DE2439348A1 - Diagnostisches mittel zum nachweis und zur bestimmung von cholesterin und cholesterinestern in koerperfluessigkeiten - Google Patents

Diagnostisches mittel zum nachweis und zur bestimmung von cholesterin und cholesterinestern in koerperfluessigkeiten

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Description

BOEHRINGER MANNFL-IH CVBlI - ■ 193Ü, §.
Diagnostisches Mittel zum Nachweis und zur Bestimmung von Cholesterin und Cholesterinestern in Körperflüssigkeiten
Die Erfindung betrifft- ein diagnostisches Mittel zwo. Nachweis und zur Bestimmung von Cholesterin und Cholesterinestern in Körperflüssigkeiten. Die Bestimmung von Cholesterin hat für die medizinische Diagnostik eine erhebliche Bedeutung.
Die bekannteste Methode zur Cholesterinbestimmung basiert auf der Reaktion nach Liebermann und Burchardt. Hierbei bilden Cholesterin und Cholesterinester mit Essigsäureanhydrid und konzentrierter Schwefelsäure blau-grün-gefärbte Verbindungen, welche photometrisch gemessen werden können. Nachteile dieses Verfahrens sind Unspezifität und die Verwendung aggressiver und ätzender Reagenzien. .
Neuerdings sind Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin und Cholesterinestern bekanntgeworden, die auf der Oxidation von Cholesterin mit Sauerstoff zu Cholestenon und Wasserstoffperoxid basieren, die durch das neue Enzym Cholesterinoxidase katalysiert wird (DT-AS 2 224 132, DT-OS 2 246 695). Die Gewinnung dieses neuen Enzyms ist in den DT-AS 2 224 131 und 2 224 133 beschrieben. Die Methoden zur Bestimmung von Cholesterin mit diesem Enzym in den obengenannten Patenten basieren entweder auf einer Messung des Sauerstoffverbrauchs ■ oder auf einer Messung des gebildeten Cholestenons oder des Wasserstoffperoxids. Allen in diesen Patentanmeldungen beschriebenen Methoden ist jedoch gemeinsam, daß sie zwar quantitative Ergebnisse liefern, jedoch zeitraubend sind und/oder teuere Apparate, wie Sauerstoffelektroden oder Photometer bedürfen.
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In der klinischer. Chcm.w vc?rJen neuerdings mehr und mehr Schne.llt.este gewünscht, die zwar häufig nicht ganz so exakte Ergebnisse liefern, jedoch für die Routine- oder Reihenuntersuchung eine raschere und preiswertere Aussage ermöglichen. Die für den Schnelltest verwendeten diagnostischen Mittel sind etweder saugfähige Träger oder wasserfeste Filme, die sämtliche für die Reaktion benötigten Reagenzien enthalten. Bringt man diese diagnostischen Mittel in Berührung mit den zu prüfenden Körperflüssigkeiten so erhält man Farbreaktionen, die entweder anhand von Vergleichsfarben oder mit einfachen Reflektionsphotometern ausgewertet werden können.
Es ist klar, daß wagen der Verwendung von konzentrierter Schwefelsäure die Reaktion nach Liebermann und Burchardt für einen Schnelltest zur Bestimmung von Cholesterin nicht geeignet ist. Es schien jedoch erfolgversprechend, die neuen enzymatischen Bestimraungsinethoden für Cholesterin auch für einen Schnelltest auszunutzen. Da der Nachweis des gebildeten Wasserstoffperoxids in gekoppelten enzymatischen Methoden für die Bestimmung anderer Stoffe (z.B. Glukose, Galaktose) in Schnelltesten schon mehrfach erfolgreich ausgenutzt worden ist, schien dies die für einen Schnelltest zur Bestimmung von Cholesterin aussichtsreichste Methode.
Versuche zur Herstellung von Cholesterin-Schnelltesten durch Impregnation von Cholesterinoxidase, Peroxidase, einem Oxidationsindikator und einem Puffer auf ein saugfähiges Papier führten überraschenderweise nicht zum Ziel. Die erhaltenen Testpapiere reagierten nicht mit cholesterinhaltxgem Serum üblicher Konzentration. Es stellte sich damit die Aufgabe, die aus der photometrischen Cholesterinbestimmung bekannten Reagenziengemische so zu verändern, daß damit brauchbare Schnellteste hergestellt werden können.
Es wurde nun gefunden, daß man dann Testpapiere erhält, die mit cholesterinhaltxgem Serum abgestuft reagieren, wenn man der Imprägnierlösung zusätzlich oberflächenaktive Mittel zusetzt. Aus der DT-AS 2 224 132 ist zwar bereits bekannt, daß geringe Mengen von den oberflächenaktiven Stoffen die Reaktion nicht hindern, es war jedoch nicht zu entnehmen, daß diese Stoffe in größerer Menge in einem Schnelltest notwendig sind.
609810/0388 '
Die erfindungsgemäßen diagnostischen Mittel zum Nachweis und zur Bestimmung von Cholesterin und Cholesterinestern in Körper flüssigkeiten, durch Oxidation des Cholesterins mit Sauerstoff in Gegenwart von Cholesterinoxidase zu Cholestenon "und Wasserstoffperoxid und Nachweis des Wasserstoffperoxids durch Peroxidase katalysierte Oxidation eines Oxidationsindikator« nach an sich bekannten Methoden ist dadurch gekennzeichnet,, daß die Reagenzien auf einem saugfähigen Träger imprägniert oder in einen Kunststoff-Film eingebettet sind und ein oberflächenaktives Mittel in einer Konzentration von 2 bis 30 % der festen Reagenzien enthalten ist. Die oberflächenaktiven Mittel können nicht-ionogen, anionisch, kationisch und amphoter sein,
Von den nichtionocJerien oberflächenaktiven Mitteln sind beispielsweise die Polyoxy äthy lenverb in düngen brauchbar und zwar insbesondere die, die ein ausgewogenes Verhältnis von hydrophoben Rest zu Polyoxyäthylenkette besitzen und wasserlöslich sind. "■'._""; .
Eine Maßzahl für das Verhältnis von hydrophoben Rest und Polyoxy äthy lenk ette ist der sogenannte HLB-Werf (vgl. W. C. * Griffin, J. Soc. Cosmetic. Chem. JL 311 '(195O) und J5 249 (1954)
Besonders brauchbar sind oberflächenaktive' Stoffe mit HLB-Werten zwischen ca. 10 und 17. Diese Werte sind allerdings nur als Richtwerte zu betrachten, da die Wirksamkeit auch noch von der Natur des hydrophoben Restes abhängt.
Brauchbare nichtionogene Netzmittel entstammen etwa den folgenden Verbindungsklassen, wobei im Rahmen dieser Anmeldung unter der Bezeichnung Alkyl geradkettige oder wenig verzweigte Kohlenwasserstoffreste mit bis zu 2o,insbes. 12 - 18 C-Atomen zu verstehen sind:
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Polyoxyäthylen - Alkyl äther '
Polyoxyäthylen - Alky!carbonsäureester
Polyoxyäthylen - Sorbitan - Alky!carbonsäureester
Polyoxyathylen - Glycerin - Alky!carbonsäureester
Polyoxyäthylen - Alkylamine
Polyoxyäthylen - PoIyoxypropylen- Blockpolymerisate
Polyoxyäthylen - Alkylthioäther
Polyoxyäthylen - AIkylarylather
Von diesen Verbindungsklassen gibt es im Handel meist ganze Reihen, die sich in der Anzahl der Oxyäthylengruppen unterscheiden. Wie oben schon erwähnt sind am brauchbarsten die wasserlöslichen Vertreter, die sich durch eine mittlere Anzahl von Oxyäthylengruppen auszeichnen (ca. 5 - 20). Niederer oxyäthylierte Typen sind meist nur dispergierbar und daher weniger brauchbar. Höher· äthoxylierte Verbindungen (größer als 25) sind zwar wasserlöslich, aber schon wieder zu hydrophil, was die Wirksamkeit ebenso herabsetzt.
Von den anionischen Netzmitteln sind insbesondere die Salze von Gallensäuren wie Cholsäure, Taurocholsäure und Desoxychol-; säure gut. geeignet, weiterhin fettsaure Salze und Fettsäuresarkoside, von besonderer Bedeutung sind Schwefelsäurederivate, die bekanntlich die zusätzliche Eigenschaft haben, die farbigen radikalischen Oxidationsprodukte mancher Indikatoren (o-Tolidin, heterocyclische Azine) zu stabilisieren. Es sind dies z.B. folgende Klassen:
Sulfobernsteinsäureester „
Alkylarylsulfonate
Alkylsulfate
Alkylpolyoxyäthylensulfate
Von den kationischen Netzmitteln sind beispielsweise Alkylpyridinium - oder - trimethy!ammoniumsalze brauchbar, aber auch komplizierter aufgebaute Verbindungen wie z.B. Benzethoniumchlorid.
• A
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Von den amphoteren Netzmitteln sind beispielsweise die Imidazoliumfoetaiiie brauchbar.
Die erfindungsgemäßen oberflächenaktiven Mittel werden in Mengen von 2 bis 30 %, vorzugsweise etwa 10 bis 20 % bezogen aixf die festen Reagenzien, angewendet.
Zum Nachweis von Cholesterin im Serum sind Testpapiere' hervorragend geeignet. Will man Cholesterin jedoch im Vollblut nachweisen, so muß man die Testpapiere etwa gemäß DT-OS 1 598 048 hydrophobieren oder mit einer semiperrneablen Membran aus Celluloseestern oder dergleichen überziehen. Besonders bevorzugt sind jedoch für den Nachweis im Vollblut Tes.tfilme gemäß DBP 1 598 153. ,
Zu diesem Zweck werden Cholesterinoxidase, Peroxidase, Puffer, Indikator und gegebenenfalls Quellstoffe zusammen mit den erfindungsgemäßen oberflächenaktiven Stoffen in eine wäss3:ige Dispersion eines filmbildenden Polymeren eingerührt. Diese Dispersion wird zu einem dünnen Film ausgestrichen und getrocknet. Tropft man cholesterinhaltiges Blut auf einen solchen Reagenzfilm und wischt nach ca. einer Minute ab, so erhält man ebenfalls Färbungen, deren Farbtiefe von der Menge des Cholesterins abhängt. Diese Färbungen eignen sich besonders zur quantitativen Auswertung mit einfachen Remissionsphotometern. ■
Obige diagnostische Mittel sind geeignet zum Nachweis und zur Bestimmung von freiem Cholesterin. Liegen dagegen Cholesterinester vor, so muß aus diesen zunächst das Cholesterin freigesetzt werden. Dies kann auf herkömmliche Weise z.B. durch Verseifung mit wässrigem Alkali erfolgen. Von besonderem Vorteil ist jedoch die Esterspaltung mit Cholesterinesterase (die bevorzugt aus Mikroorganismen isoliert wird), da hierbei unter sehr schonenden Bedingungen gearbeitet werden kann. '
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Man kann die Cholesterinesterase der Körperflüssigkeit zusetzen und eine gewisse Zeit inkubieren. Man kann dieses Verfahren z.B.· so gestalten, daß man die Körperflüssigkeit in Kapillaren saugt, deren Innenwände in /Analogie zum DBP 2 240 672 mit Cholesterinesterase und eventuellen Hilfsstoffen belegt sind. Nach der Inkubation in den Kapillaren wird die Flüssigkeit dann wie oben beschrieben auf den Teststreifen aufgebracht- Wenn in der Körperflüssigkeit vorher freies und verestert.es Cholesterin nebeneinander vorlagen, so wird natürlich die Summe beider nachgewiesen. Besonders vorteilhaft kann man die Cholesterinesterase aber auch in die Teststreifen, mit einarbeiten, so daß man diagnostische Mittel, erhellt/ mit denen in einem Schritt die Summe von freiem und verestertem Cholesterin nachgewiesen bzw. bestimmt werden kann.
Die für den Nachweis des bei der Oxidation des Cholesterins gebildeten Wasserstoffperoxids benutzten Reagenzien (Peroxidase, Puffersysterne, Oxidationsindikatoren, Quellstoffe etc.) sind z.B. aus Beschreibungen von Schnelltesten für Glukose bekannt. Die folgenden Reagenzien seien jedoch illustrativ aufgeführt.
Von den Peroxidasen ist insbesondere die aus Meerrettich geeignet, aber auch Lactoperoxidase u.a. sind brauchbar.
Als Puffer kommen die gebräuchlichen wie z.B. Phosphat-, Citrat- oder Boratpuffer in Frage. Der pH-Wert, den sie auf dem diagnostischen Mittel einstellen, soll zwischen 4 und 9, vorzugsweise zwischen 5 und 8, liegen.
Als Oxidationsindikatoren kommen verschiedene Verbindungsklassen in Frage und zwar Benzidin-Derivate wie z.B.
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o-Tolidin, o-Vanillin-Derivate gejnäß DT-AS 1 598 133 oder heterocyclische Azine gemäß DT-AS-I 648. 840. -.·■ ■ . ..-■"; :·-
Man kann den Rezepturen für die. diagnostischen Mittel, -ins-', besonders für die Test filme,, auch n;p,ch gebräuchliche Quell-/ stoffe wie Natrium-Alginat, Carboxymethylcellulose Ui a. zusetzen, ferner Stabilisierungsmittel- .für ,die Enzyme wie s.B» ; Dithioerythriti : .. " ·.·.:. ■...'".
Grundstoffe für die Testfilme sind -Kunststoff-Dispersionen... aus beispielsweise Polyvinylpropionat oder -Acetat« In diese werden alle Reagenzien, vorzugsweise in gelöster Form einge-" . rührt, die Mischung wird- zu dünnen Filmen, ausgestrichen und getrocknet.
Die Teatpapiere werden in der. üblichen Weise hergestellt, ,in dem man die Reagenzien in Wasser .oder, in Gemischen aus Wasser und organischen Lösungsmittel löst, mit der. Lösung Filter-, papiere imprägniert und trocknet. Man,kann aber auch erst mit den wasserlöslichen Reagenzien vorimprägnieren und dann beispielsweise mit den Indikatoren aus organischer Lösung- naehimprägnieren
Die folgenden Beispiele sollen die.Erfindungen näher-erläutern. - ·
0 3 8 1/0/0386
Beispiel
Filterpapier (Schleicher & Schüll 597 NF Ind.) wird mit einer Lösung folgender Zusammensetzung getränkt und bei 40°C getrocknet;
1 molarer Zitratpiaffer pH 5,25 20 ml
Cholesterinox.i dase (60 U/mg) 0,1g
Peroxidase (70 U/mg) 0, 05 g
Wasser, dest. ad loo ml
Dieses Papier wird mit Lösungen von 0,2 g o-Tolidin in 100 ml Methylenchlorid imprägniert, die außerdem noch jeweils 1 g der folgenden oberflächenaktiven Stoffe enthalten:
a) Polyoxyäthylentributylphenoläther
b) Polyoxyäthylensorbitanmonolaurat
c) Polyoxyäthylennonylphenoläther
d) Polyoxyäthylenlauryläther
e) Polyoxyäthylencetylather
f) Polyoxyäthylenstearat - .
g) Polyoxyäthylendodecylthioäther
Nach dem Trocknen werden Testpapiere erhalten, die mit cholesterinhaltigen Seren mit grüner Farbe reagieren. Enthalten die Seren gleichzeitig Cholesterinester, so erhält man stärkere Grünfärbungen, wenn man die Seren einige Zeit zuvor mit einem Tropfen Cholesterinesterase-Lösung versetzt hat. Ein Testpapier, welches keinen oberflächenaktiven Stoff enthält, reagiert nicht mit den obigen Seren.
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- g
Beispiel
Filterpapier (Schleicher & Schüll 597 NF, Ind.) wird mit einer Lösung folgender Zusammensetzung getränkt und bei 40 C getrocknet:
1 molarer Zitratpuffer pH 7 ' 20 ml
Cholesterinoxidase (60. U/mg) 0,1 g
Cholefiterinesterase (18 U/mg) 0,25 g
Peroxidase (70 U/mg) 0,05 g
Wasser, dest. 100 ml
Dieses Papier wird mit Lösungen von 0,2 g o-Tolidin in 100 ml Methylenchlorid imprägniert, die außerdem noch 0,5 g der folgenden oberflächenaktiven Stoffe enthalten:
a) Polyoxyäthylencocoat
b) Polyoxyäthyleno1eat
c) Polyoxyäthylenpolypropylenglykol
d) Polyoxyäthylenstearylamxn
e) Polyoxyäthylenstearylamxn
f) Polyoxyäthylenglycerinmonolaurat
Nach dem Trocknen werden Testpapiere erhalten, die mit solchen Seren grün reagieren, die Cholesterin und/oder Cholesterinester enthalten. Testpapiere ohne oberflächenaktive Mittel, zeigen keine Reaktion.
Praktisch das gleiche Verhalten zeigen Testpapiere, die die gleiche Menge citratpuffer von pH 5,25 bzw. 6 enthalten.
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- LO—
Beispiel
Vorimprägniertes Papier gemäß Beispiel 1 wird mit Lösungen von O,3 g o-Tolidin in 100 ml Aceton nachimprägniert, die folgende oberflächenaktive Stoffe in Konzentrationen von 1,5 g enthalten:
a) Dioctylnatriumsulfosuccinat
b) Dodecylbenzolsulf-onsäure, Natriumsais
c) Laury!polyglykolethersulfat, Natriumsalz
d) Natriumlaurylsarkosinat
e) Natriumlaurat
f) Cholsäüre
g) Desoxicholsäure
h) NatriuKitaurocholat ■
Diese Testpapiere besitzen praktisch die gleichen Eigenschaften wie die Testpapiere gemäß Beispiel 1, jedoch sind die Reaktionsfarben langer stabil.
Ähnliche Eigenschaften besitzen entsprechende Testpapiere mit einem Phosphatpuffer von pH
- li -
Beispiel
Vorimprägniertes Papier gemäß Beispiel 2 wird mit Lösungen imprägniert, die 0,4 g o-Tolidin und je 0,5 g der folgenden oberflächenaktiven Stoffe enthalten:
a) Laury lpyr id in iunich lor i d
b) Benzethoniurachlorid
c) Cetyltrimethylamir.oniurnchlorid
d) i_Hydroxyäthyl-l-carboxymethyl~2-alkylimidazolinium--betain
Die Eigenschaften dieser Testpapiere entsprechen denen von Beispiel 2.
Beispiel 5
Filterpapier'(Schleicher &"Schall 597 ΝΓ, Ind.) wird mit einer Lösung folg<
getrocknet:
Lösung folgender Zusammensetzung imprägniert und bei 40 C
1 molarer Phosphatpuffer, pH 6 2 5 ml
Cholesterinoxidase (60 U/mg) 0,1g
Peroxidr-ise (70 ü/mg) 0,05 g
Cholsäure 1,0 g
Aceton 10 ml
Wasser, dest. ad 100 ml
Dieses Papier wird mit Lösungen von OxidationsIndikatoren in 100 ml Aceton nachimprägniert.
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Die Menge der Indikatoren, ihre chemische Struktur und ihre Farbreaktion mit cholesterinhaltxgem Seren ist in Tabelle zusammengefaßt.
Tabelle 1
Menge Indikator Farbreaktion
0,3 g ο-Vaη i1Iy1i d en-p~νaη i11oy1-
hydrazon		 violett
0, 2 g Azino-bis- (N-äthylbenzthia-
zolon~2-sulfonsäure-5)-		 grün
D iammon iuins a Iz
0,1g Ά ζ in ο -b i s ·■- (JI ~ a lky 1 ch in ο 1 on -
2-sulfonsäure~6)-Diammonium-
salz		 blauviolett
0,1 g Bis- (N-alky.lchinolon-2) -azin violett
0,1 g (N-Methylbenzthiazolon~2)-
N~äthylchinolon-2)-azin		 blaugrün
0, 3 g (N-Methylbenzthiazolon-2)-
l-phenyl-3, 4-dirnethyltria-
zolon-5)-azin		 blau
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-η.
Beispiel
45 5 g g g
35 g 25 g ml
ο, g
0, 6
1 "■
0,
50
Es V7ird eine Mischung aus folgenden Bestandteilen bereitet:
Polyvinylpropionat-Dispcrsion
Natriumalginat, 1,85 % in 0, 5 aiol. Phosphatpuffer,
pH 5,5 Cholesterinoxidase (60 U/rng)
Peroxidase (70 U/mg) , - ■"
Dioctylnatriunisulfosuccinat o-Tolidin, gelöst in 6 ml Aceton Wasser
Diese Mischung wird zu einem Film von ca. 300 nm Naßfilmdicke ausgezogen oder auf einem festen Träger ausgestrichen und bei 35 C getrocknet. Tropft man Blut mit Cholesteringehalt auf den Film und wischt das Blut nach einer Minute ab, so erhält man je nach Cholesterinkonzentration verschieden starke Grünfärbungen,
Fügt man obiger Rezeptur noch 1,0 g Cholesterinesterase zu, so erhält man Filme, mit denen man auch erhöhte Cholesterinestergehalte bestimmen kann.
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Claims (4)

Patentansprüche
1. Diagnostisches Mittel zum Nachweis und zur Bestimmung von Cholesterin und Cholesterinestern in Körperflüssigkeiten, durch. Oxideition des Cholesterins mit Sauerstoff in Gegenwart von Cholester.inoxidase zu Cholestenon und Wasserstoffperoxid und Nachweis des Wasserstoffperoxids durch Peroxidasekatalysierte Oxidation eines Oxidationsindikators, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien auf einem saugfähigen Träger imprägniert oder in einen Kunststoff-Film eingebettet sind und ein oberfläclienciktives Mittel in einer Konzentration von 2 bis 30 % der festen Reagenzien enthalten ist.
2. Diagnostisches Mittel zum Nachweis und zur Bestimmung von Cholesterin und Cholesterinestern in Körperflüssigkeiten, nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das oberflächenaktive Mittel in einer Konzentration von 10 - 20 % enthalten ist.
3. Diagnostisches Mittel zum Nachweis und zur Bestimmung von Cholesterin und Cholesterinestern in Körperflüssigkeiten gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der oberflächenaktive Stoff ein nicht-iogener Stoff mit einem HLB-Wert zwischen 10 und 17 ist.
4. Diagnostisches Mittel nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der oberflächenaktive Stoff ein anionisches Netzmittel, insbesondere das Salz einer Gallensäure, ist.
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DE742439348A 1973-12-07 1974-08-16 Diagnostisches Mittel zum Nachweis und zur Bestimmung von Cholesterin und Cholesterinestern in Körperflüssigkeiten Expired DE2439348C3 (de)

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