, dann wird der Leim herausgenommen und auf die Lichtbox gestellt, Fotografieren zur Aufbewahrung;
S6: nach dem Färben werden die Elektrophoreseergebnisse gemäß dem Standard-DNA-
Molekulargewicht und der Mobilität der Primer aufgezeichnet, wobei es, wenn gemäß der relativen
Position des amplifizierten Produkts auf dem Elektrophoresegel em Band an der gleichen
Migrationsposition besteht, als "A" markiert, wenn kem Band besteht, als "B" markiert wird, und wobei die SSR-Genotyp-Informationsdaten erstellt werden und die Codierung gemäß der Primersequenz durchgeführt wird, und wobei der erhaltene Code der charakteristische Code der Walnusssorte ist; 57: Extrahieren der DNA der zu erkennenden Walnusssorte und jeweiliges Durchführen einer PCR-
Amplifikation für die DNA der zu erkennenden Walnusssorten unter Verwendung der im vorherigen
Schritt hergestellten Primer;
> BE2022/5591
S8: Erkennen des amplifizierten Produkts unter Verwendung der nicht denaturierenden
Polyacrylamidgelelektrophorese, Färben unter Verwendung der Silbernitrat-Färbemethode, wobei es gemäß der relativen Position des amplifizierten Produkts auf dem Elektrophoresegel als "A", wenn ein
Band an der gleichen Migrationsposition besteht, und als "B", wenn kein Band besteht, markiert wird, und wobei die Codierung gemäß der Primersequenz durchgeführt wird, und wobei der erhaltene
Fingerabdruckcode mit dem in S4 erhaltenen charakteristischen Code der Walnusssorte verglichen wird, um die zu erkennende Walnusssorte zu bestimmen.
Der vorstehende Inhalt ist nur die ausführliche Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, jedoch wird der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht darauf beschränkt. Die äquivalenten Änderungen oder Ersetzungen, die durch einen Fachmann, der mit dem diesem technischen Gebiet vertraut ist, innerhalb des offenbarten technischen Umfangs der vorliegenden Erfindung basierend auf der technischen
Lösung und dem erfinderischen Konzept der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden, sollten als vom Schutzumfang der vorliegenden Erfindung gedeckt angesehen werden.
Claims (4)
1. Verfahren zur Identifizierung von Walnusssorten durch die Markierungstechnologie mit repetitiver Sequenz, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst> S1: Entwerfen der folgenden spezifischen Primer gemäß der Zielgensequenz: Primer A: 5-ACGCATGACGCTATAGGCTACGAT-3'; Primer B: 5'-AGCTTAAGATTAAAATGGGAACCTCCT-3"; Primer C: 5'-TGATATGATAACTGGGCTAGAAAG-3"; Primer D: 5'-AGTGATAGAATCTGAACCAATAAC-3'; wobei die hergestellten Primer in Kits ausgeteilt werden, und wobei die Primerkonzentration auf 0,2-0,5 mol/L gehalten wird; 52: Durchführen einer PCR-Amplifikation für die DNA verschiedener Walnusssorten unter Verwendung der im vorherigen Schritt erhaltenen Primer; 53: Verwenden des nicht denaturierenden Polyacrylamidgels als Medium und Hinzufügen von TEMD und Ammoniumpersulfat als Katalysatoren, um durch die Polymerisation lange lineare Ketten zu bilden, Hinzufügen eines Vernetzungsmittels, wobei nach der Polymerisationsreaktion sich die Ketten des Polyacrylams kreuzend verbinden, um em Gel einer dreidimensionalen Bandnetzwerkstruktur zu bilden; S4: Erkennen der PCR-Amplifikationsprodukte unter Verwendung der Gelelektrophorese in S3: Färben unter Verwendung der Silbernitrat-Färbemethode, Auf zeichnen der Flektrophoreseergebnisse gemäß dem Standard-DNA-Molekulargewicht und der Mobilität der Primer, wobei es gemäß der relativen Position des amplifizierten Produkts auf dem Elektrophoresegel als "A", wenn ein Band an der gleichen Migrationsposition besteht, und als "B", wenn kem Band besteht, markiert wird, und wobei die SSR- Genotyp-Informationsdaten erstellt werden und die Codierung gemäß der Primersequenz durchgeführt wird, und wobei der erhaltene Code der charakteristische Code der Walnusssorte ist; S5: Extrahieren der DNA der zu erkennenden Walnusssorte und jeweiliges Durchführen einer PCR- Amplifikation für die DNA der zu erkennenden Walnusssorten unter Verwendung der hergestellten Primer; S6: Erkennen des amplifizierten Produkts unter Verwendung der 10%igen nicht denaturierenden Polyacrylamidgelelektrophorese, Färben unter Verwendung der Silbernitrat-Färbemethode, wobei es gemäß der relativen Position des amplifizierten Produkts auf dem Elektrophoresegel als "A", wenn em Band an der gleichen Migrationsposition besteht, und als "B", wenn kein Band besteht, markiert wird, und wobei die Codierung gemäß der Primersequenz durchgeführt wird, und wobei der erhaltene Code mit dem in S4 erhaltenen charakteristischen Code der Walnusssorte verglichen wird, um die zu erkennende Walnusssorte zu bestimmen.
2. Verfahren zur Identifizierung von Walnusssorten durch die Markierungstechnologie mit repetitrver Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponenten des SSR-Amplifikationsreaktionssystems wie folgt sind:
7 BE2022/5591 DNA-Template (50 ng/uL) 0,5 uL Taq-MasterMix 6,25 uL Forward-Primer (10 umol/L) 0,5 uL Reverse-Primer (10 umol/L) 0,5 uL dd Wasser 4,75 uL.
3. Verfahren zur Identifizierung von Walnusssorten durch die Markierungstechnologie mit repetitrver Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Ablauf der PCR-Amplifikation wie folgt 1st> A1: Vordenaturiern bei 94°C für 3 mm (1 Zyklus); A2: Denaturiern bei 94°C für 30 s, Glühen bei 53-59°C für 30 s und Verlängern bei 72°C für 45 s (25- 30 Zyklen); A3: Verlängem bei 72°C für 5 min (1 Zyklus) und abschlieBendes Halten bei 4°C; wobei unterschiedliche Primer unterschiedliche Glühtemperaturen und unterschiedliche Zyklenzahlen im A2-Prozess aufweisen.
4. Verfahren zur Identifizierung von Walnusssorten durch die Markierungstechnologie mit repetitiver Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Vernetzungsmittel N, N- Methylenbisacrylamid ist.
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| CN107475427A (zh) * | 2017-09-27 | 2017-12-15 | 河北农业大学 | 一种利用ssr技术鉴别核桃品种的方法 |
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Patent Citations (3)
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|---|---|
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