NL192290C

NL192290C - Gestabiliseerde oplossing van stremsel.

Info

Publication number: NL192290C
Application number: NL8203631A
Authority: NL
Original assignee: Novo Industri As
Priority date: 1981-09-21
Filing date: 1982-09-20
Publication date: 1997-05-07
Also published as: GB2106521B; GB2106521A; DE3234761A1; NL8203631A; BE894447A; DK147376B; DK147376C; FR2522681B1; DK416881A; US4455375A; NL192290B; DE3234761C2; FR2522681A1

Description

Gestabiliseerde oplossing van stremsel

De uitvinding heeft betrekking op een oplossing van microbieel stremsel.

Microbieel stremsel wordt meestal als oplossing verhandeld, omdat een oplossing gemakkelijker 5 doseerbaar is. Vooral bij hogè temperaturen echter is een oplossing van stremsel in het algemeen minder stabiel wat betreft activiteit dan een stremselpoeder. Daarom wordt aan een stremseloplossing vaak een stabilisator toegevoegd en een gangbare stabilisator is sorbitol, dat gewoonlijk in een hoeveelheid van ongeveer 50 gew.%, berekend op de totale oplossing, wordt toegevoegd.

Bij de kaasbereiding blijft het merendeel van een dergetijke stabilisator in de weifase editor. Aangezien 10 een klein deel echter ook in de wrongel wordt opgenomen, zal de stabilisator zich ook in de uiteindelijk voortgebrachte kaas bevinden. In het geval van sorbitol is dit zeer ongewenst, omdat sorbitol een product* vreemd materiaal is en om die reden wordt sorbitol in sommige landen voor dit doel niet toegelaten. Bovendien is sorbitol tamelijk duur en omdat het ode nog eens in een hoge concentratie van 50% dient te worden toegevoegd om een redelijke stabilisatie te verkrijgen, is de prijs van een aldus gestabiliseerde 15 stremseloplossing aanzienlijk hoger dan die van een niet-gestabiliseerde stremseloplossing.

Er bestaat derhalve behoefte aan een gestabiliseerde stremseloplossing, waarbij de stabilisator niet het karakter van een vreemde stof vertoont en waarbij de stabilisator niet zeer veel toevoegt aan de prijs van de stremseloplossing.

De uitvinding is gelegen in de verrassende vondst dat kleine hoeveelheden methionine een sterk 20 stabiliserend effect op de enzymatische activiteit van microbieel stremsel vertonen.

Volgens de uitvinding wordt een gestabiliseerde stremseloplossing verschaft, waarbij de stabilisator methionine is toegevoegd in een hoeveelheid die overeenkomt met een concentratie tussen 0,1 gew.% berekend op het totale gewicht van de oplossing en die van een verzadigde oplossing.

Bij een voorkeursuitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding wordt de methionine toegevoegd in een 25 hoeveelheid, de overeenkomt met een concentratie van ten minste 0,2 gew.% berekend op het totale gewicht van de oplossing.

De strem selectiviteit in de stremseloplossing is ten minste 5 000 RU/ml en bij voorkeur ten minste 10.000 RU/ml:

De stremselactivKeit aangegeven in RU/ml (RU = stremseleenheden) wordt gemeten volgens de Britse 30 norm 3624:1963 (Method for the determination of the milk coagulating power of rennet).

Een verzadigde oplossing van methionine bevat in het geval van een stremseloplossing gewoonlijk een 2-3 gew.%, afhankelijk van de andere bestanddelen in de oplossing en de temperatuur. In het geval van . bijvoorbeeld een gedestabiliseerd stremsel zoals later beschreven, zal een rest van de destabilisator reageren met methionine, waarbij minder methionine ter beschikking zal zijn voor de doeleinden volgens de 35 uitvinding en als gevolg zal meer methionine nodig zijn om een verzadigde oplossing te verkrijgen.

Methionine wordt echter, zoals uit de volgende voorbeelden zal blijken, in alle gevallen in zo geringe hoeveelheden gebruikt in vergelijking met het in de handel gebruikte sorbitol, dat een opmerkelijke vermindering van de kosten wordt verkregen.

Methionine wordt bij voorkeur toegevoegd in een hoeveelheid die overeenkomt met een concentratie 40 tussen 0,1 en 2 en meer bij voorkeur tussen 0,5 en 1,5 gew.% berekend op het totale gewicht van de oplossing.

Aangezien methionine een essentieel aminozuur is, dat reeds in kaas aanwezig is, wordt geen vreemde stof in de kaas ingevoerd door het gebruik van methionine als stabilisator. Voorts wordt slechts een ondergeschikte hoeveelheid methionine toegevoegd in vergelijking met de hoeveelheid (Se reeds in de kaas 45 aanwezig is.

In het Amerikaanse octrooi schrift 3.051:627 en in het Britse octnooischrift 866.423 is beschreven, dat methionine onder een groep van verschillende aminozuren, gebruikt kan worden als stabilisator voor oplossingen van chymotrypsine. De onderhavige lötvincfing is echter specifiek tot methionine beperkt en eveneens is de uitvinding specifiek gericht op stremsel.

50 Voorts blijkt uit tabel D bij de hiervoor vermelde odrooischriften, dat de onderzochte aminozuren, met inbegrip van D.L*methiohine nagenoeg hetzelfde effect vertonen.

Derhalve is het een zeer verrassende vondst dat methionine, indien als stabilisator gebruikt in een stremseloplossing volgens de onderhavige uitvinding, gebleken is de enige effectieve stabilisator te zijn onder een grote groep andere aminozuren.

55 Volgens het Britse octnooischrift 900.115 kan D,L-methionine gebruikt worden als stabilisator voor trypsineopiossingen. Echter wordt D,L-methionine slechts vermeld als een voorbeeld van beschrijving, waarbij in het experimentele deel geen effect gedocumenteerd wordt. Bovendien worden de aminozuren 192290 2 geacht gebruikt te worden in combinatie met een calciumzout, zie bladzijde 1, regels 35-39.

Voor de gestabiliseerde stremseloplossing volgens de uitvinding kan methionine worden gebruikt in de D,L-vorm.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm wordt methionine in de L-vorm gebruikt, daar de L-vorm tot een 5 verdere stabilisatie leidt.

Als microbiêle stremsels kunnen de volgende vermeld worden: Mucor tniehei stremsel, Mucor pusillus stremsel en Endothia parasitica stremsel en een voorkeursuitvaeringsvorm van de gestabiliseerde stremseloplossing volgens de uitvinding is, dat het stremsel is afgeleid van Mucor miehel.

Bij voorkeur is het stremsel dat afkomstig is van Mucor miehei thermisch gedestabiliseerd. Het stremsel 10 van Mucor miehei is dan bij voorkeur gedestabiliseerd volgens één van de werkwijzen van de Nederlandse octrooiaanvragen 79.09211,80.02050 en 80.02082. De werkwijzen houden respectievelijk in: a) acylering met een derivaat van een monocaibonzuur bij pH 6-11 en bij O-40°C; b) oxidatie met een actieve halogeenverbinding waarin hei halogeen een axfdatietoestand tussen 0 en 3 heeft; of IS c) oxidatie met een peroxyzuur of zout daarvan.

Wanneer als thermische destabilisator een oxidatiemiddel gebruikt wordt, vormt het gebruik van methionine volgens de uitvinding een verder voordeel, aangezien methionine een reductiemiddel is, dat eventuele resten van het oxidatiemiddel wegneemt en daarmee ongewenste bestanddelen in het product beperkt.

20 Methionine wordt gewoonlijk bij één van de uiteindelijke winningstrappen bij de bereiding van het microbiêle stremsel toegevoegd en wanner het microbiêle stremsel is gedestabiliseerd met een oxidatiemiddel, dient het methionine toegevoegd te worden na het destabitisatièproces.

Het gehalte aan actief enzym in de stremseloplossing en wordt geregeld op 0,2-4, bij voorkeur 0,25-3 gew.%, bijvoorbeeld door toevoeging van een natrfumchlorideoplossing.

25 De figuur geeft de testactiviteit weer van een Mucor miehei stremsel (Rennilase 50 L type TL) bij 40°C na 2 en 4 weken. Het blijkt, dat het stabiliserende effect van L-methionine groter is dan dat van D,L-methionine, in het bijzonder bij lagere concentraties.

Voorbeeld I

30 Het stremseipreparaat, dat voor dit experiment werd gebruikt, was een in de handel verkrijgbaar gedestabiB-seerd Mucor miehei stremsel (Rennilase 50 L type TL), bereid volgens voorbeeld III van de Nederlandse octrooiaanvrage 80.02050 (destabilisering met 1,6 vol.% 2,25 moM NaOCI bij 5°C, pH 7 gedurende 15 uur, gevolgd door toevoeging van 2 vol.% 1 moM Na2S03 en warmtebehandeling.

Dit preparaat wordt gestandariseerd met een 18 gew.% natriumchlorideoplossing op een gehalte van 35 ongeveer 1% actief enzym.

Twee ladingen van dit Rennilase 50 L type TL zijn beproefd op stabiliteit bij opslag bij een pH van 6,5, waarbij de experimenten zijn uitgevoerd met een referentieproef zonder stabilisator en een monster met 1 gew.% D,L-metMonine. De proeven over de opslagstabilrteit zijn uitgevoerd als een "normale” stabiliteits-proef bij 20eC en als een versnelde proef bij 40°C, waarvan de resultaten uit de volgende tabel blijken.

40

TABELA

% testactiviteit

45 Incubatietemperatuur 25°C 40*C

Incubatietijd 4 weken 18½ weken 2 weken hiding referentie, zonder stabilisator 85,3 81,3 74.3 50 PRN 4519 met 1% D,L-meth»onine 102,0 97,9 89,5 lading referentie, zonder stabilisator 97,1 81,0 75,5 PRN 4520 mst 1% D,L-methionine 102,8 94,4 88,4 55 Uit da tabel blijkt, dat da toevoeging van 1 gew.% D.L-msthionine een opmerkelijke verbetering van de opslagstabiliteit verschaft.

3 192290

Voorbeeld II

Ten einde het stabiliserende effect van methionine te vergelijken met dat van enkele andere aminozuren werd 1 gew.% van verschillende aminozuren toegevoegd aan een Rennilase 50 L type TL (lading PRN 4518 bereid zoals aangegeven in voorbeeld I). Een monster zonder enige toevoeging van aminozuur werd 5 als referentie toegepast. Alle monsters werden op een pH van 6,5 ingesteld. De monsters werden 2 weken bij 40°C bewaard en de restactiviteiten werden bepaald, zie tabel B.

TABELB

10 Rennilase 50 L type TL % testactiviteit na 2 weken bij 40°C

Referentie zonder toegevoegd aminozuur 69,8 met 1% D,L-methionine 88,1 met 1% L-asparagine 72,2 1S met 1% L-histidine, HCI 74,5 met 1% L-arginine 74,1 met 1% L-iysine 72,0 met 1% L*Na*glutamaat 71,7 20

Uit de tabel blijkt, dat slechts methionine een effectieve stabilisatie van het stremselpreparaat verschaft. Voorbeeld III

Het stabiliserende effect van methionine werd bij dit experiment vergeleken met dat van andere aminozuren. 25 2 gew.% van de aminozuren werd aan een Rennilase 50 L type TL toegevoegd (lading PRN 4516 bereid zoals aangegeven in voorbeeld I). Als referentie werd een monster gebruikt waaraan geen aminozuren waren toegevoegd. Alle monsters werden op een pH van 6,5 ingesteld en werden 2 weken bij 40°C bewaard. De restactiviteiten blijken uit de volgende tabel.

30 TABEL C

Rennilase 50 L type TL % testactiviteit na 2 weken bij 40°C

Referentie zonder toegevoegd aminozuur 74 35 met 2% D.L-methionine 96 met 2% glycine 77 met 2% D.L-alanine 78

40 Voorbeeld IV

Bij dit experiment werd het stabiliserende effect van D.L-methionine vergeleken met dat van L-methionine. Voorts werd het effect van een methioninederivaat, D,L-methioninesulfoxide en een ander zwavelhoudend aminozuur, L-cysteïne, onderzocht. Verschillende hoeveelheden van de verschillende aminozuren werd toegevoegd aan een Rennilase 50 L type TL (gemengde ladingen van gelijke delen PRN 4526, PN 4527 en 45 PRN 4528). Een monster zonder enige toevoeging van aminozuren werd als referentie gebruikt. Alle monsters werden op een pH van 6,5 ingesteld en gedurende 2 en 4 weken bij 40°C en gedurende 26 weken bij 25®C bewaard. De restactiviteiten blijken uit de volgende tabel.

TABELD

50 ----—----:-:-

Rennilase 50 L type TL % restactiviteit

Incubatietempeiatuur 25°C 40°C

55 Incubatietijd 26 weken 2 weken 4 weken 192290 4 ! TABEL D (vervolg)

Rennilase 50 L type TL % restactivlteh 5 Ret zonder toegevoegd aminozuur 63 66 53 met 0,25% D,L-methionine 70 71 58 met 0,50% D.L-methionine 76 77 65 met 1,0% D,L-methionine 84 83 74 met 2,0% D,L-methionine 90 90 85 10 met 0,25% L-methionine 78 84 70 met 0,50% L-methionine 83 88 75 met 1,0% L-methionine 89 92 81 met 2,0% L-methionine 96 94 81 met 1,0% D,L-methioninesuifoxide 67 74 60 15 met 2,0% L-cysteine 60 67 57

Het blijkt uit de tabel dat L-methionine een betere stabilisatie van het stremselpreparaat verschaft dan D,L-methionine. L-cysteine heeft geen effect en D,L-methioninesulfoxide heeft slechts een ondergeschikt 20 effect op de stabiliteit.

Voorbeeld V

Het stabiliserende effect van D,L-methionine is onderzocht in een 10 gew.% oplossing van een in de handel verkrijgbaar Mucor pusillus stremsel, Nourylab 1:220.000 (lading no. 7511-22) waaraan 18 gew.% 26 natriumchloride ter conservering is toegevoegd. De pH van de monsters werd op 4,7 ingesteld en een referentiemonster en een monster met 1% D,L-methionine werden bij 40°C, 25°C en 4°C geïncubeerd en de reststoilingsactiviteiten werden bepaald.

TABEL E

30 ----- 10 gew/gew% Nourylab % testactiviteit

Incubatietemp. 406C 25®C 4°C

35 Incubatietijd 2 weken 4 weken 4 weken 4 weken 26 weken

Referentie zonder toegevoegd 34 25 55 93 76 aminozuur met 1% D,L-methionine 51-39 73 96 88 40 --

Het blijkt dat D,L-methionine eveneens een opmerkelijke verbetering verschaft van de opslagstabiüteit van Mucor pusillus stremsel.

45 Voorbeeld VI

Het uitgangsmateriaal voor dit experiment was een stremselconcentraat bereid zoals aangegeven in het "2nd Pilot Plant Experiment" in het Britse octrooi schrift 1.108.287, slechts werd de kweekvloeistof geconcentreerd tot een activiteit, die overeenkomt met ongeveer een 1%’s oplossing van het zuivere enzym.

Dit materiaal werd verder gezuiverd en geconcentreerd door precipitate met 40 gew/vol% ammonium-50 sulfaat en wassen met leidingwater gedurende de vervolgens uitgevoerde ultrafiltratie. Het verkregen stremselconcentraat (lading PB 1031) bevatte ongeveer 4% actief enzym na toevoeging van 18 gew.% natriumchloride ter conservering.

De stabiliteitsproef met twee gehalten D,L-metNonine en een referentiemonster werd uitgevoerd bij 40°C en een Ph van 68.

Claims

5 192290 TABEL F % testactiviteit 5 Stremselconcentraat na 4 na 13 na 26 PRB1031 weken weken weken Referentie zonder methionine 88,1 72,1 59 Proef met 1% D,L-methionine 98,8 88,7 80 10 Proef met 2% D,L-methionine 98,9 92,1 84 15

1. Oplossing van microbiee! stremsel, met het kenmerk, dat de oplossing is gestabiliseerd door toevoeging van methionine in een hoeveelheid die overeenkomt met een concentratie tussen 0,1 gew.%, berekend op het totale gewicht van de oplossing, en de concentratie van een verzadigde oplossing.

2. Stremseloplossing volgens conclusies 1, met het kenmerk, dat het toegevoegde methionine L-methionine 20 is. Hierbij 1 blad tekening