DE2361169B2 - Verfahren zur aktivierung von von detengensspuren befreiter cholesterinoxydase - Google Patents

Description

Aus der DT-AS 22 24 132 ist ein Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin bekannt, bei dem Cholesterin in wäßrigem Medium mit Cholesterinoxydase inkubiert und entweder der Sauerstoffverbrauch oder gebildetes H2O bzw. Cholestenon bestimmt wird. Hieraus ist auch ein Reagens zur Bestimmung von Cholesterin bekannt, welches aus Cholesterinoxydase und einem System zur Bestimmung von H2O oder einem System zur Bestimmung von Cholestenon besteht. Es wurde nun gefunden, daß Cholesterinoxydase bei der Lagerung eine ungenügende Stabilität aufweist und verhältnismäßig rasch inaktiviert wird. Bei Untersuchung dieser Instabilität wurde festgestellt, daß diese Inaktivierung durch geringe Mengen an Detergens hervorgerufen wird, die von der Gewinnung des Enzyms her noch in demselben als Begleitsubstanz vorhanden sind. Diese Gewinnung erfolgt beispielsweise nach dem in der DT-OS 22 24 131 beschriebenen Verfahren dadurch, daß ein Cholesterin umsetzender Mikroorganismus durch Zerstörung der Zellwand mit einer ein nichtionogenes oberflächenaktives Mittel enthaltenden Pufferlösung aufgeschlossen und extrahiert, der Extrakt nach dessen Zentrifugierungen und der Verwerfung des hierbei erhaltenen Niederschlags über einen Anionenaustauscher gegeben, das Enzym mit einer das nichtionogene oberflächenaktive Mittel enthaltende Pufferlösung eluiert und aus dem Eluat isoliert wird. Wie weiter gefunden wurde, kann bei Entfernung dieser restlichen Detergensspuren eine völlig ausreichende Lagerungsstabilität des Enzyms erzielt werden. Es stellte sich jedoch heraus, daß das von Detergensspuren gereinigte Enzym eine merklich herabgesetzte Aktivität aufweist. Wird beispielsweise das Enzym für die Choleterinbestimmung verwendet, so hat dies zur Folge, daß entweder ein zeimlich frisch hergestelltes Präparat verwendet werden muß, oder aber erheblich größere Enzymmengen im Test eingesetzt oder die Meßdauer wesentlich verlängert werden muß.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Aktivierung von Cholesterinoxydase zu schaffen, weiches es einerseits ermöglicht, von Detergensspuren völlig freie und daher ausreichend lagerstabile Cholesterinoxydase zu verwenden, andererseits aber eine Aktivität des Enzyms bei seiner Anwendung zu erzielen, die derjenigen des frisch hergestellten, noch keiner Abtrennung von geringen Detergensmengen

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unterworfenen Enzyms entspricht.

Erfindungsgemäß gelingt dies durch ein Verfahren zur Aktivierung von ven Detergensspuren befreiter Cholesterinoxydase, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß wenigstens eine grenzflächenaktive Verbindung mit lipophüen und hydrophilen Eigenschaften, welche wenigstens eine OH-Gruppe enthält, der Cholesterinoxydase vor ihrer Verwendung zur Bestimmung von Cholesterin zugesetzt wird.

Als grenzflächenaktive Verbindung mit lipophilen und hydrophilen Eigenschaften werden vorzugsweise Polyoxyäthylenderivate von Alkyl-, Aryl- und Aralkylalkoholen verwendet. Beispiele für derartige bevorzugte grenzflächenaktive Verbindungen sind Hydroxypolyüthoxyalkane wie Hydroxypolyäthoxydodecan, Äthylenoxydaddukte von Alkylphenolen, Polyäthoxyäthylenderivate von Sorbitanhydriden und ähnliche. Auch mit Mercaptanen modifizierte Polyoxyäthylenderivate erwiesen sich als gut geeignet. Bei Verwendung der genannten bevorzugten Klasse von grenzflächenaktiven Verbindungen reichen im allgemeinen Zusätze zwischen etwa 0,005 und 0,1 Gew.-°/o völlig aus. Ähnlich gute Ergebnisse werden auch mit physiologischen grenzflächenaktiven Substanzen, die der obigen Defination genügen, beispielsweise mit den Desoxycholaten erzielt.

Daneben erwiesen sich auch andere grenzflächenaktive Substanzen mit sowohl lipophilen als auch hydrophilen Eigenschaften, welche wenigstens eine OH-Gruppe enthalten, als brauchbar. Beispiele hierfür sind Äthanol, Butyldiglycol und Hexylenglycol. Derartige niedrige Mono- und Dialkohole müssen jedoch in relativ großen Mengen von 10 bis 20 Vol.-% zur Erzielung der gewünschten Aktivierung zugesetzt werden, und ihre Eignung muß jeweils durch Versuche festgestellt werden. Keine Aktivierung wird beispielsweise mit Methanol, Äthylenglycol, Polyäthylenglycol, Cyclohexanol, Glycerin, Lecithin, Saponin erzielt. Ebenfalls ungeeignet sind grenzflächenaktive Verbindungen, die zwar lipophile und hydrophile Eigenschaften aufweisen, jedoch keine OH-Gruppe enthalten. Beispiele hierfür sind Natriumdi-(2-äthylhexyl)-sulfosuccinat, Natriumdodecylsulfat, Natriumoleat, Benzalkoniumchlorid und Cetylpyridiniumchlorid.

Die Inaktivierung der Cholesterinoxydase in Gegenwart von Detergentienspuren tritt besonders stark dann auf, wenn das Enzym in Ammonsulfatlösung vorliegt. In der nachstehenden Tabelle wird die Beeinflussung der Lagerungsstabilität des Enzyms in 1 M Ammonsulfat bei 33°C in Anwesenheit unterschiedlicher Detergensmengen angegeben. Die Versuche wurden mit einem Octylphenol-Äthylenoxydaddukt durchgeführt.

Aktivität von Cholesterinoxydase in %, bezogen auf frischhergestelltes Enzym

Tage Detergens

ohne 0,02% 0,05% 0,1% 0,6%

1Od 85% 60% 10% 7% 3%

22 d 89% 48% 1% 1% 1%

Die wirksame Menge der im erfindungsgemäßen Verfahren zugesetzten grenzflächenaktiven Verbindung hängt von ihrem Molekulargewicht und vom Grad der hydrophoben und hydrophilen Eigenschaften ab. Eine zu geringe Menge bewirkt keine Aktivierung, eine zu große Menge aber führt zu der für oberflächenaktive Substanzen allgemein bekannten Wirkung einer Dena-

turierung des Enzyms. Die geeigneten Konzentrationsbereiche sowie optimale Konzentrationen lassen sich für jedes geeignete oberflächenaktive Mittel durch Versuche feststellen. Geeignete Bereiche sind beispielsweise für Hydroxypolyäthoxydodecan 0,15 bis 0,6 Gew.-%, Octylphenoläthylenoxydaddukte zwischen 0,03 und 0,1 Gew.-%, für Polyoxyäthylenderivate von Sorbitanhydriden zwischen 0,15 und 0,6 Gew.-%, für Natriumdesoxycholat zwischen 0,03 und 0,05 Gew.-°/o, für Mercaptanmodifizierte Alkylphenoläthylenoxydaddukte zwischen 0,005 und 0,02 Gew.-%.

Das folgende Beispiel erläutert das erfindungsgemäße Verfahren.

Beispiel 1

0,05 ml Serum werden in 10 ml 0,5 M Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,5, der 0,4% Hydroxypolyäthoxydodecan enthält, gegeben. Es wird die Extinktion (E\) bei 240 nm in einem geeigneten Spektralphotometer abgelesen und die Reaktion mit 0,02 ml (=0,1 ξ) lagerstabiler, von Detergensspuren befreiter Cholesterinoxydase in 1 M Ammonsulfatlösung gestartet.

Nach 3 Minuten wird erneut die Extinktion (E₂) abgelesen. Die Konzentration des gebildeten Cholestenons und damit des Cholesterins ergibt sich aus der Differenz zwischen der ersten und zweiten Ablesung unter Berücksichtigung des molaren Extinktionskoeffizienten für Cholestenon bei 240 nm.

Die Messung einer typischen Probe ergab 62 mg% freies Cholesterin und 167 mg°/o Gesamtcholesterin (nach Verseifung).

Die Vergleichsbestimmung ohne Zusatz des oberflächenaktiven Mittels benötigte eine Reaktionszeit von 15 Minuten.

Die Abtrennung von Detergensspuren zur Verbesserung der Lagerfähigkeit des Enzyms erfolgt zweckmäßig mittels hydrophoben Adsorbensharzen.

Beispiel 2

0,05 ml Serum werden in 10 ml 0,5 M Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,5, gegeben. Es wird die Extinktion (E\) bei 240 nm in einem geeigneten Spektralphotometer abgelesen. Dann werden zu 0,2 ml ( = 0,2 E) lagerstabiler, von Detergentienspuren befreiter Cholesterinoxidase 0,2 ml einer 20proz. Hydroxypolyäthoxydodecan-Lösung gegeben. Mit 0,2 ml dieser so erhaltenen Cholesterinoxidase-Lösung wird die Reaktion nun gestartet, und nach 3 min wird erneut die Extinktion (E₂) abgelesen. Die Konzentration des gebildeten Cholestenons und damit des Cholesterins ergibt sich aus der

ίο Differenz zwischen der ersten und zweiten Ablesung unter Berücksichtigung des molaren Extinktionskoeffizienten für Cholestenon bei 240 nm und der Verdünnung durch die Cholesterinoxidase-Lösung. Die Messung einer typischen Probe ergab 53 mg freies Cholesterin/100 ml Serum und 144 mg Gesamtcholesterin/100 ml Serum (nach Verseifung).

Das Verfahren wurde wiederholt unter Verwendung von 0,2 ml einer 8proz. Octylphenolpolyäthylenoxid-Lösung anstelle der Hydroxypolyäthoxydodecan-Lösung.

Die Messung ergab ebenfalls die obigen Werte.

Beispiel 3

Zu 0,02 ml Serum werden 2,0 ml 0,5 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5, sowie 0,5 ml Äthanol gegeben. Es wird die Extinktion (Et) bei 240 nm in einem geeigneten Spektralphotometer abgelesen und die Reaktion mit 0,02 ml lagerstabiler, von Detergensspuren befreiter Cholesterinoxidase in 1 M Ammoniumsulfat gestartet. Nach 5 Minuten wird erneut die Extinktion (E₂) abgelesen Die Konzentration des gebildeten Cholestenons und damit des Cholesterins ergibt sich aus der

J5 Differenz zwischen der ersten und zweiten Ablesung unter Berücksichtigung des molaren Extinktionskoeffizienten für Cholestenon bei 240 nm. Die Messung einer typischen Probe ergab 49 mg freies Cholesterin/100 ml Serum. Die Vergleichsbestimmung ohne Zusatz des Alkohols benötigte eine Reaktionszeit von etwa 17 Minuten.

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Aktivierung von von Detergensspuren befreiter Cholesterinoxidase, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine grenzflächenaktive Verbindung mit lipophilen und hydrophilen Eigenschaften, welche wenigstens eine OH-Gruppe enthält, in einer wirksamen Menge der Cholesterinoxidase vor ihrer Verwendung zur Bestimmung von Cholesterin zugesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Polyoxyäthylenderivate von Alkyl-, Aryl- und Aralkylalkoholen verwendet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die grenzflächenaktive Verbindung in Mengen zwischen 0,005 und 0,1 Gew.-%, bezogen auf die wäßrige Enzymlösung, verwendet wird.