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Die vorliegende Erfindung betrifft ein
Verfahren zur Bestimmung der Hybridqualität von Samen,
bei dem Samenproteine bei einem geeigneten, durch
Ampholyte oder Immobiline erzeugten pH-Gradienten
voneinander mittels isoelektrischer Fokussierung
getrennt werden, wonach die so getrennten Proteine in
herkömmlicher Weise gefärbt und visuell erfaßt werden.
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Die Hybridqualität von Samen ist ein Merkmal
von Samenpartien, die für den Samenhandel von
besonderer Bedeutung ist. Während der letzten zehn,
zwanzig Jahre hat die Verwendung von Hybridsamen enorme
Ausmaße erreicht. Bezüglich Samen fremdbefruchtender
Rassen verfügen diese Samen von F1-Hybridrassen über
besondere Vorteile. Dies hängt mit der Art der
Erzeugung und Herstellung von Hybridrassen zusammen. Im
einfachsten Fall wird von zwei verschiedenen
Elternlinien ausgegangen (dem männlichen Elter, der den
Pollen spendet, und der weiblichen Linie, die bestäubt
wird und von der schließlich die Samen geerntet
werden), die durch Rekombination, Selektion und Inzucht
erhalten worden sind. Durch den Vorgang der Inzucht
oder Selbstbefruchtung sind die Eltern von Hybriden
bezüglich der meisten Merkmale homozygot. Da durch den
Vorgang der Selbstbefruchtung beide für die Herstellung
von Hybriden verwendeten Eltern so homogen sind, werden
die schließlich geernteten Hybridsamen ebenfalls
bezüglich ihrer genetischen Zusammensetzung sehr
homogen sein. Die schließlich aus den Hybridsamen
wachsende Pflanze ist bezüglich Eigenschaften wie
Morphologie, Ertrag, Erntezeitpunkt, Pflegemaßnahmen
etc. besonders einheitlich. Abgesehen von der
Einheitlichkeit ist der Ertrag von Hybridrassen im
Vergleich mit fremdbefruchtenden Rassen häufig höher.
Für den Käufer von Hybridsamen sind diese Vorteile von
Hybridrassen äußerst wichtig (die Einheitlichkeit der
Pflanze erlaubt zum Beispiel mechanisches Ernten). Dies
zeigt ebenfalls die Wichtigkeit der Hybridqualität der
Pflanze. Wird aus irgendeinem Grund die Mutterlinie des
Hybrids selbstbefruchtet, so führt dies zu mütterlichen
Samen statt Hybridsamen. Selbstbefruchtung bei der
väterlichen Linie ist ebenfalls möglich, und unter
Umständen können väterliche Samen geerntet werden.
Selbstbefruchtung bei der Mutterlinie führt zu
Inzuchtsamen statt Hybridsamen. Für den Käufer der
Hybridsamen ist dies nur sehr beschränkt akzeptabel.
Die Hybridqualität von Samen wird daher in der Praxis
durch einen Zufallstest geprüft. Dieser besteht darin,
daß man eine bestimmte Anzahl Samenkörner aussät, die
Pflanzen unter den richtigen Bedingungen bis zum
vollendeten fruchttragenden Stadium wachsen läßt und
anschließend alle Eigenschaften der Hybridpflanzen
genau analysiert. Da es sich beim Hybriden um die
"Summe" beider Eltern handelt und die Eltern sich
bezüglich ihrer Eigenschaften meistens unterschiedlich
verhalten, wird solch eine Analyse zu einem
verläßlichen Ergebnis führen. Dieses Verfahren ist
jedoch zeit- und kostenaufwendig. Da es lange dauert
(einige Monate), bis die die Hybridqualität der Samen
betreffenden Daten erhalten werden, können die Samen
nicht direkt nach der Ernte verkauft werden. Das heißt,
daß die Samen ziemlich lange, ja sogar länger als ein
Jahr, gelagert werden müssen, woraus sich Kosten
ergeben. Dies führt nicht nur durch die Lagerung als
solche zu zusätzlichen Kosten, sondern auch durch
Qualitätsverlust, das Versäumen von möglichen
Absatzchancen sowie eine schwierigere Planung der
anschließenden Produktionsvorgänge.
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Ein moderneres Verfahren zur Bestimmung der
Hybridqualität von Samen mittels isoelektrischer
Fokussierung ist aus der Arbeit von R.J. Cooke und
S.R. Draper in J. natn. Inst. agric. Bot., (1983) 16,
173-181 bekannt. Diese Arbeit beschreibt ein Verfahren,
bei dem man zur Analyse von Samen eine
Ultradünnschichtmethode der isoelektrischen
Fokussierung verwendet, bei der die einzelnen
Samenkörner geschrotet werden, worauf der Schrot des
Samenkorns, bzw. ein Teil dieses Schrots, mit einer
kleinen Menge (100-250 ul) 1,0 M Harnstoff mit oder
ohne 2 Volumenprozent 2-Mercaptoethanol (unabhängig von
der Art) in einem Zentrifugenrohr aus Polypropylen
extrahiert wird.
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Die Harnstofflösung wird, gegebenenfalls nach
Entfettung, mit Amberlite MB-1 behandelt, wonach man
den schließlich erhaltenen klaren Überstand für die
Fokussierung verwendet.
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Außer Samen wie Weizen, Hafer, Luzerne und Raps
lassen sich auch die Samenproteine von Erbsen und
Bohnen bestimmen.
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Die gebräuchliche Technik besteht darin, daß
man mittels Ampholyten einen pH-Gradienten in Gel
herstellt, um die Trennung der Proteine zu fördern.
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Gemäß dieser Arbeit ist der Vorteil des
bekannten Verfahrens, daß eine ausgezeichnete Trennung
der Samenproteine wesentlich schneller als bei den
üblichen Gelelektrophoreseverfahren erzielt wird.
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In dieser Arbeit wird die Verwendung solch
einer isoelektrischen Fokussierungsmethode zur
Bestimmung der Hybridqualität von Samen von
Gemüsepflanzen wie Tomaten, Kohlgewächsen, Melonen,
Capsicum-Arten usw. nicht erwähnt. Diese Arbeit
offenbart die Arbeit: "Evaluation of genetic purity in
hybrid corn (Zea mays L.) seed production through zein
isoelectrophoretic patterns" [Bestimmung der
genetischen Reinheit bei der Produktion von Hybridmais
(Zea mays L.)-Samen durch Isoelektrophoresemuster von
Zein].
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Es wurde nun überraschend gefunden, daß bei
Verwendung des isoelektrischen Fokussierungsverfahrens
für die Samenproteine von Tomaten, Kohl, Melonen,
Paprika, Capsicum-Arten, usw. solch ein Verfahren ein
erfolgreich anzuwendendes Mittel zur Bestimmung der F1-
Hybridreinheit solcher Rassen zu sein schien.
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Die vorliegende Erfindung beinhaltet demgemäß
ein Verfahren zur Bestimmung der Hybridqualität von
Samen, bei dem Samenproteine bei einem geeigneten,
durch Ampholyte oder Immobiline erzeugten pH-Gradienten
voneinander mittels isoelektrischer Fokussierung
getrennt werden, wonach die so getrennten Proteine in
herkömmlicher Weise gefärbt und visuell erfaßt werden,
dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridqualität von
F1-Hybridsamen von Gemüsepflanzen durch Verwendung der
Differenz zwischen den isoelektrischen Punkten von
mutter- und vaterspezifischen Samenproteinen bestimmt
wird.
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Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren
zur sehr schnellen und kostengünstigeren Bestimmung der
Hybridqualität von üblicherweise teuren Hybridsamen von
Gemüsepflanzen zur Verfügung. Das erfindungsgemäße
Verfahren beruht darauf, daß Samenproteine von
Hybridsamen analysiert werden. Da Hybridsamen über
Eigenschaften verfügen, die die Summe der Eigenschaften
der Eltern darstellen, hat der Hybridsamen sowohl
mutter- als auch vaterspezifische Proteine. Diese
Analyse läßt sich sehr rasch durchführen und ist
wesentlich kostengünstiger als das bis jetzt verwendete
Verfahren, bei dem ausgewachsene Pflanzen verwendet
werden. Das Verfahren ist außerdem verläßlicher. Der
Grund hierfür besteht darin, daß die Abwesenheit
vaterspezifischer Proteine (es werden lediglich Samen
von der Mutter geerntet) eindeutig belegt, daß eine
Selbstbefruchtung der Mutter stattgefunden hat.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung
bedeutet einen großen wirtschaftlichen Vorteil für den
Samenhandel, da es dem Handel gestattet, die
F1-Hybridqualität der gewünschten Samen wesentlich
schneller und deshalb preisgünstiger zu bestimmen.
Besonders geeignet erschien das isoelektrische
Fokussierungsverfahren zur Bestimmung der
Hybridqualität von Tomaten unter Verwendung des
isoelektrischen Punkts von mutter- und
vaterspezifischen Proteinen, der 7,1 und 6,1 für PRS-1&spplus;
bzw. PRS-1¹ beträgt.
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Bei Tomaten standen zwei andere Verfahren zur
Verfügung, und zwar die sogenannte Enzympolymorphie,
nämlich für das aus Blattgewebe gewonnene Enzym saure
Phosphatase sowie das aus gequollenem Samen erhaltene
Enzym Alkoholdehydrogenase.
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Diese beiden bekannten Verfahren werden nun
durch die Erfindung um ein drittes Verfahren
bereichert, das eine rasche und verläßliche Bestimmung
der Hybridqualität von Tomatensamen gestattet.
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Zur Bestimmung der Hybridqualität von
Kohlgewächsen zieht man mutter- und vaterspezifische
Proteine heran, bei denen es sich um wasserlösliche
PRS-1-Proteine mit einem isoelektrischen Punkt von 6,4
im Fall von PRS-1&spplus; und 7,4 im Fall von PRS-1¹ handelt.
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Wie dies bereits bei den Tomaten der Fall war,
werden die bestehenden Verfahren bei den Kohlgewächsen
durch die Erfindung um ein neues, rasches und
verläßliches Verfahren zur Bestimmung der
Hybridqualität erweitert.
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Es sei angemerkt, daß im Fall von Melonen und
Capsicum-Arten bis jetzt kein Verfahren zur Bestimmung
der Hybridqualität ihrer Samen zur Verfügung stand.
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Überraschend stellte sich heraus, daß sich das
erfindungsgemäße Verfahren besonders für die Bestimmung
der Hybridqualität von Melonen sowie Capsicum-Arten
eignet.
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Bei der Bestimmung der Hybridqualität von
Melonen zieht man mutter- und vaterspezifische PRS-
Proteine heran, bei denen es sich um wasserlösliche
Proteine mit einem isoelektrischen Punkt von 5,7, 5,8,
5,9, 6,0, 7,0, 8,5, 8,6 und 8,7 sowie um Proteine, die
in 8M Harnstoff löslich sind, mit einem isoelektrischen
Punkt von 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 6,1, 6,5, 8,9, 9,0, 9,7
und 9,9 handelt.
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Soll die Hybridqualität von Capsicum-Arten
bestimmt werden, so zieht man mutter- und
vaterspezifische PRS-1-Proteine heran, die in 8M
Harnstoff löslich sind und einen isoelektrischen Punkt
von 4,0 im Fall von PRS-1&spplus; und 5,2 im Fall von PRS-1-¹
aufweisen.
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Im allgemeinen führt man das vorliegende
Verfahren so durch, daß man Samen der Samenpartie,
deren Hybridqualität man bestimmen möchte, in einer
bestimmten Flüssigkeit, deren Hauptbestandteil Wasser
ist, schrotet oder homogenisiert, wobei sich die
Proteine in dieser Flüssigkeit lösen. Eine bestimmte
Fraktion der Flüssigkeit wird auf ein Gel aufgetragen,
wonach die Proteintrennung mittels isoelektrischer
Fokussierung stattfindet. Nach der Trennung findet die
Bestimmung der vater- und mutterspezifischen Proteine
mittels eines geeigneten Färbemittels oder
Silbernitrats statt. Die Position der mutter- und
vaterspezifischen Proteine im Gel wird experimentell
bestimmt. Wenn z.B. im Tomatensamen beide, d.h.
mutter- und vaterspezifische, Proteine vorliegen, was aus den
isoelektrischen Punkten der mutter- und
vaterspezifischen Proteine des Samenextrakts abgeleitet
werden kann, so läßt sich sagen, daß wir es hier mit
einem F1-Hybriden zu tun haben, in dem sowohl die
Eigenschaften der Mutter als auch des Vaters vorliegen.
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Bei Tomaten zieht man so z.B. zwei Proteine
heran, und zwar mit einem isoelektrischen Punkt von 7,1
bzw. 6,1, die von den Allelen Prs-1&spplus; und PRS-1¹ kodiert
werden.
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Dieses Verfahren beruht auf der genetischen
Variation des Gens Prs-1. Dieses Gen kodiert daher für
zwei Proteine PRS-1&spplus; und PRS-1¹.
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Der Vorteil der isoelektrischen Fokussierung
für die Bestimmung von Inzuchtlinien liegt darin, daß
die Bestimmung von Umweltbedingungen unabhängig ist.
Auch bleiben die Gene in nachfolgenden Generationen in
den Elternlinien erhalten.
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Wie oben erwähnt, eignet sich das vorliegende
Verfahren insbesondere für die Bestimmung der
Hybridreinheit von Gemüsepflanzensamen wie z.B. den
soeben erwähnten Tomaten, Melonen, Capsicum-Arten,
Kohlgewächsen, jedoch auch Eierfrüchten, Einlegegurken,
Zucchini, Gurken-, Radieschen usw.
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Bei der isoelektrischen Fokussierung entstehen
bei der Gelelektrophorese Muster, die folgendermaßen
interpretiert werden. Mittels der Muster prüft man,
welche Samen F1-hybridrein sind und welche nicht. Beim
F1-Hybriden lassen sich die typischen Banden von Mutter
und Vater wieder auffinden. Bleibt beim
Vergleichsmuster die vaterspezifische Bande aus, so ist
der Samen nicht hybridrein. Wenn wir annehmen, daß
hundert Samen untersucht werden, die beim Muster der
isoelektrischen Fokussierung mitgenommen werden, so
müssen bei Tomaten alle hundert rein sein, sollte sich
bei einer bestimmten Partie die Frage stellen, ob die
Samenqualität gut ist. Sollte ein Samen nicht rein
sein, so ist solch eine Partie weniger erwünscht. Im
allgemeinen wird der Preis von Samen hauptsächlich vom
Grad der Hybridreinheit bestimmt. Der gewünschte Grad
an Hybridreinheit und dessen Beziehung zum Preis ist
von Pflanze zu Pflanze verschieden. Bei Tomaten werden
zum Beispiel an die Hybridreinheit hohe Ansprüche
gestellt. Bei Kohlgewächsen ist man gewöhnlich
toleranter, und einige Prozent Hybridunreinheit sind
bei Kohlgewächsen annehmbar. Außerdem ist es wichtig,
ob es sich um Blumenkohl, Weißkraut, Rotkraut usw.
handelt.
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Die Erfindung wird nun anhand der folgenden
Abbildungen erläutert, wobei
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Abbildung 1 ein isoelektrisches
Fokussierungsmuster für den Tomaten-F1-Hybrid Bornia,
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Abbildung 2 ein isoelektrisches
Fokussierungsmuster für den Blumenkohl-F1-Hybriden
Plana, und
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Abbildung 3 eine schematische Darstellung der
Hybridqualitätsbestimmung oder Inzuchtbestimmung von
Samen mittels isoelektrischer Fokussierung zeigt.
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Abbildung 1 zeigt das F1-Hybridmuster für die
Tomate Bornia, wie man es durch isoelektrische
Fokussierung erhält, wobei die Bande für das
vaterspezifische Protein 3 und die Bande für das
mutterspezifische Protein 2 dargestellt sind.
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Abbildung 2 zeigt das F1-Hybridmuster für den
Blumenkohl Plana, wie man es durch isoelektrische
Fokussierung erhält, wobei die vaterspezifische Bande 6
und die mutterspezifische Bande 4 auch vorhanden sind.
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Abbildung 3 ist eine schematische Darstellung
der Bestimmung der Hybridqualität, auch als
Inzuchtbestimmung bezeichnet, einer Samenpartie mittels
isoelektrischer Fokussierung. Man verwendet eine
Gelplatte 7, die mit einer positiven Elektrode 8 und
einer negativen Elektrode 9 versehen ist. Gleich
oberhalb der positiven Elektrode befindet sich ein
Gummiprobenaufnahmestreifen 10 mit Vertiefungen 11.
Außerdem werden die mutterspezifischen und
vaterspezifischen Proteinbanden 12 und 13 sowie ein
F1-Hybridmuster 14 dargestellt, in welchem die
mutter- und vaterspezifischen Proteinbanden auch vorliegen.
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Bei der Inzuchtbestimmung einer Samenpartie
wird die wäßrige Proteinlösung jeweils eines Samens aus
der Samenpartie in die Vertiefung 11 des
Probenaufnahmestreifens 10 überführt.
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Dann nimmt man eine Proteinlösung eines Samens,
in dem lediglich mutterspezifische Proteine vorliegen,
und eine Proteinlösung eines Samens, in dem lediglich
vaterspezifische Proteine vorliegen, und schließlich
eine Proteinlösung eines F1-Hybriden, in dem beide
Proteinarten vorliegen. Wird die gewünschte
Potentialdifferenz zwischen positiver und negativer
Elektrode 8 bzw. 9 bei einem gewissen pH-Gradienten
angelegt, so erhält man nach Färbung mit einem
geeigneten Färbemittel oder mit Silbernitrat das
Proteinmuster, wie in Abbildung 3 dargestellt. In den
ersten drei Vertiefungen von links nach rechts befinden
sich mutterspezifische, F1-hybridspezifische und
vaterspezifische Proteinlösungen, und in den anderen
Vertiefungen die Proteinlösungen der Samen, deren
Hybridqualität, bzw. Inzucht, zu bestimmen ist. Die
mutter- und vaterspezifischen Proteine werden auch als
Markerproteine bezeichnet. Sollte eines der
Markerproteine fehlen, wie z.B. bei 15 (bei 15 fehlt
das vaterspezifische Protein), so handelt es sich um
eine Frage der Inzucht.
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Auf diese Weise läßt sich die Hybridqualität
verschiedenster F1-Hybridsamen von Gemüsepflanzen
bestimmen, zu denen unter anderem Tomaten,
Kohlgewächse, Capsicum-Arten und Melonen zählen.
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Beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet man
üblicherweise Wasser, das mit dem Milli-Q-System
(Millipore, Bedford, USA) gereinigt wurde.
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Weiterhin verwendet man: Acrylamid,
Bisacrylamid, Kathodenflüssigkeit 10 (die auf Arginin,
Lysin und Ethylendiamin basiert), Ampholyte (Servalyt
pH 6-9), Coomassie Brilliantblau R-250 (Serva Blue R),
Kerosin sowie das pI-Proteinkit (Bereich 3,6-9,6) von
Serva (Heidelberg, Bundesrepublik Deutschland);
Essigsäure, Glycin, Glycerin, sowie das pI-Proteinkit
(Bereich 5,65-8,3) sowie Trichloressigsäure von BDB
(Poole, Großbritannien).
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Die erfindungsgemäß für Beschichtungen und
Gelfixierung für PAGE (265 x 193 mm) verwendete
Gelfixierung sowie die Elektrodenstreifen (300 x 6 x
1 mm) wurden von Serva (Heidelberg, Bundesrepublik
Deutschland) bezogen. Mikrotiterplatten mit 96
Vertiefungen und flachem Boden wurden von Costar
(Cambridge, USA) bezogen. Das Klebeband (tesa, 100 um)
stammte von Beun de Ronde (Abcoude, Niederlande).
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Die erfindungsgemäß angewandte
Ultradünnschicht-Isoelektrofokussierung, kurz UDSEF,
ist ein für solch ein Vorgehen bekanntes Verfahren.
Zuerst werden Gele hergestellt.
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Die UDSEF-Gele wurden nach der von Radola
beschriebenen Plattenmethode hergestellt. Als
Abstandstreifen wird auf jeder Seite der
Gelfixierungsschicht (265 mm x 193 mm) Klebeband
verwendet. Mit drei Elektroden können zwei Gele der
Abmessungen 250 x 90 mm gleichzeitig gelaufen werden.
Gelfixierungsschicht und Beschichtungsfilm wurden auf
Glasplatten mit einigen Tropfen Wasser zwischen
Glasplatte und dem Film ausgerollt. Die
Polymerisationsmischung enthielt 1,32 ml Acrylamid (30%
w/v Monoacrylamid, 3% w/v Bisacrylamid); 5,72 ml 16%
Glycerin; 0,6 ml Ampholyte des gewünschten pH-Bereichs;
0,4 ml 1,5% Ammoniumpersulfat. Die Acrylamid-
Endkonzentration betrug 5%. Diese Mischung wurde an
einem Vakuumanschluß 3 Minuten lang stark entgast. Nach
dem Plattengießen und der Polymerisation wurden die
Gele direkt (nach mindestens 1 Stunde) verwendet oder
bei 4ºC nicht länger als eine Woche gelagert.
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Die Erfindung wird durch die folgenden
Beispiele, die jedoch keine Beschränkung darstellen,
erläutert.
Beispiel I
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Tomatensamen wurden in Mikrotiterplatten
überführt (96 Vertiefungen mit einem Volumen von
380 ul, ein Samen pro Vertiefung), und die Vertiefungen
wurden mit 80 ul 5mM NaCl-Lösung (4ºC) gefüllt. Die
Samen wurden mit einem selbstgebauten Gerät, das an
eine Bohrmaschine gekuppelt war, homogenisiert. Von den
so erhaltenen homogenen Proteinlösungen wurden mittels
einer Mikropipette bestimmte Mengen auf die
Geloberfläche aufgetragen, wobei man einen
Probenaufnahmestreifen, der mit mehreren Vertiefungen
versehen war, verwendete. Der Aufnahmestreifen befindet
sich ungefähr 5 mm von der Anode entfernt. Die
isoelektrische Fokussierung wird anschließend
folgendermaßen durchgeführt.
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Man verwendete ein mit einer gekühlten Platte
von 200 x 265 x 1 mm versehenes Elektrophoresegerät von
Desaga (DESAPHOR HE 200), das an eine Gleichstromquelle
ECPS 3000/150 von Pharmacia und an ein RC3-Kühlgerät
von Lauda (bei einer Temperatur von 10ºC) angeschlossen
war. Die Gele wurden auf die Kühlplatte gelegt, wobei
einige Tropfen Kerosin für guten Kontakt sorgten. Die
Elektrodenstreifen wurden in 0,5 M Glycin
(Anodenstreifen) bzw. Kathodenflüssigkeit 10
(Kathodenstreifen) getaucht. Die Elektroden wurden auf
die Streifen gelegt und dann mit einer Glasplatte
abgedeckt, um guten elektrischen Kontakt zu
gewährleisten. Bei einer Einstellung von 10 W, 2000 V
und 12 mA wurde eine Vorfokussierung vorgenommen. Die
Vorfokussierung begann bei etwa 240 V und 3,5 W, bis
die Spannung ungefahr 800 V erreichte (15-20 Minuten).
Nach dem Auftragen der Proben setzte man die
Fokussierung bei den gleichen Einstellungen 3000 Vh
(80-90 Minuten) fort. Anschließend wurde das Protein
folgendermaßen angefärbt.
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Nach der Fokussierung wurden die Gele 5 Minuten
in 20% Trichloressigsäure getaucht; anschließend wurden
die Gele 10 Minuten in eine Färbelösung getaucht (0,05%
Serva Blue R in Entfärbelösung; Serva Blue R war zuerst
in 10 ml Methanol gelöst worden). Die Gele wurden in
drei Waschvorgängen 5 Minuten mit einer Entfärbelösung
(10% Essigsäure, 40% Methanol; 50% Wasser; v/v/v)
entfärbt, bis die Hintergrundfärbung vollständig
verschwunden war. Nach Spülen mit Wasser wurden die
Gele luftgetrocknet und aufbewahrt.
Nomenklatur
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Ein Symbol für das der vorliegenden Studie
zugrundeliegende Protein wurde nach den Regeln der
Tomato Genetic Cooperative gewählt. Das Protein wird
mit drei Großbuchstaben und einer Nummer bezeichnet:
PRS-1 bedeutet Samenprotein. Der Grund für die Vergabe
dieser Nummer besteht darin, daß genetische Varianten
anderer Samenproteine gefunden wurden (worüber keine
Ergebnisse publiziert wurden). Die als Vergleich
gewählte Sorte Marglobe enthält das Allel Prs-1&spplus; (in
Kursiv mit großem Anfangsbuchstaben und einem kleinen
Buchstaben bezeichnet), welches den Kode für das
Protein PRS-1&spplus; (das Protein mit einem pI von 7,1)
darstellt. Weitere Allele und von ihnen kodierte
Proteine werden mit Ziffern bezeichnet werden: die
fremdbefruchtende Sorte Moneymaker hat das Allel
Prs-1¹, welches den Kode für das Protein PRS-1¹ (das
Protein mit einem pI von 6,1) darstellt.
Ergebnisse
Nachweis und isoelektrische Fokussierung von
PRS-l-Proteinvariationen.
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Eine Isoelektrofokussierungsstudie der
wasserlöslichen Samenproteine von fremdbefruchtenden
Tomatensorten mittels UDSEF im pH-Bereich 6 bis 9 zeigt
zusätzlich zu vielen weiteren Banden zwei variable
Proteinbanden. Das variable Protein in der mit Marglobe
bezeichneten Sorte wird PRS-1&spplus; bezeichnet (siehe
Nomenklatur), und die andere, in den fremdbefruchtenden
Sorten Moneymaker und Napoli gefundene Variante PRS-1¹.
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Die isoelektrischen Punkte, d.h. die pIs,
beider Proteine wurden mit Hilfe von Referenzproteinen
mit bekanntem pI unter Standard-
Elektrophoresebedingungen geschätzt. Die pIs für PRS-1&spplus;
und PRS-1¹ scheinen bei 7,1 bzw. 6,1 zu liegen.
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Für eine gute Routineerfassung der Variante
PRS-1 war die Intensität der PRS-1-Bande, wie sie sich
aus der UDSEF-Analyse des Rohextrakts eines
Tomatensamens ergab, zu gering. Bei Pflanzen, die beide
PRS-1-Varianten enthalten, war dies umso mehr der Fall.
Weiterhin neigt das PRS-1¹-Protein dazu, in der Nähe
seines isoelektrischen Punkts auszufallen. Es wurden
daher verschiedene Möglichkeiten geprüft, um einen
verläßlichen Nachweis des PRS-1&spplus;-Proteins zu
garantieren. Die Verwendung von Harnstoff sowie eine
hohe Salzkonzentration im Probenpuffer hatten zur
Folge, daß sich viele Proteine im Gel zeigten, die eine
eindeutige Identifizierung des PRS-1-Proteins unmöglich
machten. Die Verwendung eines Probenpuffers mit
niedriger ionogener Stärke führte zu einer besseren
Löslichkeit des PRS-1-Proteins und einer höheren
Stabilität der PRS-1&spplus;-Variante in der Nähe ihres pI
während der isoelektrischen Fokussierung.
Beispiel II
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Wie in Beispiel I beschrieben, wurde die
F1-Hybridqualität von Kohlgewächsen dadurch bestimmt,
daß man die mutter- und vaterspezifischen Proteine mit
einem isoelektrischen Punkt von 6,7 bzw. 7,4 für PRS-1&spplus;
bzw. PRS-1¹ verwendete. Je nach Größe wurden die Samen
in 80 bis 150 ul Wasser gemahlen. Der pH-Gradient
betrug 6-9. Die Färbung wurde mit Silbernitrat wie bei
Merrill beschrieben durchgeführt.
Beispiel III
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Wie in Beispiel I beschrieben, wurde die
Hybridqualität von Melonen bestimmt. Hier verwendete
man die mutter- und vaterspezifischen, wasserlöslichen
PRS-Proteine mit einem isoelektrischen Punkt von 5,7,
5,8, 5,9, 6,0, 7,0, 8,5, 8,6 und 8,7. Weiterhin
verwendete man in 8M Harnstoff lösliche Proteine mit
einem isoelektrischen Punkt von 5,3, 5,4, 5,5, 5,6,
6,1, 6,5, 8,9, 9,0, 9,7 und 9,9. Die Samen wurden in 1
ml Flüssigkeit in Mikrotiterplatten mit flachen Böden
(26 Vertiefungen, Inhalt 3,8 ml) in 8M Harnstoff
gemahlen. Färbung mit Coomassie oder mit Silbernitrat.
Es wurden verschiedene pH-Gradienten verwendet.
Beispiel IV
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Wie in Beispiel I beschrieben, wurde die
Hybridqualität von Capsicum-Arten dadurch bestimmt, daß
man die mutter- und vaterspezifischen Proteine in 8M
Harnstoff mit einem isoelektrischen Punkt von 4,0 bzw.
5,2 für PRS-1&spplus; bzw. PRS-1¹ verwendete. Die Samen wurden
in 100 ul 8M Harnstoff gemahlen. Der pH-Gradient betrug
3-6. Färbung mit Coomassie.
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Es ist selbstverständlich, daß sich die
Erfindung nicht auf die oben genannten Beispiele
beschränkt, sondern daß sich, wie in Beispiel I
beschrieben, auch die Hybridqualität anderer
Gemüsepflanzen, wie von Eierfrüchten, Einlegegurken,
Zucchini, Gurken, Radieschen usw. rasch und verläßlich
bestimmen läßt.