DE1813848C3 - Diagnostisches Mittel und Verfahren zur Bestimmung von Glucose in hämolysiertem Blut - Google Patents
Diagnostisches Mittel und Verfahren zur Bestimmung von Glucose in hämolysiertem BlutInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stabilisierung der Glucosekonzentration in Proben
von hämolysiertem Blut sowie ein diagnostisches Mittel
zur photometrischen Glucosebestimmung in hämolysierten Blutproben, enthaltend Hexokinase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase
und einen Stabilisator.
Die quantitative Bestimmung von Bestandteilen oder Inhaltsstoffen des Blutes, insbesondere von Glucose,
hat für die medizinische Diagnostik in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen.
Es ist zwar bekannt, daß die Glucose-Konzentration von hämolysierten Blutproben photometrisch auch
ohne Abtrennung des Serums oder Entfernung der Eiweißstoffe nach der Hexokinase/Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase-Methode
bestimmt werden kann (vgl. Klin. Wochenschrift, Bd. 46, Heft 14, S. 789 bis 790),
jedoch besitzt dieses Verfahren den Nachteil, daß die fcei der Hämolyse freiwerdenden Erythrozyten-Enzyme
den schnellen Abbau der Glucose bewirken, so daß die Glucosebestimmung Insbesondere bei der Untersuchung
von menschlichem Blut möglichst unmittelbar mach der Hämolyse durchgeführt werden muß.
Die Ausführung der photometrischen Bestimmung unmittelbar nach der Hämolyse, welche kurz nach der
Blutentnahme erfolgen soll, ist aber insbesondere bei Serienbestimmungen selten möglich oder mit großen
Schwierigkeiten verbunden, Da einerseits durch die in den Erythrozyten enthaltenen Enzyme Glucose
abgebaut wird, zum zweiten aber das bei der Bestimmung entstehende 6-Phosphoglukonat mittels eines
Erythrozyten-Enzyms weiter abgebaut wird, wodurch ein sekundärer »Schleich« entsteht, kommt es 7u
Fehlresultaten, die nur sehr umständlich korrigiert werden können. Es fehlte somit eine Möglichkeit,
iiowohl den Abbau der GIik
>se als auch die unerwünschte Sekundärreaktion zu hemmen.
Versuche, die sekundären Enzymreaktionen durch Zugabe von allgemein bekannten Enzymhemmern,
wie z. B. Jodessigsäure oder Natriumfluorid zu unterdrücken,
schlugen fehi, da in den zur ausreichenden Stabilisierung notwendigen Konzentrationen auch die
Enzymreaktionen des eigentlichen Nachweises gehemmt und somit keine reproduzierbaren Ergebnisse
erzielt wurden.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß
ίο Maleinimid und N-Alkyl-maleinimide bereits in geringer
Konzentration die störenden sekundären Reaktionen der menschlichen Erythrozyten-Enzyme vollständig
blockieren, ohne die enzymatische Aktivität der aus Hefezellen gewonnenen und zum Nachweis der
Glucose verwendeten Enzyme Hexokinase und GIucose-6-phosphat-Dehydrogenase
zu beeinträchtigen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Stabilisierung der Glucose-Konzentration in Proben von hämolysiertem
Blut ist demnach dadurch gekennzeichnet, daß
ao man als Stabilisator Maleinimid oder N-Alkylmaleinimide
zusetzt. Besonders bewährt hat sich N-Äthyl-maleinimid.
Es war bisher nicht bekannt und ist besonders überraschend, daß Maleinimide in der Lage sind, aus
»5 dem Blut stammende bzw. aus Erythrozyten freigesetzte
Enzyme, insbesondere Hexokinase und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, vollständig zu inaktivieren,
ohne daß die entsprechenden aus Hefezellen gewonnenen Enzyme, welche später ais Reagenzien für
die Nachweisreaktion zugesetzt werden, einen Aktivitätsverlust erleiden. Dieser Befund gestattet in einfacher
Weise die Stabilisierung hämolysierter Blutproben durch die Inaktivierung der die Glucose
abbauenden Erythrozyten-Enzyme.
Der Glucosegehalt von hämolysierten und erfindungsgemäß stabilisierten Blutproben ist nach einem
Zeitraum von 14 Tagen noch unverändert, so daß quantitative Bestimmungen mit großer methodischer
Genauigkeit auch noch lange Zeit nach der Blutentnähme
bzw. Hämolyse durchgeführt werden können. Das diagnostische Mittel der eingangs genannten
Art ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß als Stabilisator Maleinimid oder N-alkylierte Maleinimide
enthalten sind. In bevorzugter Ausführungsform
enthält es N-Äthyl-maleinimid.
Das folgende Beispiel dient zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens und des diagnostischen
Mittels.
100 μΐ Blut werden unmittelbar nach der Entnahme
mittels 10 ml einer auf pH 6,8 gepufferten 10 mg-%igen wäßrigen Lösung von N-Äthyl-maleinimid
hämolysiert. Im Abstand von je 24 h werden 0,5 ml des Hämolysats in eine Küvette pipettiert und nacheinander
mit 1,5 ml der weiter unten beschriebenen »Gebrauchslösung« und 0,01 ml der »Enzymlösung«
von Hexokinase und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase versetzt. Die Extinktion wird sofort und 3 min
nach Zugabe der Reagenzien bei einer Wellenlänge von 366 nm gemessen.
Berechnung:
Δ.Ε- 109,6 = μ^ Glucose
(1 cm-Normalküvette)
(1 cm-Normalküvette)
Der Glucosegehalt bleibt über einen Zeitraum von 2 Wochen innerhalb der methodischen Fehlergrenzen
konstant.
Entsprechende Ergebnisse mit 100 mg-%iger Jodessigsäure
sowie mit Natriumfluoiid in Konzentrationen
von 30 und 1000 mg-% zeigen eine wesentlich schlechtere Konstanz und sind in der Tabelle
zusammengefaßt.
Die oben erwähnten Lösungen werden wie folgt hergestellt:
A. »Gebrauchslösung«
I. 55,7 g Triäthanolamin-Hydrochlorid werden in
wenig Wasser gelöst und mittels 20 g Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan auf pH 7,8 eingestellt.
Zu dieser Lösung gibt man 480 mg Magnesiumsulfat und füllt mit Wasser auf 1000 ml auf.
II. 100 mg NADP werden in 10 ml der gemäß I hergestellten Triäthanolamin-Lösung gelöst
III. 100 mg ATP in Form des hydratisieren Dinatriumsalzes
werden in 10 ml der gemäß 1 hergestellten Triäthanolamin-Lösung gelöst.
Zur Herstellung der gebrauchsfertigen Lösung
Zur Herstellung der gebrauchsfertigen Lösung
mischt man die Lösungen Il und III und verdünnt mit 500 ml der Lösung I.
B. »Enzymlösung«
Hexokinase mit einer Mindestaktivität von 140 U/mg wird mit 3-molarer Ammoniumsulfatlösung so verdünnt,
daß die Endkonzentration 10 μg,/0,01 ml beträgt.
Anschließend wird mit 3,3-molarei- Ammoniumsulfatlösung
eine Lösung von Glucose-6-phosphai-Dehydrogenase mit einer Mindestaktivität von 140 U/mg auf
die gleiche Konzentration gebracht. Für die Bestimmung werden beide Enzymlösungen im Verhältnis 1 : 1
gemischt.
Stabilisator
Glucosegehalt in % des Ausgangswerts nach X Tagen 0 1 2 3 6 7 8
10
13
| Jodessigsäure 100 mg-% | 100 | 100 | 96 | 67 | 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Natriumfluorid 30 mg-% | 100 | 92 | 64 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Natriumfluorid 1000 mg-% | 100 | 101 | 102 | 100 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| N-Äthy!-maleinimid 10 mg-% | 100 | 100 | 98 | 101 | 98 | 101 | 99 | 102 | 96 | 98 |
Claims (6)
1. Verfahren zur Stabilisierung derGlucosekonzentration
in Proben von hämolysiertem Blut, dadurch gekennzeichnet, daß man
als Stabilisator Maleinimid oder N-Alkylmaleinimide
zugibt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Stabilisator N-Äthyl-maleinimid
verwendet wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das N-Äthyl-maleinimid in
10 mg-%iger wäßriger Lösung zugegeben wird.
4. Diagnostisches Mittel zur photometrischen Glucosebestimmung in hämolysierten Blutproben,
enthaltend Hexokinase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase und einen Stabilisator, dadurch
gekennzeichnet, daß als Stabilisator Maleinimid oder N-Alkylmaleinimide enthalten sind.
5. Diagnostisches Mittel gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Stabilisator N-Äthyl-maleinimid
verwendet wird.
6. Diagnostisches Mittel gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das N-Äthyl-rnaleinimid
in 10 mg-%iger wäßriger Lösung vorliegt.
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| Publication Number | Publication Date |
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