JPS6035120B2 - 体液中のコレステリン及びコレステリンエステルを検出及び測定するための診断材料 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、コレステＩＪンオキシダーゼを活性化する方
法を実施するための診断材料に関する。

特鹿昭４８−５５１５７号から、コレステリンを水性媒
体中でコレステリンオキシダーゼと共に陣温に保持し、
かつ、酸素消費量又は生成した日２０２又はコレステノ
ンを測定する、コレステリン定量法は公知である。また
、特顔昭５３−１１１７９１号によりコレステリンオキ
シダーゼ及び日２０２測定用の系統又はコレステノン測
定用の系統からなるコレステリン定量用試薬も公知であ
る。ところで、コレステリンオキシダーゼは貯蔵に際し
て安定性が充分でなく、比較的迅速に不活性化されるこ
と、そしてこの不活性化が酸素製造時に使用した表面活
性剤の僅かな量の混入によることが判明した。該製造は
例えば、特願昭４８−５５１５６号に記載の方法によれ
ば、コレステリンを分解する微生物の細胞壁を非イオン
性表面活性剤を含有する緩衝溶液を用いて破壊分解し酵
素を抽出し、抽出物を遠心分離し、沈澱物を除去した後
に陰イオン交換体で処理し、非イオン性表面活性剤を含
有する緩衝液を用いて酵素を溶離し、単離することによ
って行なわれる。その際、残りの痕跡の表面活性剤を除
去することにより貯蔵安定性の極めて高い酵素が得られ
ること、しかしながら、痕跡の表面活性剤を精製除去し
た酵素の活性は著しく低下することが判明した。例えば
、酵素をコレステリン定量用に使用するには、新たに調
製したものを使用するか、又は極めて多量の酵素を使用
するか又は測定時間を著しく延長せねばならなかった。
本発明者らは、コレステリンオキシダ−ゼを活性化する
方法を開発した。

特に、一面では表面活性の痕跡も含有せず、従ってコレ
ステリンオキシダーゼを十分に貯蔵安定ならしめ、他面
では酵素の使用に際し、新しく調製した僅少量の表面活
性剤の除去をまだ行なっていない酵素の清酷こ相応する
酵素活性を獲得することを可能にする方法を開発した。
即ち、コレステリンオキシダーゼを使用する直前に、そ
の水溶液の重量に対し少くとも０．００５％、殊に０．
００５〜０．６％の好脂性及び親水性特性を有する表面
活性化合物少なくとも１種類を添加するによってコレス
テリンオキシダーゼの活性化を達成した。

本発明は、この方法を実施するために適するものであっ
て体液中のコレステリン及びコレステリンェステルの検
出及び定量用診断材料に関する。

コレステリン定量は医学的診断にとって著しく重要であ
る。臨床化学において、実際にいよいよ乳まど精確な結
果は得られないが、定期検査又は集団検査用に迅速かつ
割安な報告を可能にする、体液中の物質の検出用の迅速
テストが最近益々所望されている。

迅速試験に使用される診断材料はすべて反応に必要な試
薬を含有する、吸収性の担体か又は耐水性フィルムであ
る。この診断材料を試験体液と接触させると、呈色反応
が生じるから、これを標準色によるか又は簡単な反射光
度計を用いて測定する。吸収性紙をコレステリンオキシ
ダーゼ、ベルオキシダーゼ、酸化指示薬及び緩衝剤で含
浸することによってコレステリン迅速試験用の材料を製
造する試みは失敗に帰した。得られた試験紙は普通の濃
度のコレステリン含有血清とは反応しないからであった
。今上記のように、坦体に倉浸させるさし「に付加的に
前記表面活性剤を添加するとき、コレステリン含有の血
清と段階的に反応する、使用可能な試験紙又は試験フィ
ルムが得られることが明らかになつた。

それ故、本発明による体液中のコレステリン及びコレス
テリンェステルの検出及び定量用の診断材料は、コレス
テリンオキシダーゼ、比０２検出用の系統、緩衝剤の外
に固体試薬の２〜３０％、有利には１０〜２０％の濃度
で前記表面活性化合物を含浸してなるか、又はこれらを
埋設含有する、担持体又はプラスチックフィルムからな
っている。

日２０２検出用の有利な系統は、ベルオキシダーゼ及び
酸化指示薬からなり、場合によっては膨化剤又は／及び
安定化剤も加えられる。好月旨性及び親水性特性を有す
る、表面活性化合物としては、有利には分子中に少くと
も１個のＯＨ基を含有する非イオン性表面活性剤が使用
される。

特に有利には、アルキル−、アリール−及びアラルキル
アルコールのポリオキシェチレン誘導体を使用する。こ
の種の特に有利な表面活性化合物の例は、ポリオキシェ
チレンーアルキルェーテル、ポリオキシヱチレンーアル
キルカルボン酸エステル、ポリオキシエチレンーソルビ
タンーアルキルカルボン酸ヱステル、ポリオキシェチレ
ンーグリセリンーアルキルカルボン酸ヱステル、ポリオ
キシエチレンーアルキルアミン、ポリオキシェチレンー
ポリオキシプロピレン一塊状重合体、ポリオキシエチレ
ンーアルキルチオエーテル、ポリオキシエチレンーアル
キルアリールエーテルである。詳細な例は、ヒドロキシ
ポリェトキシドデカン、アルキルフェノールのエチレン
オキシ付加生成物、ソルビットアンヒドリドのポリェト
キシェチレン誘導体等である。メルカプタンで変性した
ポリオキシェチレン誘導体もほぼ同じ様に好適である。
これらの化合物のうちで、オキシェチレン基数が相違す
る大抵全てのものは市販されている。

最も使用されるものは、中位の数のオキシェチレン基（
約５〜２０）によって特徴付けられる水溶隆のものであ
る。低級なオキシェチル化タイプは大抵分散することが
できるにすぎず、従って、あまり使用されない。高度に
ェトキシル化された化合物（２５より大）は実際に水潟
性ではあるが、過度に親水性であるので作用が低下する
。ァニオン性湿潤剤のうちで特にガレン酸、例えば、コ
ール酸、タウロコール酸及びデオキシコール酸の塩が好
適であり、更に脂肪酸の塩及び脂肪酸サルコサィドが好
適である。

特に周知の如く、多くの指示薬（ｏートリジン、複素環
式アジン）の有色のラジカル性酸化生成物を安定化する
付加的な特性を有する硫酸誘導体が重要である。これは
例えば、次の群類である：スルホコハク酸ェステル、ア
ルキルアリールスルホネート、アルキルスルフエート、
アルキルポリオキシエチレンスルフ工−ト。腸イオン湿
潤剤のうちで例えば、アルキルピリジニウム−又はアル
キルトリメチルアンモニウム塩が使用可能であるが、複
雑な構造の化合物、例えば、塩化ペンゼトニウムを使用
することもできる。

両性湿潤剤中で、例えば、ィミダゾ１ノウムベタィンが
使用可能である。

詳細な例は、ナトリウムジー（２−エチルヘキシル）−
スルホスクシネート、ナトリウムドデシルスルフェート
、オレイン酸ナトリウム、塩化ペンザルコニウム及び塩
化セチルピリジニウムである。

有利にはこの種のイオン性又は両性表面活性剤を前記し
た非イオン性表面活性剤と粗合せて使用する。

適切な量は、非イオン性表面活性剤の量に左右される。
少くとも１個のＯＨ基を有する非イオン性の表面活性剤
が有利である。

それというのも、該界面活性剤はその他の使用可能な表
面活性物質に比して約５倍ないし１ぴ音強い活性化を生
ぜめ、かつ、反応速度の上昇又は反応時間の短縮が生じ
るからである。該表面活性剤も僅かな量で有効である。
アルキル基とはここでは約２の函までの炭素原子を有す
るようなもの、特には１２〜１８個の炭素原子を有する
ようなものである。痕跡の表面活性剤の存在でのコレス
テリンオキシダーゼの不活性化は、酵素が硫酸アンモニ
ウム溶液中に存在する場合に特に強力に起こる。

次表に１モルの硫酸アンモニウム中、３３ｄｏで種々の
量の表面活性剤の存在下酵素の貯蔵安定性を記載する。
実験はオクチルフヱノールーエチレンオキシド付加生成
物を用いて実施した。コレステリンオキシダーゼの活性
度（新製した酵素に対する％）表面活性剤非イオン性表
面活性のポリオキシェチレン化合物中で、特にポリオキ
シェチレン鎖に対する疎水基の平衡のとれた割合を有し
、かつ、水熔性であるようなものが使用される。

疎水基とポリオキシェチレン鎖との割合の尺度はいわゆ
るＨＬＢ値である〔グリフィン（Ｗ・Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉ
ｎ）署“ジャーナル・オブ・ソシェティ−・オブ・コス
メテツク・ケミスツ”（Ｊ．Ｓｏｃ．Ｃｏｓｍｅｔｉｃ
．Ｃｈｅｍ．）第１巻、３１１頁（１９５Ｍ王）及び同
第５巻、２４９頁（１９５４王）参照〕。

特に、約１０と１７の間のＨＬＢ値を有する表面活性物
質を使用することができる。この値は勿論、作用が疎水
基の特性にも左右されるために、標準値とみなされるに
すぎない。血清中のコレステリンを検出するために、吸
収性紙に試薬を含浸させることによって得られる普通の
試験紙が特に好適である。

しかしながら全血液中のコレステリンを検出する場合に
は、有利には試験紙を西ドイツ特許公開公報第１５９８
０４８号に記載のようにして疎水化するか、又はセルロ
ースェステル等からなる半透明膜で被覆すべきである。
しかしながら全血液中での検出用に西ドイツ特許第１５
９８１５３号明細書により得られるような試験フィルム
が等に有利である。該フィルムを製造するために、試薬
、例えばコレステリンオキシダーゼ、ベルオキシダーゼ
、緩衝剤、指示薬及び場合によっては膨化剤を本発明に
より使用される表面活性物質と一緒にフィルム形成性ポ
リマーの水性分散液中に混入する。

該分散液を薄いフィルムに塗布し、かつ、乾燥させる。
コレステリン含有血液をこの種の試薬フィルムに通加し
、かつ、約１分後に拭き取ると、色調濃度がコレステリ
ン量に相応する呈色が得られる。該呈色は特に簡単な反
射光度計を用いて定量的に評価するために好適である。
本発明による診断材料は、遊離コレステリンの検出及び
定量に好適である。

これに対して、コレステリンェステルが存在する場合に
は、該ェステルから先ずコレステリンを遊離させるべき
である。このことは、常法で例えば水性アルカリを用い
て酸化することによって実施することができる。しかし
ながら、コレステリンエステラーゼ（有利には微生物か
ら単離した）を用いるェステル分解が特に有利である。
それというのもその際非常に好適な条件下に操作するこ
とができるからである。コレステリンェステラーゼを体
液に添加し、かつ、一定時間恒塩に保持することができ
る。

該方法は例えば、体液を西ドイツ特許第２２４０６７２
号もこ対応する特顔昭４９−３９１２８号明細書と同様
に内壁にコレステリンヱステラーゼ及び場合によっては
肋剤を装入した毛細管中に吸収して実施することができ
る。毛細管中で陣温に保持した後に体液を次ぎに前記し
たようにして試験条片上に施こす。体液中に先ず遊離コ
レステリン及びェステル化されたコレステリンが同時に
存在する場合には、当然これらの合計が検出される。し
かしながら、特に有利にはコレステリンェステラーゼを
試験条片中に一緒に混入し、従って、単一工程で遊離コ
レステリン及びヱステル化されたコレステリンの合計を
検出するか又は測定することができるようにすることも
できる。コレステリンの酸化で生じた過酸化水素を検出
するために好適な系統、有利にはベルオキシダーゼ、緩
衝剤、酸化指示薬及び場合によっては膨化剤等が例えば
、グルコース用迅速試験の記載から公知である。

これらの有利な系統の使用可能な成分の例は、次のとお
りである：ベルオキシダーゼの中で、特にオランダガラ
シ（Ｍｅｅｒｒｅｔｔｉｃｈ）からのものが適当である
が、ラクトベルオキシダーゼ等も使用可能である。

緩衝剤としては慣用のもの、例えば、燐酸塩−、クエン
酸塩−又は柵酸塩緩衝剤が挙げられる。

診断材料で調製されるｐＨ値は、４と９の間、有利には
５と８の間であるべきである。酸化指示薬としては、種
々の群類の化合物、すなわちベンチジン誘導体、例えば
西ドイツ特許出願公告第１５９８１３３号によるｏ−ト
リジン、ｏ−バニリン誘導体又は西ドイツ特許出願公告
第１６４８８４ぴ号‘こよる複素環式アジンが挙げられ
る。

診断材料、特に試験フィルム用の処方になお慣用の膨化
剤、例えば、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチル
セルロース等、更に酵素用の安定化剤、例えば、ジチオ
ェリスリットを添加することもできる。試験フィルム用
の基材は、例えば、ポリプロピオン酸ビニル又はボリ酢
酸ビニルからなるプラスチック・分散液である。

該基材にすべての試薬を、有利には溶かした形で混入し
、混合物を薄いフィルムに塗布し、かつ、乾燥させる。
試験紙は、試薬を水又は水と有機溶剤からなる混合物に
溶かし、ろ紙に溶液を合浸し、かつ乾燥させる。

しかしながら、先ず水溶性試薬を前以つて合浸し、かつ
次いで例えば、有機溶液からなる指示薬で後含濠するこ
ともできる。次に、実施例につき本発明を詳説する。

例１ ろ紙〔シュラィヒャー・ウント・シュル （Ｓｃｈｌｅｉｅｃｈｅｒ皿ｄＳｅｈ山Ｔ）５９７ＮＦ
１ｎｄ．〕を下記組成の溶液で浸潰し、かつ、４０つ
０で乾燥させる：１モルのクエン酸塩緩衝剤ＰＨ５．２
５ ２０のＺ
コレステリンオキシダーゼ（６の単位／の９）○‐１夕
ベルオキシダーゼ（７山単位／の９） ０．０５タ
蒸留水 全量１００私該紙を
、その他に次の表面活性物質１夕を各々含有する、塩化
メチレン１００必中のｏートリジン０．２夕の溶液で含
浸する：‘ａ｝ポリオキシェチレントリブチルフエノー
ルエーテル、【ｂ｝ポリオキシエチレンソルビタンモノ
ラウレート、（ｃ｝ポリオキシエチレンノニルフエノー
ルエ−テル、（ｄ）ポリオキシエチレンラウリルエーテ
ル、（ｅ）ポリオキシエチレンセチルエーナル、（ｆ’
ポリオキシエチレンステアレート、（ｇ）ポリオキシエ
チレンドデシルチオエーテル。

乾燥後、コレステリン含有の血清と緑色の色調を呈して
反応する、試験紙が得られる。

血清が同時にコレステリンェステルを含有する場合には
、血清に数分前にコレステリンヱステラーゼ溶液１滴を
加える場合に強い緑色色調が得られる。前記表面活性物
質を全く含有しない試験紙は、上述の血清とは反応しな
い。例２ ろ紙〔シュライヒャー・ウント・シュル５９７ＮＦ１ｎ
ｄ．〕を下記組成の溶液で浸潰し、かつ、４０ｑｏで乾
燥させる：１モルのクエン酸塩緩衝剤ｐＨ７
２０の上コレステリンオキシダーゼ（６山単位／双９）
○‐１夕コレステリンェステラーゼ（１８単位／の９）
０．２５夕ベルオキシダーゼ（７山単位／柵） ０
．０５汐蒸留水 １００
地該紙をその他になお、次の表面活性物質０．５夕を含
有する、塩化メチレン１００の（中のｏ−トリジン０．
２夕の溶液で含浸する：‘ａ｝ポリオキシェチレンココ
エート、｛ｂ）ポリオキシエチレンオレート、‘ｃ）ポ
リオキシエチレンポリプロピレングリコール、（ｄ｝ポ
リオキシエチレンステアリルアミン、｛ｅ｝ポリオキシ
エチレングリセリンモノラウレート。

乾燥後、コレステリン及びノ又はコレステリソェステル
を含有するような血清と反応して、緑色を呈する試験紙
が得られる。表面活性剤なしの試験紙は反応しない。等
量のｐＨ５．２５又はｐＨ６のクエン酸塩緩衝剤を含有
する試験紙も実際に同様に作用する。

例３ 例１により前舎浸した紙を、下記表面活性物質を１．５
夕の濃度で含有する、アセトン１００必中のｏ−トリジ
ン０．３夕の溶液で後含浸する：｛ａ｝ジオクチルナト
リウムスルホスクシネート、（ｂ’ドデシルベンゾール
スルホン酸、ナトリウム塩、‘ｃ〕ラウリルポリグリコ
ールエーテルスルフエート、ナトリウム塩、｛ｄサトリ
ウムラウリルサルコシネート、（ｃ〕ナトリウムラウレ
ート、‘０コール酸、（ｇ）デソキシコール酸、（ｈ）
ナトリウムタウロコレート。

該試験紙は、実際に例１による試験紙と同じ特性を有す
るが、反応色調は長時間安定である。

ｐＨ７の燐酸塩緩衝液を有する相応する試験紙は、同様
の特性を有する。例４例２により前含浸した紙を、ｏ−
トリジン０．４夕及び下記表面活性物質各０．５夕を含
有する溶液で含浸する：‘ａ｝ラウリルピリジニウムク
ロリド、【ｂ’塩化ペンゼトニウム、【ｃ｝セチルトリ
メチルアンモニウムクロリド、‘ｄ｝１ーヒドロキシエ
チルー１ーカルボキシメチルー２−アルキルイミダゾリ
ニウムーベタイン。

該試験紙の特性も例２の試験紙の特性に相応する。

例５ ろ紙（シュライヒヤー・ウント・シュル５９７ＮＦ１ｎ
ｄ．）を下記組成の溶液で合浸し、かつ、４０ｑｏで乾
燥させる：１モルの燐酸塩緩衝剤ｐＨ６
２５の【コレステリンオキシダーゼ（６山単位／の９）
○‐１夕ベルオキシダーゼ（７の単位／凧９） ０
．０５タコール酸 １．０夕
アセトン １０叫蒸
留水 全量１００の‘該紙を
アセトン１００地中の酸化指示薬の溶液で後含浸する。

指示薬の量、化学構造及びコレステリン含有血清との呈
色反応を第１表にまとめる。

第１表 例６ 下記成分からなる混合物を調製する： ポリビニルプロピオネート分散液 ４５タアルギ
ン酸ナトＩＪゥム、０．５モルの燐酸塩緩衝剤中１．８
５％、ＦＨ５．５ ３５タコレス
テリンオキシダーゼ（６山単位／の９）０．５夕ベルオ
キシダーゼ（７０単位／爪９） ０．２５タジオク
チルナトリウムスルホスクシネート１タアセトン６の‘
に溶かしたｏートリジン ０．６タ水
５０ｍ‘該混合物を湿潤フィルム
厚約３０仇仇のフィルムに伸ばすか、又は固体担持体上
に塗布し、かつ、３５００で乾燥させる。

コレステリンを含有する血液をフィルム上に滴加し、か
つ、血液を１分後に拭きとると、コレステリン濃度に応
じて種々の強度の緑色呈色が得られる。前記処方物にな
お、コレステリンェステラーゼ１．０夕を添加すると、
高められた含量のコレステリンェステルを測定すること
もできるフィルムが得られる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ コレステリンをコレステリンオキシダーゼの存在で
   酸素を用いて酸化してコレステノン及び過酸化水素にし
   、かつ、過酸化水素を酸化指示薬のペルオキシダーゼ−
   接触酸化によつて検出することによつて、体液中のコレ
   ステリン及びコレステリンエステルを検出及び測定する
   ための診断材料において、該診断材料が、コレステリン
   オキシダーゼ、Ｈ＿２Ｏ＿２検出用の系統、緩衝剤の外
   に好脂性及び親水性特性を有する表面活性化合物の少な
   くとも１種類を２〜３０重量％の濃度で含浸又は埋設し
   た吸収性担持体又はプラスチツクフイルムよりなつてい
   ることを特徴とする、体液中のコレステリン及びコレス
   テリンエステルを検出及び測定するための乾式診断材料
   。