DE3234761C2

DE3234761C2 -

Info

Publication number: DE3234761C2
Application number: DE3234761A
Authority: DE
Inventors: Palle Ballerup Dk Schneider; Sven Chalottenlund Dk Branner-Joergensen
Original assignee: Novo Industri AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1981-09-21
Filing date: 1982-09-20
Publication date: 1991-07-25
Also published as: DK416881A; GB2106521B; US4455375A; DK147376C; FR2522681A1; GB2106521A; DK147376B; FR2522681B1; NL8203631A; NL192290C; DE3234761A1; NL192290B; BE894447A

Description

Die Erfindung betrifft eine stabilisierte Lösung von Rennin gemäß Anspruch 1. Die Unteransprüche nennen Ausgestaltungen der Erfindung.

Aufgrund der leichteren Dosierung wird Rennin im allgemeinen als Lösung auf den Markt gebracht. Eine Renninlösung ist im allgemeinen jedoch nicht so stabil wie ein Renninpulver bezüglich der Renninaktivität, insbesondere bei höheren Temperaturen. Es können Stabilisierungsmittel zu der Renninlösung zugesetzt werden, um die Stabilität zu erhöhen und ein üblicherweise angewandtes Stabilisierungsmittel ist Sorbit, das üblicherweise in einer Menge von etwa 50% (Gew./Gew.), bezogen auf die Lösung, zugesetzt wird.

Der Hauptanteil eines solchen Stabilisierungsmittels, das zu der Renninlösung zugegeben wird, wird während der Molkenphase aufgenommen. Da jedoch auch ein kleiner Teil während der Quarkphase aufgenommen wird, findet sich das Stabilisierungsmittel in dem schließlich (aus der Milch) hergestellten Käse. Zum Beispiel ist dies im Falle von Sorbit, das ein Fremdstoff ist, höchst unerwünscht und tatsächlich wird Sorbit in einigen Ländern für diesen Zweck nicht zugelassen. Außerdem ist Sorbit ein verhältnismäßig teures Material und aufgrund der Tatsache, daß ungefähr 50% Sorbit zugegeben werden müssen, um eine sinnvolle Stabilisierung zu erreichen, ist der Preis der stabilisierten Renninlösung wesentlich höher als derjenige einer nicht stabilisierten Renninlösung.

Es besteht daher Bedarf an einer stabilisierten Renninlösung, bei der das Stabilisierungsmittel nicht den Charakter eines Fremdstoffs hat und bei dem das Stabilisierungsmittel nicht wesentlich zu den Kosten der Renninlösung beiträgt.

Es hat sich nun überraschenderweise gezeigt, daß kleine Mengen von Methionin eine starke Stabilisierungswirkung auf die Enzymaktivität des Rennins ausüben.

Die Erfindung betrifft eine stabilisierte Lösung Rennin, bei der das Stabilisierungsmittel Methionin in einer Menge entsprechend einer Konzentration zwischen 0,1 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Lösung, und einer gesättigten Lösung zugegeben worden ist.

Die Renninaktivität in der Renninlösung beträgt mindestens 5000 RE/ml und vorzugsweise mindestens 10 000 RE/ml.

Die Renninaktivität, die in RE/ml (RE=Rennineinheiten) angegeben ist, wird nach dem British Standard 3624: 1963 (Method of the determination of the milk coagulating power of rennet) gemessen.

Vorzugsweise wird das Methionin in einer Menge entsprechend einer Konzentration zwischen 0,2 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Lösung, und einer gesättigten Lösung zugegeben.

Eine gesättigte Renninlösung ist in Beziehung auf Methionin im allgemeinen eine 2 bis 3%ige (Gew./Gew.) Lösung in Abhängigkeit von den anderen Bestandteilen in der Lösung und der Temperatur. Im Falle von beispielsweise einer destabilisierten Renninlösung, wie später beschrieben, reagiert ein Rückstand des Destabilisierungsmittels mit Methionin, wodurch weniger Methionin für die erfindungsgemäßen Zwecke zur Verfügung steht und folglich ist es erforderlich, mehr Methionin zuzusetzen, um eine gesättigte Lösung zu erhalten.

Wie jedoch aus den folgenden Beispielen hervorgeht, wird Methionin in allen Fällen in so kleinen Mengen, verglichen mit dem üblicherweise angewandten Sorbit, verwendet, daß eine deutliche Verringerung der Kosten erzielt wird.

Methionin wird vorzugsweise in einer Menge entsprechend einer Konzentration zwischen 0,1 und 2 und insbesondere zwischen 0,5 und 1,5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Lösung, zugegeben.

Da Methionin eine essentielle Aminosäure ist, die bereits im Käse enthalten ist, werden durch Verwendung von Methionin als Stabilisierungsmittel dem Käse keine Fremdstoffe zugeführt. Ferner wird nur eine sehr kleine Menge Methionin zugesetzt im Vergleich mit derjenigen, die bereits im Käse enthalten ist.

In der US-PS 30 51 627 und der GB-PS 8 66 423 ist angegeben, daß Methionin innerhalb einer Gruppe von verschiedenen Aminosäuren als Stabilisierungsmittel für Lösungen von Chymotrypsin angewandt werden kann. Die Erfindung bezieht sich jedoch speziell auf die Verwendung von Methionin zur Stabilisierung von Rennin.

Darüber hinaus geht aus Tabelle D dieser Patentschriften hervor, daß die untersuchten Aminosäuren einschließlich D,L-Methionin im wesentlichen die gleiche Wirkung zeigen. Es ist demgegenüber äußerst überraschend, daß Methionin, wenn es erfindungsgemäß als Stabilisierungsmittel für eine Renninlösung angewandt wird, als einzige Substanz aus einer großen Gruppe von Aminosäuren zu der erwünschten Stabilisierung führt. Nach der GB-PS 9 00 115 kann D,L-Methionin als Stabilisierungsmittel für Trypsinlösungen angewandt werden. D,L-Methionin wird jedoch nur als ein Beispiel für mögliche Aminosäuren in dem allgemeinen Teil der Beschreibung erwähnt und die Wirkung wird nicht im experimentellen Teil nachgewiesen. Darüber hinaus müssen die Aminosäuren in Kombination mit einem Calciumsalz verwendet werden (Seite 1, Zeilen 35 bis 39).

Vorzugsweise wird für die erfindungsgemäße stabilisierte Renninlösung Methionin in der D,L-Form verwendet.

Es ist ebenfalls bevorzugt, Methionin in der L-Form zu verwenden.

Als mikrobiologisches Rennin ist zu erwähnen solches, das gebildet worden ist von Mucor miehei, Mucor pusillus und Endothia parasitica und die Erfindung betrifft vorzugsweise eine stabilisierte Lösung von Rennin, die als Rennin ein solches enthält, das gebildet worden ist von Mucor miehei.

Ferner ist es bevorzugt, daß eine erfindungsgemäß stabilisierte Renninlösung ein Rennin enthält, das gebildet worden ist von Mucor miehei und dessen thermische Stabilität verringert worden ist.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen stabilisierten Renninlösung enthält ein Rennin, das gebildet worden ist von Mucor miehei und dessen thermische Stabilität verringert worden ist, nach dem Verfahren wie es angegeben ist in der US-PS 42 55 454 oder den BE-PS 8 82 689 oder 8 82 690.

Wenn ein Oxidationsmittel zur Verringerung der thermischen Stabilität angewandt wird, führt die Verwendung von Methionin nach der Erfindung zu einem weiteren Vorteil, da Methionin ein Reduktionsmittel ist und dadurch möglicherweise noch vorhandene, kleine Rückstände an Oxidationsmitteln reduziert, wodurch solche unerwünschten Bestandteile von dem Produkt entfernt werden.

Methionin wird üblicherweise in einer der End-Gewinnungsstufen bei der Herstellung des mikrobiologischen Rennins zugegeben und wenn die thermische Stabilität des mikrobiologischen Rennins durch ein Oxidationsmittel verringert worden ist, muß das Methionin nach dieser Destabilisierung zugegeben werden.

Der Gehalt an aktivem Enzym in den Renninlösungen wird auf 0,2 bis 4, vorzugsweise auf 0,25 bis 3 Gew.-% eingestellt, z. B. durch Zugabe einer Natriumchloridlösung.

Die beiliegende Figur zeigt die Restaktivität eines Rennins von Mucor miehei (Rennilase 50 L Typ TL) bei 40°C nach 2 und 4 Wochen. Es scheint, daß die Stabilisierungswirkung von L-Methionin größer ist als diejenige von D,L- Methionin, besonders bei niedrigeren Konzentrationen.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Das für diesen Versuch angewandte Rennin war ein handelsübliches destabilisiertes Rennin von Mucor miehei (Rennilase 50 L, Typ TL), das entsprechend Beispiel 3 der BE-PS 8 82 689 hergestellt worden war (ungefähr 1,6 Vol.-%, 2,25 m NaOCl).

Dieses Produkt wurde mit einer Lösung von 18 Gew.-% Natriumchlorid auf einen Gehalt von ungefähr 1% wirksames Enzym standardisiert.

Zwei Ansätze dieser Rennilase 50 L, Typ TL wurden auf die Lagerbeständigkeit bei pH 6,5 untersucht, wobei die Versuche mit einem Vergleich ohne Zusatz eines Stabilisierungsmittels und einer Probe mit 1 Gew.-% D,L-Methionin durchgeführt wurden. Die Untersuchung der Stabilität wurde durchgeführt durch Untersuchung der "normalen" Stabilität bei 25°C und durch Untersuchung der Stabilität bei 40°C. Die Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle hervor.

Tabelle I

Aus diesen Daten geht hervor, daß der Zusatz von 1 Gew.-% D,L-Methionin zu einer deutlichen Verbesserung der Lagerstabilität führt.

Beispiel 2

Um die Stabilisierungswirkung von Methionin mit derjenigen einiger anderer Aminosäuren zu vergleichen, wurde jeweils 1 Gew.-% verschiedener Aminosäuren zu einer Rennilase 50 L, Typ TL (Ansatz PRN 4518, hergestellt wie in Beispiel 1 angegeben) zugegeben. Eine Probe ohne Zusatz irgendeiner Aminosäure wurde als Vergleich herangezogen. Alle Proben wurden auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt. Die Proben wurden 2 Wochen bei 40°C gelagert und die noch vorhandenen Aktivitäten bestimmt. Man erhielt die in Tabelle II angegebenen Ergebnisse.

Rennilase 50 L, Typ TL
% noch vorhandene Aktivität nach 2 Wochen bei 40°C
Vergleich ohne Aminosäure
69,8
1% D,L-Methionin	88,1
1% L-Asparagin	72,2
1% L-Histidin · HCl	74,5
1% L-Arginin	74,1
1% L-Lysin	72,0
1% La-Na-Glutaminat	71,7

Aus diesen Ergebnissen geht hervor, daß nur Methionin zu einer deutlichen Stabilisierung des Rennins führt.

Beispiel 3

Die Stabilisierungswirkung von Methionin wurde bei diesem Versuch verglichen mit derjenigen weiterer Aminosäuren. Es wurden 2 Gew.-% der Aminosäuren zu einer Rennilase 50 L, Typ TL (Ansatz PRN 4516, hergestellt wie in Beispiel 1 angegeben) zugegeben. Als Vergleich wurde eine Probe ohne Zusatz irgendeiner Aminosäure angewandt. Alle Proben wurden auf einen pH-Wert von 6,5 gebracht und 2 Wochen bei 40°C gelagert. Die noch verbliebenen Aktivitäten gehen aus der folgenden Tabelle hervor.

Rennilase 50 L, Typ TL
% noch vorhandene Aktivität nach 2 Wochen bei 40°C
Vergleich ohne Aminosäure
74
2% D,L-Methionin	96
2% Glycin	77
2% D,L-Alanin	78

Beispiel 4

Bei diesem Versuch wurde die Stabilisierungswirkung von D,L-Methionin mit derjenigen von L-Methionin verglichen. Ferner wurde die Wirkung eines Methioninderivates, nämlich von D,L-Methionin-sulfoxid, und einer anderen Aminosäure, L-Cystein, untersucht. Unterschiedliche Mengen der verschiedenen Aminosäuren wurden zu einer Rennilase 50 L, Typ TL (gemischte Ansätze von gleichen Teilen PRN 4526, PRN 4527 und PRN 4528) zugegeben. Eine Probe ohne Zusatz von Aminosäuren wurde als Vergleich herangezogen. Alle Proben wurden auf einen pH-Wert von 6,5 gebracht und 2 und 4 Wochen bei 40°C und 26 Wochen bei 25°C gelagert. Die noch vorhandenen Aktivitäten gehen aus der folgenden Tabelle hervor.

Tabelle IV

Aus diesen Werten geht hervor, daß L-Methionin eine noch bessere Stabilisierung der Renninzubereitung ergibt als das D,L-Methionin. L-Cystein hat keine Wirkung und L-Methionin-sulfoxid nur eine geringe Wirkung auf die Stabilität.

Beispiel 5

Die Stabilisierungswirkung von D,L-Methionin wurde untersucht in einer Lösung von 10 Gew.-% eines handelsüblichen Rennins von Mucor pusillus, Nourylab 1 : 220 000 (Charge No. 75 I, 1-22), wobei eine Lösung von 18 Gew.-% Natriumchlorid zur Konservierung zugesetzt war. Der pH-Wert der Proben wurde auf 4,7 eingestellt und eine Vergleichsprobe und eine Probe mit 1% D,L-Methionin bei 40°C, 25°C und 4°C inkubiert und die verbliebenen Gerinnungsaktivitäten bestimmt.

Tabelle V

Aus diesen Werten geht hervor, daß durch D,L-Methionin auch eine wirksame Stabilisierung der Lagerbeständigkeit von Rennin von Mucor pusillus erzielt werden kann.

Beispiel 6

Das Ausgangsmaterial für diesen Versuch war ein Renninkonzentrat, hergestellt wie in der GB-PS 11 08 287 "2nd Pilot Plant Experiment" angegeben, wobei lediglich die Kulturflüssigkeit auf eine Aktivität entsprechend ungefähr einer 1%igen Lösung des reinen Enzyms eingestellt wurde.

Dieses Material wurde weiter gereinigt und konzentriert durch Ausfällen mit 40% (Gew.-/Vol.) Ammoniumsulfat und gewaschen mit Leitungswasser während der anschließend durchgeführten Ultrafiltration. Das erhaltene Renninkonzentrat (Ansatz PRB 1031) enthielt ungefähr 4% aktives Enzym nach Zugabe von 18 Gew.-% Natriumchlorid zur Konservierung.

Der Stabilitätstest wurde mit 2 Gehalten an D,L-Methionin und einer Vergleichsprobe bei 40°C, pH 6,8 durchgeführt. Man erhielt die in Tabelle VI angegebenen Ergebnisse.

Tabelle VI

Claims

1. Stabilisierte Lösung von mikrobiologischem Rennin, wobei die Renninaktivität in der Lösung mindestens 5000 RE/ml, gemessen nach dem British Standard 3624: 1963, beträgt, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Stabilisierungsmittel Methionin in einer Menge entsprechend einer Konzentration zwischen 0,1 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Lösung, und einer gesättigten Lösung enthält.

2. Renninlösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration an Methionin zwischen 0,2 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Lösung, und einer gesättigten Lösung liegt.

3. Renninlösung nach Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration an Methionin zwischen 0,5 Gew.-% und 1,5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Lösung, liegt.

4. Renninlösung nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Methionin D,L-Methionin ist.

5. Renninlösung nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Methionin L-Methionin ist.

6. Renninlösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das mikrobiologische Rennin erhalten worden ist von Mucor miehei.

7. Renninlösung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Rennin thermisch destabilisiert ist.