DK153230B - Fremgangsmaade til termisk destabilisering af mikrobiel osteloebe - Google Patents

Description

DK 153230 B

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af mikrobiel osteløbe med formindsket termostabilitet. Osteløbe er en betegnelse for et mælkekoagulerende enzymprodukt.

5 Ved fremstilling af ost koaguleres mælken ]hvorefter oste- massen separeres fra vallen. Produkter,’ der indeholder rennin, som er et velkendt koagulerende enzym, der er isoleret fra kalvemaver, har i lang tid været anvendt til dette formål. Hidtil har behovet for osteløbe kunner tilfredsstilles Lo med kalve-osteløbe, men i de senere år har man udviklet adskillige erstatninger for kalve-osteløbe, herunder især de mikrobielle oste-løber fra Mucor miehei og Mucor pusillus. Osteløbe fra Mucor miehei foretrækkes ved ostefabrikationen på grund af dens lave pris, dens lave uspecifikke proteolytiske aktivitet og dens store lighed med L5 rennin hvad angår calciumionfølsomhed. En anden af egenskaberne af Mucor miehei osteløbe er dennes høje termiske stabilitet, der sædvanligvis betragtes som en fordel på grund af den tilsvarende gode lagerholdbarhed.

Pasteuriseret valle kan blandt andet anvendes som additiv >0 til sødmælk, f.eks. i form af vallepulver, til fremstilling af beriget mælk, f.eks. som næringsmiddel til spædbørn. Den valle, der fremkommer som biprodukt fra ostefremstillingen under anvendelse af Mucor miehei osteløbe, kan efter pasteuriseringen stadigvæk indeholde en mindre andel af osteløbeaktivitet, hidrørende fra den høje 25 termiske stabilitet af Mucor miehei osteløbe. Enhver residual osteløbeaktivitet i vallepulveret er uønsket, fordi proteinkoagulation ikke længere er ønsket. En sådan kunne finde sted, hvis vallepulveret

DK 153230B

- 2 - anvendes til fremstilling af beriget mælk som næringsmiddel til spædbørn. Den berigede mælk kan koagulere,før den når spædbarnets mave,f.eks. i sutteflasken, hvorved der frembringes en forstoppelse, som forhindrer, at mælken kan komme ud af flasken.

5 Det beskrives i Biochim. Biophys. Acta 271 (1972) 93 - 101 (W.S. Rickert, Structural and functional determinants of Mucor miehei protease, I. Modification of the NH2 terminus and lysine residues by carbamylation), at Mucor miehei protease (den aktive komponent af Mucor miehei osteløbe) kan carbamyleres med kaliumcyanat, og at eet .0 carbamylerede produkt udviser en mindre grad af termisk destabiliserir.r. Praktiske forsøg har vist, at den termiske destabilisering af det carba-mylerede enzym er for lille til at løse det ovenfor angivne problem omfattende osteløbeaktivitet i pasteuriseret valle. En anden metode beskrives i belgisk patentansøgning nr. 6/47048, der .5 er indleveret d. 24. december 1979, og som foreslår, at man acylerer enzymet med henblik på destabilisering.

En metode, der har relation til den foreliggende opfindelse, omfatter, at man behandler den mikrobielle osteløbe med hydrogen-peroxid, enten som sådan eller dannet in situ. Denne metode er !0 beskrevet i engelsk patentansøgning nr. 2 024 828 A, publiceret d.

16. januar 1980.

Det er opfindelsens formål at tilvejebringe en i økonomisk henseende hensigtsmæssig fremgangsmåde til fremstilling af mikrobiel osteløbe med en termostabilitet, der er formindsket i 25 en sådan udstrækning, at de ulemper, der hidrører fra den residuale, mikrobielle osteløbeaktivitet i pasteuriseret valle, i det væsentlige elimineres.

Ifølge opfindelsen har det vist sig, at man ved at anvende en særligt udvalgt kategori af peroxyforbindelser, der udviser en 30 kemisk karakter, der afviger fra den kemiske karakter af de peroxyforbindelser, man har foreslået i den tidligere anførte engelske patentansøgning, opnår mulighed for at udføre den termiske destabiliserin med en molær mængde af peroxyforbindelse i forhold til den totale mængde af tilstedeværende protein, der er betydeligt lavere end den «

DK 153230B

tilsvarende mængde af det·hydrogenperoxyd, -der anvendes i den tidliger anførte engelske patentansøngning.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 1 angivne. Herved opfyldes opfindel-5 sens formål.

I den foreliggende beskrivelse med krav betyder udtrykket "lavere alifatisk peroxysyre" et peroxysyrederivat af en alifatisk carboxylsyre med en ligekædet eller forgrenet alkylgryppe, der ikke indeholder mere end 6, og fortrinsvis ikke mere end 4 carbonatomer.

10 Som eksempler på lavere, alifatiske peroxysyrer kan anføres følgende: peroxymyresyre, peroxyeddikesyre, peroxypropionsyre og peroxysmørsyre.

Som eksempler på salte af uorganiske peroxysyrer kan følgende anføres: kaliumperoxysulfat og natriumperoxyphosphat.

15 Mens behandlingen i den tidligere anførte engelske patentansøgning gennemføres ved hjælp af enten som s^dan eller dannet in situ, antages det, at mekanismen af den reaktion, som gennemføres i henhold til opfindelsen, ikke involverer H2°2* Det antages også, at denne forskel er årsagen til, at det ifølge 20 opfindelsen er muligt at opnå en tilfredsstillende termisk destabi-lisering under anvendelse af en molær mængde af peroxyforbindelsen i forhold til den totale, tilstedeværende mængde af protein, som kun er en brøkdel, nemlig af størrelsesordenen omkring 1/10, af den tilsvarende molære mængde #2^2' ^er anven<^es 1 den tidligere 25 anførte engelské patentansøgning.

Den drastiske reduktion af den mængde af reagens, der anvendes, medfører mindst to fordele. For det første undgår man den ellers nødvendige inaktivering af overskydende reagens. På grund af, at den mikrobielle osteløbe anvendes i forbindelse med varer til 30 human konsumption, bør kontaminering dermed hidrørende fra udefra kommende reagenser for det andet holdes på det lavest mulige niveau.

*

DK 153230B

- 4 -

Det har vist sig, at den mikrobielle osteløbe, der er modificeret i henhold til opfindelsen, er destabiliseret i betydligt omfang, og at destabiliseringsgraden er tilstrækkelig til at opfylde kravene i forbindelse med valleudnyttelsen uden at have en særlig 5 skadelig virkning på lagerstabiliteten af osteløbepræparatet. Det har overraskende vist sig, at det i henhold til opfindelsen er muligt at opnå en destabilisering (i henhold til den senere anførte definition) på mindst 8°C, fortrinsvis 10 - 13°C, der i det foretrukne interval får det modificerede enzyms termostabilitet til at svare til termostabiliteten af kalvemaveosteløben, hvorved de favorable egenskaber af kalvemaveosteløben kombineres med de faborable-egenskaber af den mikrobielle osteløbe.

Osteløbeaktiviteten måles i henhold til engelsk standard 2624: 1963 (Method for the determination of milk coagulating power of rennet).

Da opfindelsen angår en kontrolleret termisk destabilisering af mikrobiel osteløbe, er den metode, ved hvis hjælp man måler termisk stabilitet og kvantificerer reduktionen af den termiske stabilitet, altså destabiliseringen, angivet i det følgende, idet denne 20 destabilisering er udtrykt i °C.

Under ideelle betingelser kan et enzym denatureres ved et passende (højt) temperaturniveau på en sådan måde, at den residuale aktivitet af enzymet aftager som funktion af tiden langs en exponen-tiel henfaldskurve, d.v.s. med veldefineret halveringstid, idet 25 Tjy2 kan beregnes i henhold til formlen (t2-t·^ ln2

Th = lnA^ - lnA2

-s- DK 153230 B

hvor A^ er enzymaktiviteten målt efter opvarmning til en specificeret temperatur i tiden t^, og A2 er enzymaktiviteten målt efter opvarmning til den sanme specificerede temperatur i tiden t2· Halveringstiden vil være kortere, jo højere temperaturen er, ceteris 5 paribus . For mange enzymer vil en ændring af pH i enzymopløsningen og ionstyrken og tilstedeværelsen af visse salte påvirke halveringstiden i væsentligt omfang. Yderligere kan kemisk derive-rir.g af enzymet ændre halveringstiden i betydeligt omfang. Hvis en kemisk derivering af et bestemt enzym frembringer termisk destabili-LO sering af enzymet, siges destabiliseringen at være n°C,hvis det oprindelige (ikke deriverede) enzym og det deriverede enzym har den samme halveringstid ved henholdsvis N°C og (N-n)°C.

Det bør imidlertid bemærkes, at destabiliseringsværdierne i et vist omfang er approximative på grund af den approximative karafc 15 ter af halveringstiden. I en vis udstrækning er destabiliseringsværdierne pH-afhængige. Alle destabiliseringsværdierne i denne beskrivelse er målt ved pH 6,0.

Normalt ledsages behandlingen ifølge opfindelsen af en aktivitetsforøgelse; i visse tilfælde ledsages behandlingen ifølge 20 opfindelsen imidlertid af et aktivitetstab, og det har vist sig, at destabiliseringen af Økonomiske årsager ikke bør drives længere end til et aktivitetstab på ca. 50%, fortrinsvis ca. 30%, især under 10%.

I et typisk tilfælde synes en destabilisering på ca. 10 eller 11°C med et aktivitetstab, der er begrænset til under 10%, 25 at være et passende kompromis imellem de ovenfor angivne, modstridende faktorer.

Peroxysyren bør anvendes i en sådan koncentration, at den ønskede destabiliseringsgrad opnås i løbet af et rimeligt tidsrum, hvilket kan være fra nogle få minutter op til 48 timer, eller endog 30 en uge. Forholdet mellem peroxysyre og totalprotein i enzymproduktet er af vigtighed for resultaterne. I tilfælde af, at koncentra-

’6' DK 153230B

tionen af peroxysyren er for lille, vil destabiliseringen være for lille, og i tilfælde af, at koncentrationen af peroxysyre er for høj# vil aktivitetstabet blive for stort. De optimale koncentrationer svarer sædvanligvis til et molært forhold mellem midlet 5 og den totale proteinmængde i enzympræparatet på ca. 0,1 - 25 mmol peroxysyre pr. gram totalt protein. Hvis det mikrobielle osteløbepræparat renses til et højt aktivitetsniveau, kan mængden af peroxysyre reduceres til så lidt som 0,05 mmol peroxysyre pr. gram totalt protein.

10 Reaktionstemperaturen er ikke kritisk, når reaktions temperaturen holdes på et niveau, f.eks. under ca. 30°C, hvor enzymets stabilitet er tilfredsstillende. Imidlertid bør enzymets stabilitet forbedres ved tilstedeværelse af kendte proteinstabiliserende midler, f.eks. NaCl, i en mængde på 5 - 20% af enzym-15 præparatet, eller sorbitol i de sædvanlige enzymstabiliserende mængder. Det foretrukne reaktionstemperaturinterval er 0 - 30°C.

Destabiliseringsniveauet på mindst 8°C, fortrinsvis 10°C - 13°C, og det ledsagende aktivitetstab, der ikke må overstige 30%, fortrinsvis ikke 10%, betragtes som begrænsninger i 20 forbindelse med opfindelsens udøvelse.

En foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen omfatter, at man behandler den mikrobielle osteløbe med peroxyeddikesyre eller peroxypropionsyre.

En anden foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden 25 ifølge opfindelsen omfatter, at man behandler den mikrobielle osteløbe med monopersulfonsyre.

Ved en anden foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er den mikrobielle osteløbe Mucor miehei osteløbe.

7' DK 15 3250 Β

Ved en anden foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden Ifølge opfindelsen gemmenføres behandlingen med et molært forhold i reaktionsblandingen mellem peroxysyre og den totale proteinmængde i enzympræparatet på mellem 0,1 og 25 mmol 5 peroxysyre/g protein, fortrinsvis mellem 0,5 og 5 mmol peroxysyre/g protein.

Ved en anden foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen har det vandige medium en pH-værdi på mellem 2 og 9.

10 Ved en anden foretrukken udførelsesform for fremgangs måden ifølge opfindelsen har det vandige medium en temperatur på mellem 0 og 30°C.

I praksis har det vist sig, at man til fremstilling af lagrede oste foretrækker anvendelsen af termisk destabiliseret 15 osteløbe.

Destabiliseringsprocessen kan gennemføres, og bliver fortrinsvis gennemført som det sluttelige trin ved fremstillingen af den mikrobielle osteløbe. Faktisk kan (kommerciel) ren osteløbe eller osteløbekoncentrat anvendes ved udøvelsen af opfindelsen.

20 F.eks. kan således pH af en stabiliseret opløsning af mikrobiel osteløbe, der iøvrigt er parat til de sædvanlige efterbehandlings-operationer før leveringen, indstilles på det forud bestemte behandlingsniveau (f.eks. pH 5) og derpå under omrøring og ved omgivelsernes temperatur blandes med en opløsning af peroxysyren, — 8 —

DK 153230B

hvorved mængden af peroxysyre ligger i det før angivne interval for det molære forhold i forhold til den totale mængde protein i opløsningen af den mikrobielle osteløbe. Man lader derpå blandingen reagere, indtil det ønskede destabiliseringsniveau er nået, f.eks.

5 i 4 timer. Det termisk destabiliserede enzymprodukt kan udsættes for de sædvanlige efterbehandlingsoperationer, f.eks. filtrering, pH-indstilling og indstilling af enzymaktiviteten på en standardiseret værdi, o.s.v.

Opfindelsen skal nu beskrives mere detaljeret under hen-10 visning til de følgende eksempler.

Udgangsmaterialet i de følgende eksempler er et osteløbe-koncentrat fremstillet som angivet i "2. Pilot plant experiment" i engelsk patent 1.108.287, med undtagelse af, at kulturvæsken var koncentreret til en aktivitet, der omtrentlig svarer til en 1% 15 opløsning af det rene enzym (Comptes Rendus des Travaus du Labora-toire Carlsberg, Vol. 37, 1970, No. 14, 301 - 325) . For kortheds skyld vil dette koncentrat i det følgende blive benævnt "Rennilase 46". Aktiviteten af koncentratet er ca. 50.000 osteløbeenheder pr. ml (eller 50.000 S/ml).

20 Eksempel 1.

5 ml Rennilase 46 fortyndes til 15 ml under tilsætning af NaCl til en koncentration af 12% i blandingen. Derpå tilsættes der 50 pi 37% peroxyeddikesyre (indeholdende 3,8 % H202), hvorved samtidigt pH-værdien indstilles på 2,5 med 4 N HC1. Efter en reaktions-25 tid på 1 time ved 25°C neutraliseres blandingen til pH 7,0 med 4 N NaOH. Aktivitetsudbyttet er ca. 20%, og halveringstiden ved 55°C under de før nævnte betingelser er under 5 minutter, svarende til en destabilisering på mindst 13°C.

Eksempel 2.

30 150 ml Rennilase 46 blev fortyndet med 150 ml vand og delt i tre 100 ml-portioner, hvis pH-værdier blev indstillet på henholdsvis 3, 5 og 7. Ved omgivelsernes temperatur og under kraftig omrøring blev der tilsat 300 jil af en kommerciel 25% peroxyeddikesyre (1 mmol) til hver af de tre portioner, og pH blev samtidigt genindstille

DK 153230B

- 9 - ved tilsætinig af 4 N NaOH. Prøverne blev opbevaret natten over ved 4°C,før de blev analyseret. Forsøget blev gentaget, men denne gang blev peroxyeddikesyre-doserlngen reduceret til 0,5 mol ved tilsætning af 750 jzl af en 5% peroxyeddikesyre. Resultaterne frem-5 går af den følgende tabel.

pH Dosis, Aktivitets- Halverings- Destabilise- mmol udbytte tid ved ring

peroxy % 55°C, pH 6,0, °C

eddike- minutter 10 syre 3 0,5 105 4,9 13 5 0,5 106 5,6 13 7 0,5 84 7,4 12 3 1 86 3,0 14 15 5 1 103 3,0 14 7 1 84 3,7 14

Eksempel 3.

150 ml Rennilase 46 blev fortyndet med 150 ml vand og inddelt i tre 100 ml portioner, hvis pH-værdier blev indstillet på 20 henholdsvis 3, 5 og 7. Ved omgivelsernes temperatur og under omrøring tilsattes 1 ml 1 M kaliummonopersulfat til hver af de tre portioner, og pH blev genindstillet. Prøverne blev opbevaret natten over ved 4°C, før de blev analyseret.

Forsøget blev gentaget, men denne gang blev der tilsat 25 2 ml af den 1 M kaliummonopersulfatopløsning til hver portion. Resultaterne fremgår af den følgende tabel.

- 10 - DK 153230 Bj ·>* pH Dosis Aktivitets- Halverings- Destabilisering ininol udbytte % tid ved 55°C, oc KHSO- pH 6,0, minut- 5 ter 3 1 105 53 8 5 5 1 112 58 8 7 1 103 41 8 i i 3 2 102 32 9 i 5 2 106 30 9 7 2 97 16 10 j i 10 Eksempel 4. . !

Seks portioner af 50 ml Rennilase 46 blev fortyndet med 50 ml vand, og pH-værdien blev indstillet på 5. Under kraftig om- ; røring tilsatte man henholdsvis 75,· 150, 300, 450, 600 og 750 jil j af en 5% pereddikesyre (med 0,6% til de ovenfor angivne j 15 seks portioner, og samtidigt blev pH-værdien genindstillet til 5 j med 4 N NaOH. Efter 1 time ved stuetemperatur udtog man 1 ml prøver j til analyse.

Resultaterne fremgår af den følgende tabel.

Dosis af Udbytte % Halverings- Destabili-20 pereddike- tid ved 55°C, sering °C

syre mmol pH 6,0, minut ter 0,05 104 1045 1 0,1 106 313 4 25 0,2 105 45 8 0,3 106 14 11 0,4 102 8 12 0,5 102 6 13 * DK 153230 B v - 11 -

Eksempel 5,

Tre portioner af 50 ml Rennilase 46 blev fortyndet med 50 ml vand, og pH-værdien blev indstillet på 5. Til én portion tilsattes 0,55 ml, og til den anden portion tilsattes 1,10 ml af en ca. 0,46 M permyresyre (0,1 M H202) under kraftig omrøring og samtidig genindstilling af pH til 5 med 4 N NaOH. Til den tredie portion tilsattes 2,2 ml af en ca. 0,45 M permyresyre, der var blevet neutraliseret med kold 4 N NaOH.

Efter 2½ times forløb ved stuetemperatur udtog man 1 ml prøver til analyse.

Resultaterne fremgår af følgende tabel i

Dosis af Udbytte % Halverings- Destabili- myresyre, tid ved 55°C, sering mmol pH 6,0, minut- or ter 0,25 (sur) 86 8,8 12 0,5 (sur) 70 3,4 14 1,0 (neutral) 97 6 13

Eksempel 6.

Tc> portioner af 50 ml Rennilase 46 blev fortyndet med 50 ml vand, og pH-værdien blev indstillet på 5. Til én portion tilsattes 5 ml af ca. 0,2 M perpropionsyre (0,1 M H202) med samtidig pH-indstilling med 4 N NaOH. Til den anden portion tilsattes 5 ml af den ca. 0,2 ml M perpropionsyre, der var blevet neutraliseret i forvejen.

Forsøget blev gentaget, men denne gang anvendtes som reagens 5 ml portioner af en ca. 0,2 M persmørsyre (0,1 M H202).

' 12 " DK 153230B

Efter 2 timer ved stuetemperatur udtog man 1 ml prøver til analyse.

Resultaterne fremgår af den følgende tabel.

Dosis mmol Udbytte % T, ved 55°Cr Destabili- 5 Reagens ca* pH 6,0f minut- serin9' c ter

Perpropion- syre 1 88 < 3 >14 10 Perpropion-syre neutral 1 106 <3 >14

Persmørsyre 1 82 < 3 >14 15 Persmørsyre neutral 1 102 <3 >14

Claims (7)

13' DK 153230B

1. Fremgangsmåde til reduktion af den termiske stabilitet af mikrobiel osteløbe ved kemisk modifikation deraf, kendetegnet, ved, at man behandler den mikrobielle 5 osteløbe i et vandigt medium med en peroxysyre, der er en uorganisk peroxysyre, en lavere alifatisk peroxysyre, eller salte deraf.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at peroxysyren er peroxyeddikesyre eller peroxypropionsyre.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet LO ved, at peroxysyren er monopersulfonsyre.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1-3, kendetegnet ved, at den mikrobielle osteløbe er Mucor miehei osteløbe.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1-4, kendetegnet ved, at behandlingen gennemføres med et molært forhold i reak- L5 tionsblandingen mellem peroxysyre og den totale mængde protein i enzympræparatet på mellem 0,1 og 25 mmol peroxysyre/g protein, fortrinsvis mellem 0,5 og 5 mmol peroxysyre/g protein.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1-5, kendetegnet ved, at det vandige medium har en pH-værdi på mellem 2 og 9. !0

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1-6, kendetegnet ved, at det vandige medium har en temperatur på mellem 0 og 30°C.