DE1932419A1 - Diagnostiziermittel zum Glukosenachweis und zur pH-Bestimmung - Google Patents

Description

• Diagnostiziermittel zum Glukosenachweis und zur pH-Bestimmung Die Erfindung betrifft Diagnostiziermittel zur Glulcosebestimmung in Flüssigkeiten, vornehmlich Körperflüssigkeiten wie Urin, Zervikalschleim und insbesondere im Blut, zur pH-Bestimmung und zur kombinierten Bestimmung von Glukose- und pH-Wert nebeneinander sowie Verfahren zur Herstellung dieser Mittel.
• Es sind Diagnostiziermittel in Form von Teststreifen oder Testtabletten bekannt, die Glukoseoxydase, Peroxydase oder Katalase enthalten, denen ein geeignete Indikator zugesetzt ist und die einen spezifischen Nachweis atS Glulcose in körperflüssigkeiten ermöglichen, Ebenfalls ist bekannt, anstelle von Peroxydase anorganische Verbindungen einzusetzen, die Peroxydase-Wirkung zeigen, z.B. Ammoniummolybdat oder Ammoniumvanadat in Verbindung mit Kaliumjodid.
• Die nach diesem Prinzip hergestellten Teststreifen haben den Mangel, daß sie z.B. bei Anwesenheit von Glukose keine einheitliche Färbung ergeben und deshalb eine halbquantitative Bestimmung erschwert ist0 Es ist bekannt, diesen Nachteil durch Zusatz von Gelatine, Natriumalginat, oberflächenaktiven Stoffen, Lösuungshilfsmitteln wie Po lyoxyä-thylenve bindungen, höhermolekularen Kohlehydraten wie Stärke, Polyvinylpyrrolidone oder Methylvinyläther zu beseitigen.
• Teilweise wurden auch die Fermente nebeneinander aufgetragen und so eine Verbesserung erreicht.
• Von der Praxis wird außerdem gefordert, daß der Ii1diJ bor die eintretende Farbänderung möglichst lange anzeigt un der Streifen so noch nach einigen Wochen auswertbar ist, da sonst Reihenuntersuchungen nur schwierig möglich sind.
• Auch diesen Anforderungen entsprechen die ursprünglichen Diagnostiziermittel nicht. Es sind deshalb in der Folgezeit Verfahren bekannt geworden, die durch Zusatz von kationaktiven Verbindungen oder Gerbsäuren eine lange Haltbarkeit der Indikatorreaktion erreichen.
• Während Glukose im Urin normalerweise nicht verkommt, betragen die Glukosemengen im Urin bei Diabetikern zwischen 100 bis 8000 mg/100 ml. Dagegen enthält ßlut immer eine bestimmte Menge Glokose, die beim gesunten Menschen 80 bis 140 mg/100 ml beträgt. Bei Diabetikern steigt der Glukosegehalt im Blut bis auf 800 mg/100 ml an.
• Der Glukosebestimmung im blut kommt deshalb eine besondere Bedeutung zu.
• Mit den oben beschriebenen Diagnostiziermitteln war die Glukosebestimmung im Blut mit einer halbquantitativen Aussage nicht möglich, da der Blutfarbstoff auf die Faser aufzieht und die eintretende Farbreaktion überdeckt.
• Hinzu kommt, daß das im Blut enthaltene Eiweiß sich sehr störend auf die Reaktion auswirkt und den Indikator in seiner Farbe stark beeinflußt. Zur Beseitigung dieser Nachteile sind Verfahren bekannt ,,eworden, nach denen die Teststreifen zusätzlich mit Polyvinylpyrrolidon oder Methylvinyläther imprägniert werden und anschließend einen überzug aus Zelluloseestern malten. I)ie so geschaffene semipermeable Folie läßt den Blutfarbstoff und das Eiweiß nicht in die Faserhohlräume eindringen, so daß die Farbreaktion normal verläuft.
• Nach einem anderen Verfahren ist durch die Verwendung von Vlies als Trägermaterial das berziehen mit einer semipermeablen Folie überflüssig geworden. Es ist auch bekannt, das Eiweiß und den Blutfarbstoff vorher aus dem Blut auszufällen und die Reaktion auf dem Streifen mit der Restlösung auszuführen.
• Ein weiterer Nachteil der ersten bekanntgewordenen Teststreifen war, daß sie nicht spezifisch auf bestimmte Glukosekonzentrationen ansprechen. Zur Beseitigung dieses Nachteiles ist ein Verfahren bekanntgevorden, durch Zusatz von reduzierenden Stoffen die Hydrochinon, die Teststreifen auf eine bestimmte Glukosekonzentration einzusteilen.
• Die nach diesem Verfahren hergestellten Streifen ermöglichen eine Glukosebestimmung zwischen 40 und 200 mg/100 ml.
• Sie erfaspen damit den verschmlich interessierenden pathologischen Bereich, der bei 150 mg/100 ml beginnt und bis 800 mg/100 ml reicht, nur sehr ungenügend.
• Testpapiere zur ph-Bestimmung sind bekannt.
• Diese Testpapiere, die mit pH-Indikatoren ganz oder teilweise getrünkt sind, zeigen in den meisten Fällen der Praxis beim eintauchen in @assrige Lösungen einen Auswascheffekt, d.h. der Farbstoff wird durch das Lösungsmittel ausgewaschen und die pH-Bestimmung dadurch ungenen.
• Es sind Verfahren bekannt, diesen Auswascheffekt zu verhindern, indem durch Zusätze von quaternären Ammoniumverbindungen, durch kationaktive Verbindungen, durch Gerosäure u. ä. die Farbindikatoren auf der Faser fixiert werden.
• Für bestimmte Untersuchungen ist es zweckmößig, Teststreifen zu vorwenden, mit denen mehrere Bestimmungen gleichzeitig nebeneinander durchgeführt werden können.
• Diese Teststreifen bestehen aus mehreren nebeneinander aufgetragenen Reagentien, wie z. B. einem pH-Indikator, einem Fermentindikatorsystem zum Glokosenachweis, einem Peroxyd bzw. ein Peroxyd lieferndem System gemeinsan mit einem Indikator, der bei Anwesenheit von Peroxydane (z. B.
• im blut) den Indikator zur Reaktion mit dem Peroxyd bringt und damit einen Nachweis von Blat z. B. im Urin gestattet.
• Nach bisher bekannten Verfahren lassen sich derartige Mehrfachstreiten mur herstelltn, wenn die einzelnen Zonen durch eine Sperrzone voneinander getrennt werden, die verhindert, daß die Reagentien zusammenfließen oder bei der Reaktion die sich Bildenden Farbstoffe verlaufen. Als Sperrzone werden z. B. Zelluloseester verwendet.
• Die Erfindung bezweckt die Herstellung von Diagnostiziermitteln zum Glukosenschweis, zur pH-Bestimmung und zu kombinierten Bestimmungen, die universell einsetzbar sind, Reihenuntersuchungen rationeller gestalten helfen und eine bessere Selbstkontrolle der Diabetiker ermöglichen Aufgabe der Erfindung ist es, einfach und rationell herstellbare Diagnostiziermittel zu entwickeln, die a) bei Glukosebestimmungen in Körperflüssigkeiten eine einheitliche Färbung möglichst lange anzeigen, deren Auswertung durch Blutfarbstoff bzw Eiweiß nicht beeinträchtigt wird und die über einen großen Meßbereich, insbesondere den pathologischen Bereich im Blut von 150 mg/100 ml bis 800 mg/100 ml eine halbquantitative Bestimmung ermöglichen, b) bei pH-Bestimmungen durch längere Fixierung der Farbe das Auswaschen verhindern.
• c) in form von Kombinationsteststreifen die Bestimmung von Glukose, die pH-Bestimmung und den Blutnachweis z.B im Harn, nebeneinander unter den gleichen Anforderungen wie bei a) und b) beschrieben, gestatteten.
• Es wurde nun gefunden, daß organische Siliziumverbindungen der allgemeinen Formel worin R1 bis R8 Wasserstoff oder niedere Alkylgruppen der Kettenlänge. C1 bis C6 oder Arylgruppen bedeutet, auf die bei der Glukosebestimmung zur Verwendung kommenden Fermente einen stabilisierenden Ejnfluß ausüben. Dadurch wird vermieden, daß die Fermente, in diesem Fall insbesondere die Peroxylase, in ihrer Aktivität nachlagaen.
• Dieser Aktivitätsabfall, der in den ersten Tagen besonders stark ist, wird durch die große Oberfläche der Xragermaterialien z,B, Papier, noch begünstigt.
• Auch Hydrophobierungsmittel auf Silikonbasis, die aus Copolymeren von siliziumorganischen Verbindungen und langkettigen aliphatischen Verbindungen bestehen, die gegebenenfalls noch substituiert sind, können zur Erreichung des gleichen Effektes Verwendung finden.
• Für die Teststreifen, die mit siliumorganischen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) behandelt wurden, konnte ein wesentlich geringerer Aktivitätsabfall festgestellt werden.
• Die bekannte Tatsache der völligen Hydrophobierung von saugfähigem Material wie Papier, Pappe, natürliche oder synthetische Fasern, Gewebe, die für die iterstellung der erfindungsgemäßen Diagnostiziermittel als Trägermaterial dienon können, durch organische Siliziumverbindungen der allgemeinen Formel (I) verhindert die Fermentreaktion nicht, sondern wirkt sich vor allem bei der Blutzuckerbestimmung sehr günstig aus.
• Als Indikatoren können Verbindungen verwendet werden, die mit Wasserstoffperoxyd bei Anwesenheit von Peroxydase reagieren, z. B. o-Tolidin, o-Dianisinin, Benzidinhydrochlorid, Guajakol, Leukofarbstoffe und Phenylendiamine.
• Derartig hergestellte Teststreifen, die an sich völlig hydrophob sind, reagieren an der Grenzfläche zwischen Flüssigkeit und Trägermaterial sehr schnell und völlig einwandfrei und ergeben einheitliche Färbungen.
• Die entstehende be ist, Je nach Art es verwendeten Indikators, bis zu einigen Wochen haltbar, Blutfarbstoff und Eiweiß sowie andere färbende Stoffe dringen in den Teststreifen nicht ein und können durch Abtupfen oder Abwaschen entfernt werden.
• Nach diesem Verfahren hergestellte Teststreifen gestatten z. B. eine Glukosebestimmung im Blut zwischen 40 und 800 mg/ 100 ml in halbquantitativer Form.
• Die Empfindlichkeit des Testes soll durch folgende Tabellen der Intervalle der zur Verwendung gelangenden Farbvergleichsskalen näher beschrieben werden.
• Die Tabellen. sind identisch mit den bei der Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Verwendung gelangenden Vergleichsskalen.
• Tabelle 1: Tabelle 2: mg Glucose/100 ml Blut 40 90 140 200 300 500 800 3 Glucose/100 ml Blut 25 100 150 200 300 500 300 Dadurch können z. B. bei Reihenuntersuchungen nicht nur die Personen herausgefunden werden, die einen erhöhten Zuckerspiegel in Harn oder Blut aufweisen, sondern es ist mit dem empfindungsgemäßen Diagnostiziermittel erstmals möglich, diejenigen Diabetiker zu erkennen, die einen solchen Zuckerspiegel aufweisen, der eine sofortige ärztliche Behandlung erfordert. Das ist bei der zunehmenden Diabeteshäufigkeit -hervorgerufen durch Fehl- und Überernährung, Adipositas, adenotrope Infekte, sich summiersine Stress-Situationen -von großer Bedeutung.
• Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Diagnostiziermittel besteht darin, daß es durch die Grenzflächenreaktion möglich wird, selbst bei Verwendung von sehr dehnem Papier als Trägermaterial, jeden Teststreifen auf der Vorner- und Rückseite zu benutzen, da die Reaktion nur an der Oberfläche des Streifens eintritt und deshalb auf der Rückssite sicht sichtbar wird.
• Es wurde weiterhin gefunten, daß bei der Behandlung von pH-Indikatorpapieren mit siliziumorganischen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) und der dadurch erfolgenden Hydrophobierung, auch hier an der Grenzfläche zwischen der zu prüfenden Flüssigkeit und dem Trägermaterial, die übliche Reaktion eintritt, ohne daß es zu einem Auswascheffekt kommen kann. Dadurch wird es möglich, den Teststreifen zu mehreren Bestimmungen zu benutzen.
• Außerdem kann dadurch der Streifen mit der eingetretenen Färbung über längere Zeit zu Vergleichszwecken aufbewahrt werden. Es wurde weiterhin gefunden, wenn man beispielsweise Teststreifen nebeneinander mit einem pH-Indikator, einer Fermentindikatorlösung zum Nachweis von Glukose sowie einer Indikatorperoxyulösung so tränkt, daß die Lösungen nicht auf Grund der Saugfähigkeit des verwendeten Trägermaterials ineinanderlaufen. d. h., daß mindestens ein Zwischenraum von 1 bis 2 mm verbleibt und die so erhaltenen Teststreifen anschließend mit siliziumorganischen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) behandelt, daß die einzelnen Reaktionszonen fest auf der Faser fixiert sind und die bisher üblichen Sperrzonen entfallen können.
• Die Herstellung der erfindungsgemäßen Diagnostiziermittel, vornehmlich in Form vou Teststreifen, ist auf verschiedene Weise möglich.
• Die Hydrophobierung des Trägermaterials kann wahlweise mit Lösungen oder Emulsionen der siliziumorganischen Verbindungen der allgemeinen Formel (I3 erfolgen. Im letzteren Fall macht sich eine Vernetzung der Sislikonschicht, z. B.
• mit geeigneten Epoxydharzen, Säuren oder Basen erforderlich.
• Die Lösungen und Emulsionen gelangen vorteilhafterweise in einem Konzentrationsbereich von 1 - 20 %, vorzugsweise 5 - 10 <0 zum Einsatz.
• Dabei kann das Tränken der Teststreifen mit deu siliziumorganischen Verbindungen vor oder nach der Imprägnierung der Teststreifen mit den verschiedenen Indikator lösungen erfolgen.
• Bei der Herstellung der Teststreifen zur Glukosebestimmung ist es ebenfalls möglich, die Teststreifen zunächst mit der Fermentlösung zu tränken, dann mit der siliziumorganischen Verbindung zu behandeln und erst anschließend die Indikatorlösung aufzutragen.
• Die folgenden Beispiele solleu die Erfindung näher erläutern, aber in kleiner Weise einschränken.
• Beispiel 1: Glukoseoxydase 40 mg @eerrettichperoxydase 5 mg c-Tolidin 100 mg Äthanol 30 %ig 10 ml.
• Ein geeignete Trägermaterial, z. B. Filterpapier, wird mit dieser Lösung getränkt und getrocknet. Anschließend wird das Papier mit einer 5 %igen Methylsilikonlösung getrankt und erneut getrocknet. Die so hergertellten Teststreifen sind völlig hydrophob.
• Sie zeigen gegenüber Harn, @@ut und anderen Lösungen nach den Auftropfen eine gleichgute sehr destliche Farbreaktion an der Grenzfläche zwischen Flüssigkeit und Faser. Die ensthehende Färbung ist von der Glukosemenge abhängig und läßt sich zur halbquantitativen Bestimmung benutzen.
• Teststreifen, die zum Nachweis im Urin benutzt werden, behalten ihre Farbe mindestens 3 Wochen.
• Beispiel 2: Gleichgute Ergebnisse werden mit folgender Imprägnierungsmethode erzielt.
• Glukoseoxydase 100mg Peroxydace 10 mg dest. Wasser 10 ml.
• Die Lösung wird auf Papier aufgetragen und getrocknet.
• Nach dem Trocknen wird das Papier mit einer 10 %igen Methylhydrosilikonlösung getränkt und getrocknet.
• Danach wird das Papier mit einer 1 %igen o-Dianisininlösung in Äthanol getrinkt und erneut getrocknet.
• Beispiel 3: Papier wird mit einer 5 %igen Methylsilikonemulsion getränkt und getrocknet. Das so behandelte Papier wird mit einer Lösung, die in 10 ml Äthanol 50 % Glukoseoxydase 100 mg Peroxydase 100 mg Benzidinhydrochlorid 40 mg enthält, getränkt und erneurt getrocknet. Durch eine @ritte Imprägnierung mit einem geeigneten Expoxydharz wird die Silikonemulsion vernetzt und das Papier dadurch hydrophobiert.
• Beipiel 4: Filterpapier wird mit einer 0,1 %igen Lösung von Phenolphthalein getränkt, getrocknet und anschließend mit einer Phenylmethylsilikonlösung imprägniert. Werden die Streifen in ine alkalische Lösung getaucht oder eine alkalische Lösung aufgetropft, so tritt an der Grenzfläche die bekannte Farbreaktion ein.
• Beispiel 5: Zur Herstellung eines kombinierten Teststreifens werden folgende Lösungen so nebeneinander aufgetragen, daß die Lösungen nicht zusammenlaufen, sondern ein Zwischenraum von 1 - 2 mm verbleibt.
• Lösung 5.1 Glukosenachweis Glukoseoxydase 40 mg Peroxidase 10 mg o-Tolininhydrochlorid 100 mg Äthanol 50 %ig 10 ml Flavazingelb 5 mg Lösung 5.2 pH-Indikator Lackmuslösung 0,1 %ig Lösung 5.3 Peroxydasenachweis llarnstotfperoxyd 100 mg o-Tolidinhydrochlorid 50 mg Äthanol 30%ig 10 ml Die Anordnung ist beliebig.
• Die Lösungen können mit geeigneten Maschinen gleichzeitig oder nacheinander aufgetragen werden.
• Das Trägermaterial wird anschließend getrocknet und danach in eine 5 %ige Methylsilikonlösung getaucht und erneut getrocknet.

Claims (12)

Patentansprüche:

1. Diagnostiziermittel zum Glukosenachweis in @@rperflüssigkeiten, insbesondere Blut, mittels eines Trägers, der ein Enzym, das Oxydaseaktivität für Glukose aufweist und Peroxydase oder anorganische Verbindungen mit Peroxyduse-Wirkung sowie einen goelgreten Ikator enthält, dadurch gekennzeichnetm @@ des Prägermaterial durch siliziumorganische Verbindungen der allgemeinen Formel worin R1 bis R8 Wasserdtoff oder niedere Alrylgruppe en der Kettenläge C1 bis C6 oder Arylgruppen bedeutet, hydrohobiert ist.

2. Diagnostisiermittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die hydrophobierende Substanz eine Lösung der siliziumorganischen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) ist.

3. Diagnostiziermittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die hydrophobierende Substanz eine Emulsion der siliziumorganischen Verbindung der allgemeinen Formel (I) ist.

4. Diagnostiziermittel nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es als Farbindikator Indikatoren enthalt, die mit Wasserstoffperoxyd bei Anweinheit von Peroxydase reagieren.

5. Diagnostiziermittel nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es als Indikatoren o-folidin, o-Dianisinin, Benzidinhydrochlorid, Gu@@a@ol, Leukofarbstoffe, Phenylendiemine enthält.

6. Diagnostiziermittel nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Träger saugfähiges Material wie Papier, Pappe, natürliche oder synthetische Fasern, Gewebe dient.

7. Diagnostiziermittel zur pH-Bestimmun in Flässigkeiten, insbedondere Körperflüssigkeiten, mittels eins Trägers, der mit einem pH-Indikator getränkt ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial mit siliziumorganischen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) hydrophobiert ist.

8. Diagnostiziermittel zur pH- und Glukosebestimmung in Körperflüssigkeiten, insbesondere im Blut sowie Zum Nachweis von Blut in Körperflüssigkeiten, mittels eines Trägers, der nebeneinander mit einem pH-Indikator, einer Fermentindikatorlösung sowie einer Indikatorperoxydlösung getränkt ist dadurch gekennzeichnet, dall die einzelnen REaktionszonen durch Imprägnierung mit Lösungen oder Emulsionen von siliziumorganischen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) fest auf der Faser fixiert sind.

9. Diagnostiziermittel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Indikatorzonen einen Zwischenraum von mindestens 1 bis 2 mm aufweisen.

10. Diagnostiziermittel nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß Vorder- und Rückseite des Trägeramterials zur Bestimmung dienen.

11. Verfahren zur Herstellung von Diagnostiziermitteln entsprechend der Anspruche 1, 2, 4, 5 und 6, dadurch gekennzeiclniet,. daß das Trägermaterial mit der Lösung der Fermente und des Indiirators getränkt, danach getrocknet, wird worauf das Trägermaterial mit einer Lösung der siliziumorganischen verbindungen der allgemeinen Formel (I) getrankt und erneut getrocknet wird.

12. Verfahren zur Herstellung von Diagnostiziermitteln entsprechend der Ansprüche 1, 3, 4, 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial mit einer Emulsion der sillziumorganischen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) getränkt und getrocknet wird, worauf das Trägermaterial mit einer Lösung der Fermente und des Indilrators getränkt und erneut getrocknet wird und anschließend einer dritten Imprägnierung mit einem geeigneten Epoxydharz unterzogen wird.

13, Verfahren zur Herstellung von Diagnostiziermitteln entsprechend der ansprüche 1, 2, 4, 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial mit einer Lösung der Fermente getränkt und getrocknet wird, worauf es mit einer bösung der siliziumorganischen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) getränkt und getrocknet wird und anschließend mit einer Lösung des Indikators behandelt wird.