DE2439348C3 - Diagnostisches Mittel zum Nachweis und zur Bestimmung von Cholesterin und Cholesterinestern in Körperflüssigkeiten - Google Patents

Description

Die Bestimmung von Cholesterin hat für die medizinische Diagnostik eine erhebliche Bedeutung.

Die bekannteste Methode zur Cholesterinbestimmung basiert auf der Reaktion nach Liebermann und Burchardt. Hierbei bilden Cholesterin und Cholesterinesler mit Essigsäureanhydrid und konzentrierter Schwefelsäure blau-griin-gefärbte Verbindungen, welche photometrisch gemessen werden können. Nachteile dieses Verfahrens sind Unspezifitäi und die Verwendung aggressiver und ätzender Reagenzien.

Neuerdings sind Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin und Cholesterinestern bekanntgeworden, die auf der Oxidation von Cholesterin mit Sauerstoff zu Cholestenon und Wasserstoffperoxid basieren, die durch das neue Enzym Cholesterininoxidase katalysiert wird (DE-AS 22 24 132, DE-OS 22 46 695). Die Gewinnung dieses neuen Enzyms ist in den DE-AS 22 24 131 und 22 24 133 beschrieben. Die Methoden zur Bestimmung von Cholesterin mit diesem Enzym in den oben genannten Patentanmeldungen basieren entweder auf einer Messung des Sauerstoffverbrauchs oder auf einer Messung des gebildeten Cholestenons oder des Wasserstoffperoxids. Allen in diesen Patentanmeldungen beschriebenen Methoden ist jedoch gemeinsam, daß sie zwar quantitative Ergebnisse liefern, jedoch als »Naßteste« zeitraubend sind und/oder teuerer Apparate, wie Sauerstoffelektroden oder Photometer bedürfen.

In der klinischen Chemie werden neuerdings mehr und mehr Schnellteste gewünscht, die zwar häufig nicht ganz so exakte Ergebnisse liefern, jedoch für die Routine- oder Reihenuntersuchung eine raschere und preiswertere Aussage ermöglichen. Die für den Schnelltest verwendeten diagnostischen Mittel sind entweder saugfähige Träger oder wasserfeste Filme, die sämtliche für die Reaktion benötigten Reagenzien enthalten. Bringt man diese diagnostischen Mittel in Berührung mit den zu prüfenden Körperflüssigkeiten so erhält ma": Farbreaktionen, die entweder anhand von Vergleichsfarben oder mit einfachen Reflektionsphotometern ausgewertet werden können.

Es ist klar, daß wegen der Verwendung von konzentrierter Schwefelsäure die Reaktion nach Liebermann und Burchardt für einen Schnelltest zur Bestimmung von Cholesterin nicht geeignet ist Es schien jedoch erfolgversprechend, die neuen enzymatischen Bestimmungsmethoden für Cholesterin auch für

ίο einen Schnelltest auszunutzen. Da der Nachweis des gebildeten Wasserstoffperoxids in gekoppelten enzymatischen Methoden für die Bestimmung anderer Stoffe (z. B. Glukose, Galaktose) in Schnelltesten schon mehrfach erfolgreich ausgenutzt worden ist, schien dies die für einen Schnelltest zur Bestimmung von Cholesterin aussichtsreichste Methode.

Versuche zur Herstellung von Cholesterin-Schnelltesten durch Impregnation von Cholesterinoxidase, Peroxidase, einem Oxidationsindikator, einem Puffer sowie Netzmitteln in den in den obigen Patentanmeldungen angegebenen Rezepturen auf ein saugfähiges Papier führten überraschenderweise nicht zum Ziel. Die erhaltenen Testpapiere reagierten nicht oder nur sehr langsam mit cholesterinhaltigem Serum üblicher Konzentration. Es stellte sich damit die Aufgabe, die aus der photometrischen Cholesterinbestimmung bekannten Reagenziengemische so zu verändern, daß damit brauchbare Schnellteste hergestellt werden können.

Es wurde nun gefunden, daß man dann Testpapiere erhält, die mit cholesterinhaltigem Serum abgestuft reagieren, wenn man der Imprägnierlösung zusätzlich oberflächenaktive Mitte! in einer Menge von mindestens 0,5% zusetzt. Aus der DE-OS 22 24 132 und 22 46 695 ist zwar bereits bekannt, daß geringe Mengen

.15 von den oberflächenaktiven Stoffen die Auflösung von Cholesterin- und Cholesterinester-Komplexen fördern (DE-OS 22 46 o95, S. 20) und die enzymatische Reaktion nicht hindern, jedoch oberflächenaktive Stoffe in Mengen von über 0,25% die enzymatische Reaktion hemmen (DE-OS 22 46 695, S. 14). Die oberflächenaktiven Stoffe, die bei der Gewinnung der Colesterinoxydase aus Mikroorganismen in der Enzympräparation verbleiben, sollen deshalb durch spezielle Maßnahmen, wie Dialyse, Gelfiltration oder Umfallen der Enzyme, entfernt oder auf einen annehmbaren Gehalt reduziert werden. Aus der DE-OS 23 61 169 war ferner bekannt, daß Cholesterinoxydase auch in fester Form bei längerer Lagerung irreversibel durch anhaftende Spuren von oberflächenaktiven Mitteln zerstört wird, so daß es vorteilhaft ist, das Enzym erst kurz vor der Reaktion mit der notwendigen Menge von oberflächenaktiven Substanzen zu vermischen. Unter diesen Umständen war es nicht zu erwarten, daß zur Herstellung brauchbarer Schnellteste diese oberflächenaktiven Stoffe in Mengen von mindestens 0,5% der Imprägnierlösung zugesetzt werden müssen, um genügend aktive Teste zu erhalten und andererseits diese Teste trotz des hohen Gehalts an oberflächenaktiven Stoffen ausreichend lagerstabil sind.

ho Die Erfindung bezieht sich somit auf ein diagnostisches Mittel zum Nachweis und zur Bestimmung von Cholesterin und Cholesterinestern in Körperflüssigkeiten, enthaltend Cholesterinoxidase, ein Mittel zum Nachweis von Wasserstoffperoxid bestehend aus

<>s Peroxidase und einem Oxidationsindikator und gegebenenfalls Cholesterinesterase und ist dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien auf einem saugfähigen Träger imprägniert oder in einen Kunststoff-Film

eingebettet sind und ein oberflächenaktives Mittel in einer Konzentration von mindestens 0,5% der Imprägnierlösung enthalten.

In den nicht vorveröffentlichten DE-OS 24 09 696 und 25 12 585, werden bereits Schnellteste vorgeschlagen. Die Vorschläge umfassen im einen Falle den Zusatz von Cholinesterhydrolase und einem Gallensäure-Co-Faktor und im anderen Falle den Zusatz einer Protease und einer oberflächenaktiven Verbindung. In diesen Anmeldungen wird jedoch nicht beansprucht oder erwähnt, daß das oberflächenaktive Mittel in einer Konzentration von mindestens 0,5% der Imprägnierlösung enthalten sein solL

Die oberflächenaktiven Mittel gemäß der vorliegenden Erfindung können nichtionogen, anionisch, kationisch und amphoter sein.

Von den nichtionogenen oberflächenaktiven Mitte'n sind beispielsweise die Polyoxyäthyltnverbindungen brauchbar, und zwar insbesondere die, die ein ausgewogenes Verhältnis von hydrophoben Rest zu Polyoxyäthylenkette besitzen und wasserlöslich sind.

Eine Maßzahl für das Verhältnis von hydrophoben Rest und Polyoxyäthylenkette ist der sogenannte HLB-Wert (vgl. W. C. Gr if fin, J. Soc. Cosmetic. Chem. 1 311 [1950] und 5 249 [1954]). Besonders brauchbar sind oberflächenaktive Stoffe mit HLB-Werten zwischen ca. 10 und 17. Diese Werte sind allerdings nur als Richtwerte zu betrachten, da die Wirksamkeit auch noch von der Natur des hydrophoben Restes abhängt

Brauchbare nichtionogene Netzmittel entstammen etwa den folgenden Verbindungsklassen, wobei im Rahmen dieser Anmeldung unter der Bezeichnung Alkyl geradkettige oder wenig verzweigte Kohlenwasserstoffreste mit bis zu 20, insbesondere 12 — 18 C-Atomen zu verstehen sind:

Polyoxyäthylen Polyoxyäthylen Polyoxyäthylen

säureester

Polyoxyäthylen — Glycerin — Alkylcarbon-

säureester

Polyoxyäthylen Polyoxyäthylen

polymerisate

Polyoxyäthylen Polyoxyäthylen

- Alkyläther

- Alkylcarbonsäurcester

- Sorbitan - Aikylcarbon-

- Alkylamine

- Polyoxypropylen — Block-

-Alkylthioäther

- Alkylaryläther

Von diesen Verbindungsklassen gibt es im Handel meist ganze Reihen, die sich in der Anzahl der Oxyäthylengruppen unterscheiden. Wie oben schon erwähnt, sind am brauchbarsten die wasserlöslichen Vertreter, die sich durch eine mittlere Anzahl von Oxyäthylengruppen auszeichnen (ca. 5—20). Niederer oxyäthylierte Typen sind meist nur dispergierbar und daher weniger brauchbar. Höher äthoxylierte Verbindungen (größer als 25) sind zwar wasserlöslich, aber schon wieder zu hydrophil, was die Wirksamkeit ebenso herabsetzt.

Von den anionischen Netzmitteln sind insbesondere die Salze von Gallensäuren wie Cholsäure, Taurocholsäure und Desoxycholsäure gut geeignet weiterhin fettsaure Salze und Fettsäuresarkoside, von besonderer Bedeutung sind Schwefelsäurederivate, die bekanntlich die zusätzliche Eigenschaft haben, die farbigen radikalischen Oxidationsprodukte mancher Indikatoren (o-Tolidin, heterocyclische Azine) zu stabilisieren. Es sind dies

z. B. folgende Klassen:

Sulfobernsteinsäureester Alkylarylsulfonate Alkylsulfate

Alkylpolyoxyäthylensulfate

Von den kationischen Netzmitteln sind beispielsweise Alkylpyridinium — oder — trimethylammoniumsalze ίο brauchbar, aber auch komplizierter aufgebaute Verbindungen wie z. B. Benzethoniumchlorid.

Von den amphoteren Netzmitteln sind beispielsweise die Imidazoliumbetaine brauchbar.

Die erfindungsgemäßen oberflächenaktiven Mittel werden in einer Konzentration von 2 bis 30%, vorzugsweise etwa 10 bis 20%, bezogen auf die festen Reagenzien, angewendet

Zum Nachweis von Cholesterin im Serum sind Testpapiere hervorragend geeignet Will man Cholesterin jedoch im Vollblut nachweisen, so muß man die Testpapiere etwa gemäß DE-OS 15 98 048 hydrophobieren oder mit einer semipermeablen Membran aus Celluloseestern oder dergleichen überziehen. Besonders bevorzugt sind jedoch für den Nachweis im Vollblut Testfilme gemäß DE-PS15 98 153.

Zu diesem Zweck werden Cholesterinoxidase, Peroxidase, Puffer, Indikator und gegebenenfalls Quellstoffe zusammen mit den erfindungsgemäßen oberflächenaktiven Steffen in eine wäßrige Dispersion eines filmbildenden Polymeren eingerührt. Diese Dispersion wird zu einem dünnen Film ausgestrichen und getrocknet. Tropft man cholesterinhaltiges Blut auf einen solchen Reagenzfilm und wischt nach ca. einer Minute ab, so erhält man ebenfalls Färbungen, deren Farbtiefe von der Menge des Cholesterins abhängt. Diese Färbungen eignen sich besonders zur quantitativen Auswertung mit einfachen Remissionsphotometern.

Liegt das zu bestimmende Cholesterin in Form von Cholesterinestern vor, so muß aus diesen zunächst das Cholesterin freigesetzt werden. Dies kann auf herkömmliche Weise z. B. durch Verseifung mit wäßrigem Alkali oder durch Esterspaltung mit Cholesterinesterase erfolgen.

Besonders vorteilhaft kann man die Cholesterinester-

ase in die Teststreifen mit einarbeiten, so daß man diagnostische Mittel erhält, mit denen in einem Schritt die Summe von freiem und verestertem Cholesterin nachgewiesen bzw. bestimmt werden kann.

Für den Nachweis des bei der Oxidation des Cholesterins gebildeten Wasserstoffperoxids werden die aus Beschreibungen von Schnelltesten für Glukose bekannten Reagenzien (Peroxidase, Puffersysteme, Oxidationsindikatoren, Quellstoffe etc.) benutzt. Näheres ergibt sich aus den nachfolgenden Beispielen. Die Testpapiere und Testfilme können in der üblichen Weise hergestellt werden.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.

Beispiel 1

Filterpapier (Schleicher & Schüll 597 NF Ind.) wird mit einer Lösung folgender Zusammensetzung getränkt und bei 40⁰C getrocknet:

f>5 1 molarer Zitratpuffer pH 5,25 20 ml

Cholesterinoxidase (60 U/mg) 0,1g Peroxidase (70 U/mg) 0,05 g Wasser, dest. ad 100ml

Dieses Papier wird mit Lösungen von 0,2 g o-Tolidin in 100 ml Methylenchlorid imprägniert, die außerdem noch jeweils 1 g der folgenden oberflächenaktiven Stoffe enthalten:

a) Polyoxyäthylentributylphenoläther

b) Polyoxyäthylensorbitanmonolaurat

c) Polyoxyäthylennonylphenoläther

d) Polyoxyäthylenlauryläther

e) Polyoxyäthylencetyläther

f) Poiyoxyäthylenstearat

g) Polyoxyäthylendodecylthioäther

Nach dem Trocknen werden Testpapiere erhalten, die mit cholesterinhaltigen Seren mit grüner Farbe reagieren. Enthalten die Seren gleichzeitig Cholesterinester, so erhält man stärkere Grünfärbungen, wenn man die Seren einige Zeit zuvor mit einem Tropfen Cholesterinesterase-Lösung versetzt hat Ein Testpapier, welches keinen oberflächenaktiven Stoff enthält, reagiert nicht mit den obigen Seren.

Beispiel 2

Filterpapier (Schleicher & Schüll 597 NF, Ind.) wird mit einer Lösung folgender Zusammensetzung getränkt und bei 40° C getrocknet:

1 molarer Zitratpuffer pH 7 20 ml

Cholesterinoxidase (60 U/mg) 0,1 g

Cholesterinesterase (18 U/mg) 0,25 g

Peroxidase (70 U/mg) 0,05 g

Wasser, desL 100 ml

Dieses Papier wird mit Lösungen von 0,2 g o-Tolidin in 100 ml Methylenchlorid imprägniert, die außerdem noch 0,5 g der folgenden oberflächenaktiven Stoffe enthalten:

Diese Testpapiere besitzen praktisch die gleichen Eigenschaften wie die Testpapiere gemäß Beispiel 1, jedoch sind die Reaktionsfarben langer stabil.

Ähnliche Eigenschaften besitzen entsprechende Testpapiere mit einem Phosphatpurfer von pH 7.

Beispiel 4

Vorimprägniertes Papier gemäß Beispiel 2 wird mit Lösungen imprägniert, die 0,4 g o-Tolidin und je 0,5 g ίο der folgenden oberflächenaktiven StGffe enthalten:

a) Laurylpyridiniumchlorid

b) Benzethoniumchlorid

c) Cetyltrimethylammoniumchlorid

d) l-Hydroxyäthyl-i-carboxymethyl^-alkylimidazolinium-betain

Die Eigenschaften dieser Testpapiere entsprechen denen von Beispiel 2.

Beispiel 5

Filterpapier (Schleicher & Schüll 597 NF₁ Ind.) wird mit einer Lösung folgender Zusammensetzung imprägniert und bei 40°C getrocknet:

1 molarer Phosphatpuffer, pH 6	25 ml
Cholesterinoxidase (60 U/mg)	0,1 g
Peroxidase (70 U/mg)	0.05 g
Cholsäure	!.Og
Aceton	10 ml
Wasser, desL	ad 100 ml

Dieses Papier wird mit Lösungen von Oxidationsindikatoren in 100 ml Aceton nachimprägniert.

Die Menge der Indikatoren, ihre chemische Struktur und ihre Farbreaktion mit cholesterinhaltigem Seren ist in der Tabelle zusammengefaßt

a) Polyoxyäthylencocoat

b) Polyoxyäthylenoleat

c) Polyoxyäthylenpolypropylenglykol

d) Polyoxyäthylenstearylamin

e) Polyoxyäthylenglycerinmonolaurat

Nach dem Trocknen werden Testpapiere erhalten, die mit solchen Seren grün reagieren, die Cholesterin und/oder Cholesterinester enthalten. Testpapiere ohne oberflächenaktive Mittel zeigen keine Reaktion.

Praktisch das gleiche Verhalten zeigen Testpapiere, die die gleiche Menge Citratpuffer von pH 5,25 bzw. 6 enthalten.

Beispiel 3

Vorimprägniertes Papier gemäß Beispiel 1 wird mit Lösungen von 03 g o-Tolidin in 100 ml Aceton nachimprägniert, die folgende oberflächenaktive Stoffe in Konzentrationen von 1,5 g enthalten:

a) Dioctylnatriumsulfosuccinat

b) Dodecylbenzolsulfonsäure, Natriumsalz

c) Laurylpolyglykoläthersulfat, Natriumsalz

d) Natriumlaurylsarkosinat

e) Natriumlaurat

f) Cholsäure

g) Desoxicholsäure

h) Natriumtaurocholat

40	Tabelle	indikator	Farbreaktion
	Menge	o-Vanillyliden-p-vanilloyl-	violett
	0,3 g	hydrazon
45		Azino-bis-(N-äthylbenz-	grün
	0,2 g	thiazolon-2-sulfon-
		säure-5)-Diammoniumsalz
		Azino-bis-(N-alkyl-	blauviolett
	0,1g	chinolon-2-sulfonsäure-6)-
5°		Diammoniumsalz
		Bis-(N-alkylchinolon-2)-	violett
	0,1g	azin
		(N-Methylbenzthia-	blaugrün
	0,1g	zolon-2)-N-äthylchino-
55		lon-2)-azin
		(N-Methylbenzthia-	blau
	0,3 g	zolon-2)-1 -phenyI-3,4-di-
		methyltriazolon-5)-azin

Beispiel 6

Es wird eine Mischung aus folgenden Bestandteilen bereitet:

Polyvinylpropionat-Dispersicn 45 g

Natriumalginat, 1,85% in 0,5 mol.
Phosphatpuffer, pH 5.5 35 g

7 8

Cholesterinoxidase(60 U/mg) 0,5 g ausgestrichen und bei 35"C getrocknet. Tropft man Blut

Peroxidase(70 U/mg) 0,25 g mit Cl-M^Meringchalt auf den IiIm und wischt das RL ι

Dioctylnatriumsulfosuccinat 1 g nach einer Minute ab, ·,< .r^lt man je nach

o-Toiidin, gelöst in 6 ml Aceton 0,6 g C holesterinkonzentration verschieden si.irke < iiiinlär-

Wasser 50 ml > bungen.

Fügt man obiger Rezeptur noch 1.0 g C'hnlosierin-

Diesf» Mischung wird zu einem Film von ca. 300 nm esterase .»u, so crhiilt man Filme, n». denen man auch

Na.jfilmdicke ausgezogen oder auf einem festen Träger erhöhte ("holesterim^tergehalte bostinvnen kann.

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Diagnostisches Mittel zum Nachweis und zur Bestimmung von Cholesterin und Cholesterinestern in Körperflüssigkeiten, enthaltend Cholesterinoxidase, ein Mittel zum Nachweis von Wasserstoffperoxid, bestehend aus Peroxidase und einem Oxidationsindikator, und gegebenenfalls Cholesterinesterase, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien auf einem saugfähigen Träger imprägniert oder in einen Kunststoff-Film eingebettet sind und ein oberflächenaktives Mittel in einer Konzentration von mindestens 0,5% der Imprägnierlösung enthalten ist.

2. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das oberflächenaktive Mittel in einer Konzentration von 2 bis 30% der festen Reagenzien enthalten ist

3. Diagnostisches Mittel nach Anspruch ] oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der oberflächenaktive Stoff ein nichtionogener Stoff mit einem HLB-Wert zwischen 10 und 17 ist.

4. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1 oder 2„ dadurch gekennzeichnet, daß der oberflächenaktive Stoff ein anionisches Netzmittel, insbesondere das Salz einer Gallensäure ist.