DK147376B

DK147376B - Stabiliseret oploesning af osteloebe

Info

Publication number: DK147376B
Application number: DK416881A
Authority: DK
Inventors: Palle Schneider; Sven Branner-Joergensen
Original assignee: Novo Industri As
Priority date: 1981-09-21
Filing date: 1981-09-21
Publication date: 1984-07-09
Also published as: DK147376C; NL8203631A; FR2522681B1; US4455375A; GB2106521B; NL192290B; DE3234761A1; BE894447A; GB2106521A; DK416881A; NL192290C; DE3234761C2; FR2522681A1

Description

i 147376 På grund af en lettere dosering markedsføres osteløbe som oftest som en opløsning. En osteløbeopløsning er imidlertid sædvanligvis ikke så stabil som et osteløbepulver hvad angår osteløbeaktivitet, især ved højere temperaturer.

5 Stabiliseringsmidler kan sættes til osteløbeopløsningen for at forbedre stabiliteten, og et kommercielt anvendt stabiliseringsmiddel er sorbitol, der sædvanligvis tilsættes i en mængde på ca. 50 vægt% baseret på vægten af opløsningen.

Størstedelen af sådanne stabiliseringsmidler, der 10 er sat til osteløbeopløsningen, vil optages af vallefasen.

Da imidlertid en lille del også vil optages af ostemassefasen, vil nævnte stabiliseringsmiddel findes i den færdigpro-ducerede ost. I tilfælde af f.eks. sorbitol, der er et fremmed materiale, er dette meget uønskeligt, og sorbitol er i 15 nogle lande ikke tilladt til dette formål. Sorbitol er desuden et temmelig kostbart materiale, og da ca. 50% sorbitol skal tilsættes for at opnå en rimelig stabilisering, er prisen på den stabiliserede osteløbeopløsning betydelig højere end prisen på den ustabiliserede osteløbeopløsning.

20 Der eksisterer således et behov for en stabilise ret opløsning af osteløbe, hvori stabiliseringsmidlet ikke har karakter af et fremmed stof, og hvor stabiliseringsmidlet ikke forøger prisen af osteløbeopløsningen særlig meget.

Opfindelsen er baseret på den overraskende erken-25 delse, at små mængder af methionin har vist sig at udøve en stærk stabiliserende effekt på enzymaktiviteten af en opløsning af mikrobiel osteløbe.

Opfindelsen angår således en stabiliseret opløsning af mikrobiel osteløbe, der er ejendommelig ved, at 30 stabiliseringsmidlet er methionin, der er tilsat i en mængde svarende til en koncentration mellem 0,1 vægt%, beregnet på den totale vægt af opløsningen, og hvad der svarer til en mættet opløsning.

En foretrukket udførelsesform for den stabilisere-35 de opløsning af mikrobiel osteløbe ifølge opfindelsen omfatter, at methionin er tilsat i en mængde svarende til en 2 147376 koncentration på over 0,2 vægt%, beregnet på den totale vægt af oplosningen.

Osteløbeaktiviteten angivet i RU/ml (RU = Rennet Unit) måles ifølge britisk standard 3624: 1964 (Method for 5 the determination of the milk coagulating power of rennet) og er i opløsningen af osteløbe mindst 5.000 RU/ml og fortrinsvis mindst 10.000 RU/ml.

En med hensyn til methionin mættet osteløbeopløs-ning indeholder normalt mellem 2 og 3 vægt% methionin, 10 beregnet på den totale vægt af opløsningen, afhængig af de andre konstituenter i opløsningen og temperaturen. I tilfælde af en destabiliseret osteløbe, som beskrevet senere, vil en remanens af destabiliseringsmidlet reagere med methionin, hvorved mindre methionin vil være til rådighed for formålet 15 med opfindelsen, og som en konsekvens heraf behøves der mere methionin for at opnå en mættet opløsning.

Som det imidlertid fremgår af de følgende eksempler anvendes methionin i alle tilfælde i så små mængder i sammenligning med den kommercielt anvendte sorbitol, at der 20 opnås en væsentlig reduktion i omkostningerne.

Da methionin desuden er en essentiel aminosyre, der allerede er indeholdt i ost, indføres der ikke nogen fremmede stoffer i osten ved anvendelse af methionin som stabiliseringsmiddel. Desuden tilsættes der kun en mindre 25 mængde methionin i sammenligning med, hvad der allerede findes i osten.

Det er i USA-patentskrift nr. 3.051.627 og britisk patentskrift nr. 866.423 beskrevet, at methionin blandt en gruppe af forskellige aminosyrer kan anvendes som stabilise-30 ringsmiddel for opløsninger af alpha-chymotrypsin. Det er desuden i britisk patentskrift nr. 900.115 nævnt, men ikke dokumenteret, at D,L-methionin kan udøve en stabiliserende virkning på trypsinopløsninger.

Det fremgår imidlertid af de førnævnte patent-35 skrifter, at de forskellige afprøvede aminosyrer har omtrent samme stabiliserende effekt. Det er derfor en yderst overraskende erkendelse, at methionin har vist sig at være den 147376 3 eneste aminosyre, der har en stabiliserende effekt på enzymaktiviteten af en opløsning af mikrobiel osteløbe.

En foretrukket udførelsesform for den stabiliserede opløsning af mikrobiel osteløbe ifølge opfindelsen omfat-5 ter, at methionin anvendes i sin D,L-form.

Ifølge en yderligere foretrukket udførelsesform for den stabiliserede opløsning af mikrobiel osteløbe ifølge opfindelsen anvendes methionin i sin L-form.

Som mikrobielle osteløber kan følgende nævnes: 10 Mucor miehei osteløbe, Mucor pusillus osteløbe og Endothia parasitica osteløbe, og en foretrukket udførelsesform for den stabiliserede opløsning af osteløbe ifølge opfindelsen omfatter, at osteløben er udvundet fra Mucor miehei.

En yderligere foretrukket udførelsesform for den 15 stabiliserede opløsning af osteløbe ifølge opfindelsen omfatter, at osteløben er udvundet fra Mucor miehei, og at Mucor miehei osteløben er termisk destabiliseret.

Den termiske destabilisering er ifølge opfindelsen fortrinsvis udført a) ved acylering af osteløben med et 20 mono-carboxylsyreacylradical med mellem 1 og 6 carbonatomer i et vandigt medium ved en pH-værdi mellem ca. 6 og ca. 11 og ved en temperatur mellem ca. 0 og ca. 40°C, eller b) ved modificering af osteløben ved behandling i et vandigt medium med et oxidationsmiddel indeholdende aktivt halogen med et 25 oxidationstal mellem 0 og 3 eller c) ved behandling af osteløben i et vandigt medium med en uorganisk peroxysyre eller en lavere aliphatisk peroxysyre og salte deraf, jfr. USA-patentskrift nr. 4.255.454 eller de belgiske patentskrifter 882.689 og 882.690.

30 Hvis der anvendes et oxidationsmiddel som termisk destabiliseringsmiddel, udgør anvendelsen af methionin ifølge den foreliggende opfindelse en yderligere fordel, idet methionin, der er et reduktionsmiddel, vil reducere eventuelle små rester af oxidationsmidlet og herved fjerne sådanne 35 uønskede konstituenter fra produktet.

Methionin tilsættes normalt ved et af de afsluttende oprensningstrin ved fremstillingen af den mikrobielle / 147376 4 osteløbe, og hvis den mikrobielle osteløbe er termisk desta-biliseret med et oxidationsmiddel, skal methioninen tilsættes efter den termiske destabiliseringsproces.

Opfindelsen skal illustreres nærmere under henvis-5 ning til tegningen, på hvilken figuren viser restaktiviteten af en Mucor miehei osteløbe (Rennilase 50 L type TL) ved 40°C efter 2 og 4 uger. Det fremgår, at stabiliseringseffekten af L-methionin er større end effekten af D,L-methionin, især ved lavere koncentrationer.

10 Opfindelsen skal herefter beskrives i yderligere detaljer ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

Eksempel 1

Osteløbepræparatet anvendt til dette forsøg var en kommerciel destabiliseret Mucor miehei osteløbe (Rennilase 15 50 L type TL, fremstillet ifølge eksempel 3 (dosis ca. 1,6% v/v 2,25 M NaOCl) beskrevet i belgisk patentskrift nr.

882.689.

Dette præparat blev standardiseret med 18% w/w natriumchloridopløsning til et indhold af ca. 1% aktivt 20 enzym.

To portioner af denne Rennilase 50 L type TL blev undersøgt for henstandsstabilitet ved pH 6,5, idet forsøgene blev udført med en reference uden noget stabiliseringsmiddel og en prøve med 1% w/w D,L-methionin. Henstandsstabilitets-25 forsøgene blev udført som et "normalt" stabilitetsforsøg ved 25°C og som et accelereret forsøg ved 40°C, og resultaterne fremgår af den efterfølgende tabel.

Tabel I

147376 5 ” % restaktivitet "

5 Inkubationstemperatur 25°C 40°C

Inkubationstid 4 uger 18¾ uger 2 uger

Reference uden 10 Batch stabilisator 95,3 81,3 74,3 PRN ______ 4519 Med 1% D,L-me- thionin 102,0 97,9 89,5 15 Reference uden

Batch stabilisator 97,1 81,0 75,5

PRN

4520 Med 1% D,L-me- thionin 102,8 94,4 88,4 20 _________

Det fremgår af det ovenstående, at en tilsætning af 1% w/w D,L-methionin tilvejebringer en bemærkelsesværdig forbedring af henstandsstabiliteten.

Eksempel 2 25 For at sammenligne den stabiliserende virkning af methionin med virkningen af nogle andre aminosyrer er der blevet udført et andet forsøg, hvor der er blevet tilsat 1% w/w af forskellige aminosyrer til en rennilase 50 L type TL (batch PRN 4518 fremstillet som beskrevet i eksempel 1). En 30 prøve uden tilsætning af aminosyrer blev anvendt som reference. Alle prøverne blev indstillet til pH 6,5. Prøverne blev opbevaret ved 40°C i 2 uger, og restaktiviteterne blev bestemt. Restaktiviteterne fremgår af følgende tabel.

6

Tabel II

147376

Rennilase 50 L type TL %restaktivitet efter

2 uger ved 40°C

5___

Reference uden tilsat aminosyre 69,8

Med 1% D,L-methionin 08,1 10 _

Med 1% L-asparagin 72,2

Med 1% L-histidin, HC1 74,5 15 Med 1% L-arginin 74,1

Med 1% L-lysin 72,0

Med 1% L-Na-glutaminat 71,7 20 _

Det fremgår af de ovennævnte resultater, at kun methionin giver en effektiv stabilisering af osteløbepræpa-ratet.

Eksempel 3 25 Den stabiliserende virkning af methionin blev i dette forsøg sammenlignet med virkningen af yderligere aminosyrer. 2% w/w af aminosyrerne blev sat til rennilase 50 L type TL (batch PRN 4516 fremstillet som beskrevet i eksempel 1). Som reference blev der anvendt en prøve uden tilsætning 30 af aminosyrer. Alle prøverne blev indstillet til pH 6,5 og opbevaret ved 40°C i 2 uger. Restaktiviteterne fremgår af den følgende tabel:

Tabel III

35 Rennilase 50 L type TL % restaktivitet efter

2 uger ved 40°C

Reference uden tilsat aminosyre 74 40 _

Med 2% D,L-methionin 96

Med 2% glycin 77 45 Med 2% D,L-alanin 78

Eksempel 4 7 147376 I dette forsøg blev den stabiliserende virkning af D,L-methionin sammenlignet med virkningen af L-methionin. Yderligere blev effekten af et methioninderivat, D,L-methio-5 ninsulfoxid, og en anden aminosyre L-cystein, undersøgt. 1% w/w af de forskellige aminosyrer blev sat til en Rennilase 50 L type TL (blandede batcher af lige dele PRN 4526, PRN 4527 og PRN 4528). En prøve uden tilsætning af aminosyrer blev anvendt som reference. Alle prøver blev indstillet til 10 pH 6,5 og opbevaret ved 40°C i 2 og 4 uger. Restaktiviterne fremgår af den efterfølgende tabel:

Tabel IV

Rennilase 50 L type TL % restaktivitet efter

15 2 og 4 uger ved 40°C

Flager 4 uger

Reference uden tilsat 20 aminosyre 66 53

Med 0,25% D,L-methionin 71 58

Med 0,50% D,L-methionin 77 65

Med 1,0% D,L-methionin 83 74

Med 2,0% D,L-methionin 90 85 25 Med 0,25% L-methionin 84 70

Med 0,50% L-methionin 88 75

Med 1,0% L-methionin 92 81

Med 2,0% L-methionin 94 81

Med 1,0% D,L-methionin- 30 sulfoxid 74 60

Med 2,0% L-cystein 67 57

Det fremgår af de ovenstående tal, at L-methionin giver en bedre stabilisering af osteløbepræparatet end D,L-35 methionin. L-cystein har ingen effekt, og D,L-methioninsul-foxid har kun en lille effekt på stabiliteten.

Eksempel 5

Den stabiliserende effekt af D,L-methionin blev undersøgt i en 10% w/w opløsning af en kommerciel Mucor 40 pusillus osteløbe, Nourylab 1:220.000 (Charge nr. 75 I 1 -22) med 18% w/w natriumchlorid tilsat til præservering. pH-værdien af prøverne blev indstillet til 4,7, og en referen- 8 147376 ceprøve og en prøve med 1% D,L-methionin blev inkuberet ved 40°C i 2 og 4 uger og ved 4°C og 25°C i 2 uger, og resterende koaguleringsaktiviteter blev bestemt.

Tabel V

5 ____ 10% w/w Nourylab % restaktivitet

40°C 25°C 4°C

2 uger 4 uger 4 uger 4 uger 10 Reference uden tilsat aminosyre 34 25 55 93

Med 1% D,L-methionin 51 39 73 96

Det fremgår, at D,L-methionin også giver en bemær-15 kelsesværdig forbedring af henstandsstabiliteten af Mucor pusillus osteløbe.

Eksempel 6

Udgangsmaterialet til dette forsøg var et Mucor miehei ostelø- bekoncentrat fremstillet som angivet i "2. Pilot Plant Expe-20 riment" i britisk patentskrift nr. 1.108.287, idet dog kulturvæsken blev koncentreret til en aktivitet svarende til ca. 1% opløsning af det rene enzym.

Dette materiale blev yderligere renset og koncentreret ved fældning med 40% w/vol ammoniumsulfat og vasket 25 med ledningsvand under en efterfølgende ultrafiltrering. Det fremkomne osteløbekoncentrat (batch PRB 1031) indeholdt ca.

4% aktivt enzym efter tilsætning af 18% w/w natriumchlorid til præservering.

Der blev udført et stabilitetsforsøg med to mæng-30 der af D,L-methionin og en referenceprøve ved 40°C og pH 6,8.

Tabel VI

Osteløbekoncentrat % restaktivitet 35 PRB 1031 efter 4 uger efter 13 uger

Reference uden methionin 88,1 72,1

Forsøg med 1% D,L-methionin 98,8 88,7

Forsøg med 2% D,L-methionin 98,9 92,1 40 __

Claims

9 147376

1. Stabiliseret opløsning af mikrobiel osteløbe, kendetegnet ved, at stabiliseringsmidlet er methionin, der er tilsat i en mængde svarende til en koncen- 5 tration på mellem 0,1 vægt%, beregnet på den totale vægt af opløsningen, og hvad der svarer til en mættet opløsning.

2. Stabiliseret opløsning af mikrobiel osteløbe ifølge krav 1, kendetegnet ved, at methionin tilsættes i en mængde svarende til en koncentration på over 10 0,2 vægt%, beregnet på vægten af den totale opløsning.

3. Stabiliseret opløsning af mikrobiel osteløbe ifølge krav 1 og 2, kendetegnet ved, at methioni-nen er D,L-methionin.

4. Stabiliseret opløsning af mikrobiel osteløbe 15 ifølge krav 1 og 2, kendetegnet ved, at methioni-nen er L-methionin.

5. Stabiliseret opløsning af mikrobiel osteløbe ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den er udvundet fra Mucor miehei.

6. Stabiliseret opløsning af mikrobiel osteløbe ifølge krav 5, kendetegnet ved, at den mikrobielle Mucor miehei osteløbe er termisk destabiliseret.

7. Stabiliseret opløsning af mikrobiel osteløbe ifølge krav 6, kendetegnet ved, at den termiske 25 destabilisering er udført a) ved acylering af osteløben med et mono-carboxylsyreacylradical med mellem 1 og 6 carbonato-mer i et vandigt medium ved en pH-værdi mellem ca. 6 og ca. 11 og ved en temperatur mellem ca. 0 og ca. 40 °C, eller b) ved modificering af osteløben ved behandling i et vandigt 30 medium med et oxidationsmiddel indeholdende aktivt halogen med et oxidationstal mellem 0 og 3 eller c) ved behandling