NL8203631A

NL8203631A - Verbetering in en met betrekking tot een gestabiliseerde oplossing van stremsel.

Info

Publication number: NL8203631A
Application number: NL8203631A
Authority: NL
Original assignee: Novo Industri As
Priority date: 1981-09-21
Filing date: 1982-09-20
Publication date: 1983-04-18
Also published as: GB2106521A; NL192290B; BE894447A; FR2522681A1; DE3234761C2; DK147376B; DK147376C; FR2522681B1; DK416881A; US4455375A; NL192290C; DE3234761A1; GB2106521B

Description

Jr:' , , ' ' " * v \ 1 - --1- I.o 31 351

Yerbetering in en met betrekking tot een gestabiliseerde oplossing van stremsel.

He onderhavige uitvinding heeft betrekking op een gestabiliseerde oplossing van stremsel*

Toe te schrijven aan een gemakkelijkere dosering wordt stremsel meestal als een oplossing op de markt gebracht. Echter is een 5 stremseloplossing in het algemeen niet zo stabiel als een stremsel-poeder met betreking tot de stremselactiviteit, in het bijzonder bij hogere temperaturen. Stabilisatoren kunnen aan de stremseloplossing worden toegevoegd om de stabiliteit te verbeteren en een in de handel gebruikte stabilisator is sorbitol, die gewoonlijk wordt 10 toegevoegd in een hoeveelheid van ongeveer 50 gew./gew.% berekend op de oplossing.

Het grootste deel van een dergelijke aan de stremseloplossing toegevoegde stabilisator zal door de weifase worden opgenomen. Aan-gezien echter ook een klein deel opgenomen zal worden door de 15 wrongelfase zal de stabilisator in de uiteindelijk voortgehrachte kaas worden gevonden. In het geval van bijvoorbeeld sorbitol als vreemd materiaal, is dit zeer ongewenst en in feite. is sorbitol in sommige landen voor dit doel niet toegelaten. Yoorts is sorbitol een tamelijk duur produkt en tengevolge van het feit dat ongeveer 20 50% sorbitol dient te worden toegevoegd om een redelijke stabili-satie te verkrijgen is de prijs van de gestabiliseerde stremseloplossing aanzienlijk hoger dan die van de niet gestabiliseerde stremseloplossing·

Er bestaat derhalve behoefte aan een gestabiliseerde stremsel-25 oplossing, waarbij de stabilisator niet het karakter van een vreemde stof vertoont en waarbij de stabilisator niet zeer veel toevoegt aan de prijs van de stremseloplossing.

He uitvinding is gelegen in de verrassende vondst dat kleine hoeveelheden methionineeen sterk stabiliserend effect op de 30 enzymatische activiteit van het stremsel vertonen.

Yolgens de uitvinding wordt een gestabiliseerde stremseloplossing verschaft, waarbij de stabilisator methionine is toegevoegd in een hoeveelheid die overeenkomt met een concentratie tussen 0,1 gew/gew.% berekend cp bet to-fele gewicht van de oplossing en die 35 van een verzadigde oplossing.

8203631 . . ^ - 2 -

Bij een voorkeursuitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding wordt de methionine toegevoegd in een hoeveelheid, die overeenkomt met een concentratie tussen 0,2 gew/gew96 berekend op het totale gewicht van de oplossing en die van een verzadigde oplossing.

5 De stemselactiviteit in de stremseloplossing is ten minste 5-000 RU/ml en bij voorkeur ten minste 10.000 RTJ/ml.

De stremselactiviteit aangegeven in RU/ml (RU = stremseleen-heden) wordt gemeten volgens de Britse norm 3624:19^3 (Method for the determination of the milk coagulating power of rennet).

10 Een verzadigde stremseloplossing is met betrekking tot methionine gewoonlijk een 2-3 gew/gew% oplossing afhankelijk van de andere bestanddelen in de oplossing en de temperatuur. In het geval van bijvoorbeeld een gedestabiliseerd stremsel zoals later beschre-ven, zal een rest van de destabilisator reageren met methionine, 15 waarbij minder methionine ter beschikking zal zijn voor de doel-einden vo Igens de uitvinding en als gevolg zal meer methionine nodig zijn om een verzadigde oplossing te verkrijgen.

Echter wordt, zoals uit de volgende voorbeelden zal blijken, methionine in alle gevallen in zo geringe hoeveelheden gebruikt 20 in vergelijking met het in de handel gebruike sorbitol, dat een opmerkelijke vermindering van de kosten wordt verkregen.

Methionine wordt bij voorkeur toegevoegd in een hoeveelheid die overeenkomt met een concentratie tussen 0,1 en 2 en meer bij voorkeur tussen 0,5 en 1,5 gew/gew% berekend op het totale gewicht 25 van de oplossing.

Aangezien methionine een essentieel aminozuur is, dat reeds in kaas aanwezig is, wordt geen vreemde stof in de kaas ingevoerd door het gebruik van methionine als stabilisator. Yoorts wordt slechts een ondergeschikte hoeveelheid methionine toegevoegd in 30 vergelijking met de hoeveelheid die reeds in de kaas aanwezig is.

In het Amerikaanse octrooischrift 3*051«627 en in het Britse octrooischrift 866.423 is beschreven, dat methionine onder een groep van verschillende aminozuren, gebruikt kan worden als stabilisator voor oplossingen van chymotrypsine.-De onderhavige uitvinding is 35 echter specifiek tot methionine beperkt en eveneens is de uitvinding specifiek gericht op stremsel.

Yoorts blijkt uit tabel D bij de hiervoor vermelde octrooi-schriften, dat de onderzochte aminozuren, met inbegrip van D,I-methionine nagenoeg hetzelfde effect vertonen.

40 Derhalve is het een zeer verrassende erkenning, dat methionine, 8203631 v * * -3- indien ale ' stabilizator gebruikt in een stremseloplossing volgens de onderhavige uitvinding, gebleken is de enige effectieve stabi-lisator te zijn onder een grote-groep andere aminozuren.

Yolgens het Britse octrooischrift 900.115 kan D,L-methionine 5 gebruikt worden als stabilisator voor trypsineoplossingen. Echter wordt D,L-methionine slechts vermeld als een voorbeeld van be-schrijving, waarbij in het experimentele deel geen effect gedocu-menteerd wordt. Bovendien worden de aminozuren geacht gebruikt te worden in combinatie met een calciumzout, zie bladzijde 1, regels 10 55-59·

Een voorkeursuitvoeringsvorm van de gestabiliseerde stremseloplossing volgens de uitvinding is, dat methionine gebruikt wordt in de D,L-vorm ervan.

Een andere voorkeursuitvoeringsvorm van de gestabiliseerde 15 stremseloplossing volgens de uitvinding is, dat methionine gebruikt wordt in de L-vorm ervan.

Een verdere voorkeursuitvoeringsvorm van de gestabiliseerde stremseloplossing volgens de uitvinding is, dat het stremsel microbieel stremsel is.

20 Als microbiele stremsels kunnen de volgende vermeld worden:

Mucor miehei stremsel, Mucor pusillus stremsel en Endothia parasitica stremsel en een voorkeursuitvoeringsvorm van de gestabiliseerde stremseloplossing volgens de uitvinding is, dat het stsmsel is afgeleid van Mucor miehei.

25 Een andere voorkeursuitvoeringsvorm van de gestabiliseerde stremseloplossing volgens"de onderhavige uitvinding is, dat het stremsel afkomstig is van Mucor miehei en dat het Mucor miehei stremsel thermisch gedestabiliseerd is.

Een andere voorkeursuitvoeringsvorm van de gestabiliseerde 50 stremseloplossing volgens de uitvinding is, dat het stremsel afkom-stif is van Mucor miehei, dat het Mucor miehei stremsel thermisch gedestabiliseerd is en dat de gedestabiliseerde methode is uitge-voerd volgens het Amerikaanse octrooischrift 4-255*454 of de Belgische octrooischriften 882.689 of 882.690.

55 Wanneer een oxidatiemiddel gebruikt wordt als thermische de- stabilisator vormt het gebruikt van methionine volgens de onderhavige uitvinding een verder voordeel, aangezien methionine een reduc-tiemiddel is, dat mogelijke kleine resten van het oxidatiemiddel zal verminderen en daarbij ongewenste bestanddelen uit het produkt 40 zal verwijderen.

8203631 - 4 -

Methionine wordt gewoonlijk bij έέη van de uiteindelijke winningst.rappen bij de bereiding van het microhiele stremsel toe-gevoegd en wanneer het microhiele stremsel gedestahiliseerd is met een oxidatiemiddel, dient het methionine toegevoegd te worden 5 na het destabilisatieproces.

Set gehalte van aotief enzym in de stremseloplossingen wordt geregeld op 0,2-4, bij voorkeur 0,25-3 gew/gevP/o bijvoorbeeld door toevoeging van een natriumchlorideoplossing.

Onder verwijaing naar de tekening licht de figuur de rest-10 activiteit toe van een Mucor miehei stremsel (Rennilase 50 L type TL) bij 40°C na 2 en 4 weken. Set blijkt, dat het stabiliserende effect van L-methionine groter is dan dat van D,L-methionine, in het bijzonder bij lagere concentraties.

Be uitvinding zal nu meer gedetailleerd beschrev.en worden 15 onder verwijzing naar de volgende voorbeelden.

Yoorbeeld I

Set stremselpreparaat, dat voor dit experiment werd gebruikt, was een in de handel verkrijgbaar gedestahiliseerd Mucor miehei stremsel (Rennilase 50 L type TL) bereid volgens voorbeeld III 20 (dosering ongeveer 1,6 vol/vol$ 2,25 molair NaOCl) beschreven in het Belgische octrooischrift 882.689·

Dit preparaat wordt gestandariseerd met een 18 gew/gew% . natriumchlorideoplossing op een gehalte van ongeveer 1% actief enzym.

25 Twee ladingen van dit Rennilase 50 L type TL zijn beproefd op stabiliteit bij opslag bij een pS van 6,5» waarbij de experi-menten zijn uitgevoegd met een referentieproef zeonder stabilisa-tor en een monster met 1 gew/gev$ D,L-methionine. De proeven over de opslagstabiliteit zijn uitgevoerd als een "normale" stabili-50 teitsproef bij 20°C en als een versnelde proef bij 40°C, waarvan de resultaten uit de volgende tabel blijken- 8203631 V - 5 - .

label A

% restactiviteit

Incubatietemperatuur 25°C 40°c

Incubatietijd 4 weken I 18¼ weken 2 weken 5 referentie, zonder stabilisator 95,3 81,3 74,3 lading_______^____;_;___ PEN met 1% B,I-methio~ 102,0 97,9 89,5 10 4519 nine referentie, zonder 97,1 81,0 75,5 stabilisator lading ________ ...

PEN met 1% D,L-methio- 102,8 94,4 88,4 15 4520 nine

Hit de tabel Jblijkt, dat de toevoeging van 1 gew/gew% B,L-methionine een opmerkelijke verbetering van de opslagstabiliteit verschaft.

Yoorbeeld II

20 Ten einde het stabiliserende effect van methionine te verge- lijken met die van enkele aminozuren werd 1 gew/gew% van verschil-lende aminozuren toegevoegd aan een Eennilase 50 L type TL (lading PEN 4518 bereid zpals aangegeven in voorbeeld i). Een monster zonder enige toevoeging van aminozuur werd als referentie toegepast. Alle 25 monsters werden op,een pH van 6,5 ingesteld. Be monsters werden 2 weken bij 40°C bewaard en de restactiviteiten werden bepaald, zie tabel B.

8203631 - 6 - t

Tat)el B

Rennilase 50 L type TL % restactiviteit na

2 weken bij 40°C

Referentie zonder 5 toegevoegd aminozuur 69,8 met 1% B,L-methionine 88,1 met 1% L-asparagine 72,2 met \% L-histidine, Ξ01 74,5 met 1% L-arginine 74,1 10 met 1% L-lysine 72,0 met "]% L-Na-glutaminaat .71,7

Uit de tabel blijkt, dat slechts methionine een effectieve stabili^atie van het stremselpreparaat verschaft.

Voorbeeld III

15 Het stabiliserende effect van methionine werd bij dit experi ment vergeleken met dat van andere aminozuren. 2 gew/gew% van de aminozuren werd aan een Rennilase 50 L type TL toegevoegd (lading PRH 4516 bereid zoals aangegeven in voorbeeld i). Als referentie werd een monster gebruikt waaraan geen aminozuren waren toegevoegd.

20 Alle monsters werden op een pH van 6,..5 ingesteld en werden 2 weken bij 40°C bewaard. Be restactiviteiten blijken uit de volgende tabel.

8203631 i-; .-· -..... ' - j'1..·· e - ; . ·.. ....*** . - ......

-7-label C

Rennilase 50 L type TL % restactiviteit na

2 weken bij 40°C

Referentie zonder 5 toegevoegd aminozuur 74 met D,L-methionine 96 met 2% glycine 77 met 296 D,L-alanine 78

Yoorbeeld IT

10 Bij dit experiment werd het stabiliserende effect van I),L-methionine vergeleken met dat van L-methionine. Voorts werd het effect van een methioninederivaat, I),L-methioninesulf 0zide en een aandere aminozuur, L-cystelne, onderzicht. YariSrende verhoudingen van de verschillende aminozuren werd toegevoegd aan een Rennilase 15 50 L type TIi (gemengde ladingen van gelijke delen PEN 4526, PEN 4527 en PEN 4528). Een monster zonder enige toevoeging van aminozuren werd als regerentie gebruikt. Alle monsters werden op een pH van 6,5 ingesteld en gedurende 2 en 4 weken bij 40°C en gedurende 26 weken bij 25°C bewaard. De restactiviteiten blijken uit de volgende 20 tabel.

8203631 - 8 -

Tabel D

Rennilase 50 L type TL % restactiviteit

Incubatietemperatuur 25°C 40°C

Incubatietijd 26 weken 2 weken 4 weken 5 Ref. zonder toegevoegd aminozuur 63 66 53 met 0,25$ L,L-methionine 70 71 58 met 0,50% E,L-methionine 76 77 65 met 1,0$ E,L-methionine 84 83 74 10 met 2,0% E,L-methionine 90 90 85 met 0,25% L-methionine 78 84 70 met 0,50% L-methionine 83 88 75 met 1,0% L-methionine 89 92 81 met 2,0% L-methionine 96 94 81 15 met 1,0% D,L-methionine- sulfoxide 67 74 60 met 2,0% L-cysteine 60 67 57 I_LI_ l

Het blijkt uit de tabel dat L-methionine een betere stabili-satie van het stremselpreparaat verschaft dan het D,L-methionine.

20 L-cysteine heeft geen effect en E,L-methioninesulfoxide heeft slechts een onderschikt effect op de stabiliteit.

Yoorbeeld 7

Het stabiliserende effect van D,L-methionine is onderzocht in een 10 gew/gev^j oplossing van een in de handel verkrijgbaar 25 Mucor pusillus stremsel, Nourylab 1:220.000 (lading no- 75 I 1 - 22) met 18 gew/gew% natrinmchloride ter conservering toegevoegd. He pH van de monsters werd op 4»7 ingesteld en een referentiemonster en een monster met 1% L,L-methionine werden bij 40°C, 25°C en 4°C

8203631 p." . ·;. ' v.-.JH '-· ____________-:________ ...... ..

• *a- > geincobeerd en de reststollingsactiviteiten werden bepaald·

label E

10 gew/gew% Nourylab % restactiviteit —---j--—--

Incubatietemp. 40°C 25°0. '-· 4°C

5 Incubatietijd 2 2 ' 4 4 . 4 26 weken weken weken weken weken — ..... . - i - . .....- ................... ..t -

Referentie zonder toe- gevoegd aminozwxs 34 25 55 93 76 met 1% D,L-methionine 51 39 73 96 88 10 Het blijkt dat 33,L-methionine eveneens een opmerkelijke ver- betering verschaft van de opslagstabiliteit van Muoor pusillus stremsel.

7oorbeeld 71

Het uitgangsmateriaal voor dit experiment was een stremsel-15 cencentraat bereid zoals aangegeven in het "2nd Pilot Plant

Experiment" in het Britse octrooischrift 1.108.287» sleohts werd de kweekvloeistof geconcentread tot een activiteit, die overeen-komt met ongeveer een 1%'a oplossing van het zuivere enzym.

Lit materiaal werd verder gezuiverd en geconcentreerd door 20 precipitatie met 40 gew/vol% ammoninmsulfaat en wassen met leiding-water gedurende de vervolgens uitgevoerde ultrafiltratie. Het ver-kregen stremselconcentraat (lading PR33 1031) bevatte ongeveer 4% actief enzym na toevoeging van 18 gew/gew^ natriumchloride ter conservering.

25 De stabiliteitsproef met twee gehalten L,L-methionine en een referentiemonster werd uitgevoerd bij 40°G en een pH van 6,8.

8203631 - 10 - t

label F

% restactiviteit

Stremselcencentraat , na 4 na 13 na 26 PKB 1031 , , .

weken weken weken

Referentie zonder methionine 88,1 72,1 59

Proef met 1% D,L-methionine 98,8 88,7 80

Proef met 2% D,L-methionine 98,9 92,1 84 8203631

Claims

1. Gestabiliseerde simms el oplossing, met h e t k e n m e r k, dat de stabilisator methionine is, toegevoegd in een hoeveelheid die overeenkomt met een concentratie tussen 0,1 5 gev/gev% be±ekend . op het totale gewicht ran de oplossing en die van. een verzadigde oplossing·

2. Gestabiliseerde stremseloplossing volgens conclusie 1, m e t h e t kenmerk, dat methionine is toegevoegd in een boeveelheid, die overeenkomt met een concentratie tussen 10 0,2 gew/gew% berekend op het totale gewicht van de oplossing en die van een verzadigde oplossing·

3* Gestabiliseerde stremseloplossing volgens conclusie 1 of 2, met het k e n m e r k, dat methionine wordt toegevoegd in een hoeveelheid die overeenkomt met een concentratie tussen . 15 0,5 en 1,5 gew/gev% berekend op het totale gewicht van de oplossing.

4· .'Gestabiliseerde stremseloplossing volgens conclusies 1 tot 3* met h e t k e n m e r k, dat het toegevoegde methionine D,L-methionine is.

5* Gestabiliseerde stremseloplossing volgens conclusies 1 tot 20 3, met het kenmerk, dat het toegevoegde methionine L-methionine is.

6. Gestabiliseerde stremseloplossing volgens conclusies 1 tot 5, met het k e n m e r k, dat het stremsel een microbieel stremsel is. 25

· 7· Gestabiliseerde stremseloplossing volgens conclusie 6, m e t h et kenmerk, dat het microbiele stremsel af- komstig is van Mucor miehei·

8. Gestabiliseerde stremseloplossing volgens conclusie J, met het kenmerk, dat het microbiele Mucor miehei 30 stremsel thermisch gedestabiliseerd is.

9. Gestabiliseerde stremseloplossing volgens conclusie 8, met he t ke n m e r k, dat de thermische destabilisatie is uitgevoerd volgens de werkwijzen zoals beschreven in het imeri-kaanse octrooischrift 4*255*454 en de Belgische octrooischriften 35 882.689 en 882.690, 8203631