DE3900755C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Analy­ se von Chloridionen auf enzymatischer Basis und eine Test­ packung zur Durchführung des Verfahrens. Insbesondere be­ trifft die Erfindung ein Verfahren zur quantitativen Analyse von Chloridionen in einer biologischen Probe ohne unerwünsch­ te störende Einflüsse von anderen Ionen in der Probe sowie eine Testpackung zur Durchführung dieses Verfahrens.

Derzeit werden zur quantitativen Analyse von Chloridionen in biologischen Proben, z. B. Blutserum, Urin, zerebrospinaler Flüssigkeit und dgl., coulometrische Titrationsverfahren und Elektrodenverfahren angewandt. Jedoch sind coulometrische Titrationsverfahren in automatischen biochemischen Analyse­ vorrichtungen nicht leicht durchzuführen. Das Elektrodenver­ fahren bringt Schwierigkeiten in bezug auf die Ionenspezifi­ tät mit sich.

Eine weitere Gruppe von analytischen Verfahren sind die enzymatischen Verfahren. Ein derartiges enzymatisches Verfah­ ren ist beispielsweise in Eur. J. Biochem., Bd. 41 (1974), S. 171-180 offenbart. Es beruht auf der Erscheinung, daß Chloridionen eine Veränderung der Affinität zwischen Säuge­ tier-Amylasen und Calciumionen bewirken. Das Prinzip der Mes­ sung von Chloridionen nach dem enzymatischen Verfahren ist nachstehend dargestellt.

Wenn eine von einem Schwein abgeleitete pankreatische α-Amy­ lase zusammen mit einem Calcium-Chelatbildner, wie Ethylen­ diamintetraessigsäure (EDTA), in Abwesenheit von Chloridionen vorliegt, setzt die pankreatische α-Amylase ihre intramoleku­ laren Calciumionen frei, so daß die α-Amylase in eine inakti­ ve α-Amylase übergeführt wird. Der Ausdruck "Calcium-Chelat­ bildner bedeutet ein komplexbildendes Reagens, das mit Calciumionen unter Bildung einer Komplexverbindung reagieren kann. Wird das die inaktive α-Amylase enthaltende Gemisch mit einer biologischen Probe, wie Blutserum, vermischt, so rea­ giert die inaktive α-Amylase mit den Calciumionen, so daß die inaktive α-Amylase in die aktive Form umgewandelt wird, wobei die Geschwindigkeit der α-Amylase-Umwandlungsreaktion von der Konzentration der Chloridionen in der biologischen Probe abhängt. Die Menge der umgewandelten aktiven α-Amylase kann durch Verwendung eines Reagens zur Bestimmung der α-Amylaseaktivität ermittelt werden. Die Konzentration an Chloridionen läßt sich aus der gemessenen Menge der umgewan­ delten aktiven α-Amylase berechnen.

Das enzymatische Verfahren weist eine höhere Ionenspezifität als das Elektrodenverfahren auf. Ferner läßt sich das enzy­ matische Verfahren in einer automatischen biochemischen Ana­ lysenvorrichtung durchführen. Die Ionenspezifität des enzyma­ tischen Verfahrens ist in Tabelle I auf der Grundlage, daß die Empfindlichkeit im Bezug auf Chloridionen als 100% angesetzt wird, zusammen mit der Ionenspezifität für das Elektrodenver­ fahren angegeben.

Tabelle I

Aus Tabelle I ist ersichtlich, daß das enzymatische Verfahren in bezug auf die Ionenspezifität dem Elektrodenverfahren über­ legen ist.

Aus der EP-A-02 75 398, die Stand der Technik gemäß § 3 (2) PatG darstellt, ist ein Reagens für die Bestimmung von Chloridionen bekannt, das eine mit Calciumionen komplexbildende Komponente, eine inaktive Amylase, eine Calciumionen enthaltende Komplexverbindung und ein Reagens zur Bestimmung der Amylaseaktivität enthält.

Jedoch fehlt beim vorerwähnten herkömmlichen enzymatischen Verfahren eine Maßnahme zur Ausschaltung von schädlichen Ein­ flüssen von Nitrit- und Nitrationen in einer Probe, so daß bei diesem Verfahren Schwierigkeiten mit der Selektivität auftre­ ten. Im Rahmen der Untersuchungen, die zur vorliegenden Er­ findung führten, wurde festgestellt, daß beim Vorliegen von Nitrit- und Nitrationen eine Abnahme der Ionenspezifität gege­ ben ist. Wie in Tabelle I gezeigt, beträgt der Wert bei Nitritionen 10,3% und bei Nitrationen 9,8%. Wie bereits er­ wähnt, sind beim herkömmlichen enzymatischen Verfahren keine geeigneten Maßnahmen vorgesehen, um den nachteiligen Einfluß dieser Ionen auszuschalten.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein neues Verfahren zur quanti­ tativen Analyse von Chloridionen bereitzustellen, bei dem der schädliche Einfluß von Nitrationen und/oder Nitritionen ver­ mieden wird und die Ionenspezifität und die Genauigkeit der Messung von Chloridionen in der Probe erhöht wird. Ferner soll erfindungsgemäß eine Testpackung zur Durchführung dieses Verfahrens bereitgestellt werden.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Chloridionen gemäß Patentanspruch 1.

Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Testpackung zur quantitativen Bestim­ mung von Chloridionen gemäß Patentanspruch 7.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den jeweiligen Unter­ ansprüchen 2 bis 6 und 8 bis 14.

Nachstehend wird die Erfindung anhand der Zeichnung näher er­ läutert. Es zeigen:

Fig. 1 ein Fließdiagramm einer Ausführungsform des erfin­ dungsgemäßen quantitativen Verfahrens, wobei eine automatische Analysenvorrichtung verwendet wird;

Fig. 2 ein Diagramm zur Erläuterung des Einflusses von Nitrationen auf die Bestimmung von Chloridionen; und

Fig. 3 ein Diagramm zur Erläuterung des Einflusses von Nitritionen auf die Bestimmung von Chloridionen.

Beim erfindungsgemäßen quantitativen Verfahren gibt es keine speziellen Beschränkungen in bezug auf die zu bestimmenden Proben. Beispiele für entsprechende Proben sind biologische Proben mit einem Gehalt an Chloridionen, einschließlich Blut­ serum, Urin, zerebrospinale Flüssigkeit und dgl.

Als Reagentien zur Zersetzung von Nitritionen werden erfin­ dungsgemäß vorzugsweise Reagentien mit einem Gehalt an einer Nitrit-reduktase verwendet. Als Reagentien zur Zersetzung von Nitrat- und Nitritionen werden vorzugsweise Reagentien ver­ wendet, die sowohl eine Nitrat-reduktase als auch eine Nitrit­ reduktase enthalten. Ferner können auch andere zersetzende Materialien, unter Einschluß von anorganischen und organi­ schen Materialien verwendet werden. Es ist vorteilhaft, die Nitrit- und Nitrationen in der Probe unter Verwendung von Enzymen, wie Nitrat-reduktasen und Nitrit-reduktasen, zu zer­ setzen, da eine enzymatische Reaktion, die eine Substratspezi­ fität besitzt, die gewünschten Ionen ohne einen unerwünsch­ ten Einfluß auf andere Ionen zersetzen kann.

Reaktionen von Nitrit-reduktasen mit salpetriger Säure sind nachstehend angegeben:

Dabei bedeutet der Ausdruck "NADPH" reduziertes Nicotinamidadenin-dinucleotid-phosphat und der Ausdruck "NADP⁺" Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat. Der Ausdruck "NADH" bedeutet reduziertes Nicotinamid-adenin-dinucleotid. Der Ausdruck "NAD⁺" bedeutet Nicotinamid-adenin-dinucleotid.

Wie aus den vorstehenden Reaktionsgleichungen hervorgeht, enthält das erfindungsgemäß verwendete Reagens mit einem Gehalt an Nitrit-reduktase üblicherweise zusätzlich ein Coenzym, wie NADH, NADPH, reduziertes Cytochrom C oder dgl. Enzymatische Reaktionen zwischen Nitrat-reduktasen und Salpetersäure sind nachstehend angegeben.

Wie aus den vorstehenden Reaktionsgleichungen hervorgeht, werden Nitrationen durch Nitrat-reduktasen in Nitritionen übergeführt. Daher ist es möglich, gleichzeitig die in einer Probe enthaltenen Nitrat- und Nitritionen unter Verwendung eines Reagens, das sowohl eine Nitrat-reduktase als auch eine Nitrit-reduktase enthält, zu zersetzen. Wie durch die vorstehenden Reaktionsgleichungen erläutert, wirkt eine Nitrat-reduktase zusammen mit einem Coenzym, wie NADH und NADPH, wie im Falle einer Nitrit-reduktase. Demgemäß ist es empfehlenswert, ein Reagens zu verwenden, das eine Nitrat-reduktase und eine Nitrit-reduktase und zusätzlich ein Coenzym, wie NADH und NADPH, enthält.

Bei Behandlung einer Probe mit einem der vorstehend erwähnten Reagentien ist es empfehlenswert, die Probe mit den Reagentien zu vermischen und zu rühren.

Erfindungsgemäß werden Calcium-Chelatbildner verwendet, d. h. komplexbildende Reagentien, die mit Calciumionen unter Bildung von Komplexverbindungen reagieren können. Beispiele für Calcium-Chelatbildner sind Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), trans-1,2-Cyclohexandiamin-N,N,N,N′-tetraessigsäure, Glykoletherdiamin-tetraessigsäure, Iminotetraessigsäure, Diaminopropantetraessigsäure und dgl.

Als inaktive Amylase wird erfindungsgemäß vorzugsweise eine inaktive Amylase verwendet, die durch ein Verfahren erhalten worden ist, bei dem eine native α- oder β-Amylase, z.B. eine aus Schweinepankreas erhaltene Amylase, insbesondere native α-Amylase, mit einem komplexbildenden Mittel (z. B. EDTA), das mit Calciumionen unter Bildung einer vorstehend erwähnten Komplexverbindung reagieren kann, erhalten worden ist. Durch diese Behandlung setzt die native aktive Amylase die enthaltenen Calciumionen frei, so daß die aktive Amylase in eine inaktive Form übergeführt wird.

Als Calciumionen enthaltende Komplexverbindungen, die erfindungsgemäß einzusetzen sind, wird vorzugsweise ein Calciumsalz von Ethylendiamintetraessigsäure (Ca-EDTA) oder dgl. verwendet, das beispielsweise aus einem Calcium-Chelatbildner und Calciumionen gebildet worden ist.

Nachdem eine Probe mit dem vorerwähnten Reagens zur Zersetzung von Nitritionen oder dgl. behandelt worden ist, wird sie mit der inaktiven Amylase, der Calciumionen enthaltenden Komplexverbindung und dem Calcium-Chelatbildner vermischt. Während dieses Vorgangs nimmt die inaktive Amylase unter Einwirkung der in der Probe enthaltenen Chloridionen Calciumionen aus der Calciumionen enthaltenden Komplexverbindung auf, so daß die inaktive Amylase in die aktive Form übergeführt wird. Es wird empfohlen, die Calciumionen enthaltende Komplexverbin­ dung in einem Überschuß in bezug zur Menge der inaktiven Amy­ lase einzusetzen. Vorzugsweise werden etwa 1 Millimol der Calciumionen enthaltenden Komplexverbindung pro 16 000 bis 20 000 Einheiten der inaktiven Amylase eingesetzt. Durch Ver­ wendung eines derartigen Überschusses der Komplexverbindung ist es möglich, eine gute Proportionalität zwischen der Menge der in der Probe enthaltenen Chloridionen und der Menge der gebildeten aktiven Amylase zu erzielen, so daß die in der Probe enthaltene Amylase mit hoher Genauigkeit bestimmt werden kann.

Wird die Probe mit der inaktiven Amylase, der Calciumionen enthaltenden Komplexverbindung und dem Calcium-Chelatbildner vermischt, ist es möglich, gleichzeitig in der Probe Nitrit- und Nitrationen zu zersetzen, indem man dem System ein Reagens zur Zersetzung von Nitrat- und Nitritionen zusetzt.

Nach Bildung der aktiven Amylase aus der inaktiven Form läßt sich die Menge dieser aktiven Amylase unter Verwendung eines Reagens zur Bestimmung der Amylaseaktivität ermitteln. An­ schließend kann daraus die Menge der in der Probe enthaltenen Chloridionen berechnet werden. In der Praxis wird ein vorhe­ riger Test durchgeführt, bei dem eine Standardprobe mit einer bekannten Konzentration an Chloridionen den vorerwähnten Schritten unterzogen wird, um eine Eichkurve zu erstellen, aus der die Beziehung zwischen der Amylaseaktivität und der Konzen­ tration an Chloridionen hervorgeht. Die Menge der Chlorid­ ionen in der Probe läßt sich quantitativ aus dieser Eichkurve ermitteln.

Als Reagens zur Bestimmung der Amylaseaktivität können erfin­ dungsgemäß beliebige herkömmliche Reagentien eingesetzt wer­ den. Beispielsweise können 4-Nitrophenyl-α-D-maltopentaosid, 2-Chlor-4-nitrophenyl-β-D-maltopentaosid, 2-Chlor-4-nitrophe­ nyl-β-D-maltoheptaosid oder dgl. verwendet werden. Diese Reagentien werden im allgemeinen zusammen mit α-Glucosida­ se und β-Glucosidase eingesetzt.

Wie aus der vorstehenden Beschreibung hervorgeht, läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren zur quantitativen Analyse von Chloridionen vorteilhafterweise unter Verwendung einer Test­ packung durchführen, die folgende Bestandteile enthält:

• (a) ein Reagens zur Zersetzung von Nitritionen oder ein Reagens zur Zersetzung von Nitrat- und Nitritionen;
• (b) eine inaktive Amylase;
• (c) eine Calciumionen enthaltende Komplexverbindung;
• (d) ein Calcium-Chelatbildner; und
• (e) ein Reagens zur Bestimmung der Amylaseaktivität.

Die Reagentien (a), (b), (c) und (d) können zu einem ersten Reagens vereinigt werden. In diesem Fall besteht die Test­ packung aus einem derartigen ersten Reagens und einem zwei­ ten Reagens, das das Reagens (e) enthält. Das zweite Reagens kann ferner die Calciumionen enthaltende Komplexverbindung und den Calcium-Chelatbildner enthalten.

Nachstehend folgt eine ausführliche Erläuterung einer bevor­ zugten Ausführungsform der Erfindung.

Gemäß dieser Ausführungsform werden eine Nitrat-reduktase, eine Nitrit-reduktase und NADH verwendet, um Nitrat- und Nitritionen, die die quantitative Bestimmung von Chlorid­ ionen stören können, zu zersetzen. Ferner werden α-Glucosida­ se, β-Glucosidase und 2-Chlor-4-nitrophenyl-β-D-maltohepta­ osid als Reagentien zur Bestimmung der α-Amylase eingesetzt. Die bei dieser Ausführungsform verwendete Testpackung besteht aus einem ersten Reagens und dem vorerwähnten Reagens.

(1) Erstes Reagens

Das erste Reagens wird auf die nachstehend beschriebene Weise hergestellt.

115 mg Calcium-äthylendiamintetraacetat (Calciumionen enthal­ tende Komplexverbindung) und 1,1 g Dinatrium-äthylendiamin­ tetraacetat (Calcium-Chelatbildner) werden zu 100 ml einer 0,1 m Phosphatpufferlösung gegeben. Das erhaltene Gemisch wird durch Zugabe einer 5%igen wäßrigen Natriumhydroxidlö­ sung auf den pH-Wert 7,0 eingestellt. Diese Lösung wird als "Lösung A" bezeichnet. Anschließend wird die Lösung A mit 11 KU α-Glucosidase, 300 U β-Glucosidase, 2 KU inaktiver α-Amylase, die durch Dialyse von α-Amylase aus Schweine­ pankreas gegen eine EDTA enthaltende Phosphatpufferlösung er­ halten worden ist, 200 U Nitrat-reduktase, 200 U Nitrit-reduk­ tase und 0,8 mM NADH vermischt. Man erhält das erste Reagens.

(2) Zweites Reagens

Das zweite Reagens wird auf die nachstehend beschriebene Weise hergestellt.

1,0 g 2-Chlor-4-nitrophenyl-β-D-maltoheptaosid wird in 100 ml der vorerwähnten Lösung A gelöst. Man erhält das zweite Reagens.

(3) Eichung

Wäßrige Natriumchloridlösungen der Konzentrationen 0, 40, 80, 120, 160 bzw. 200 millimolar werden als Standardproben her­ gestellt. Jeweils 6 µl der Standardproben werden mit 320 µl des ersten Reagens und 80 µl des zweiten Reagens vermischt. Die Absorption dieser Proben wird unter Verwendung einer automati­ schen Analysenvorrichtung (HITACHI, Modell 7150) bei 37°C und einer Hauptwellenlänge von 405 nm und einer Nebenwellenlänge von 480 nm gemessen. Man erhält eine Eichkurve.

Die Absorption nimmt in Abhängigkeit von der Konzentration an Chloridionen im Lauf der Zeit zu.

Fig. 1 erläutert den Betrieb der automatischen Analysenvor­ richtung. Die Bestimmung der Chloridionen erfolgt in der in Fig. 1 erläuterten Art und Weise.

Wie in Fig. 1 gezeigt, wird die Probe mit dem ersten Reagens vermischt und zur Durchführung einer Reaktion mehrere Minuten gerührt. Anschließend wird das zweite Reagens zu der Probe gegeben, wonach unter Rühren eine weitere Reaktion durchge­ führt wird. Vom Zeitpunkt der Zugabe des zweiten Reagens bis zur Beendigung der Messung wird die Absorption der Reaktions­ lösung in Abständen von etwa 10 Sekunden gemessen. Die Kon­ zentrationen an Chloridionen werden aufgrund der ausgewählten Absorptionsmessung, die vom analytischen Verfahren abhängt, berechnet.

(4) Einfluß von Nitrationen

Als Probe wird ein Kontroll-Blutserum verwendet, das mit einer Natriumnitratlösung vermischt ist. Das Kontroll-Blutserum wird mit destilliertem Wasser in einer Menge von 1/2 Volumenteil pro Volumenteil des Blutserums verdünnt. Die verdünnte Probe wird als "Lösung B" bezeichnet. 1,7 g Natriumnitrat werden in 100 ml destilliertem Wasser gelöst, so daß eine Lösung mit einem Gehalt an 200 millimolar Nitrationen erhalten wird. Die­ se Lösung wird als "Lösung C" bezeichnet. Die Lösung C wird unter Bildung von Natriumnitratlösungen mit Konzentrationen von 40, 80, 120, 160 bzw. 200 millimolar verdünnt. Die einzel­ nen Natriumnitratlösungen werden mit der Lösung B in einem Ver­ hältnis von 1:1 vermischt. Die quantitative Analyse der Chloridionen wird unter Verwendung des vorstehend erwähnten erfindungsgemäßen Reagens oder eines bekannten Reagens durch­ geführt. Das bekannte Reagens besteht aus einem bekannten ersten Reagens und einem bekannten zweiten Reagens, mit der Maßgabe, daß sich das bekannte erste Reagens von dem im vor­ stehenden Absatz (1) erwähnten erfindungsgemäßen ersten Reagens dahingehend unterscheidet, daß das bekannte erste Reagens keine Nitrat-reduktase, keine Nitrit-reduktase und kein NADH enthält. Das bekannte zweite Reagens ist identisch mit dem erfindungsgemäßen zweiten Reagens. Die Versuchsergeb­ nisse sind in Fig. 2 zusammengestellt. Wie aus Fig. 2 hervor­ geht, sind beim bekannten Verfahren die ermittelten Werte für die Menge der Chloridionen wesentlich höher als die rich­ tigen Werte, wenn die Probe eine höhere Konzentration an Nitrationen enthält. Demgegenüber läßt sich erfindungsgemäß der nachteilige Einfluß von Nitrationen ausschalten.

(5) Einfluß von Nitritionen

1,38 g Natriumnitrit werden in 100 ml destilliertem Wasser unter Bildung einer Lösung mit einem Gehalt an Nitritionen in einer Konzentration von 200 millimolar gelöst. Eine Probe wird gemäß vorstehendem Absatz (4) hergestellt. Die quantita­ tive Analyse der Chloridionen wird nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bzw. nach dem bekannten Verfahren durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Fig. 3 dargestellt. Wie bei der im vorstehenden Absatz (4) geschilderten Untersu­ chung wird bestätigt, daß erfindungsgemäß ein Einfluß von Nitritionen mit Erfolg ausgeschaltet werden kann.

Der Konzentrationsbereich an Chloridionen, der erfindungsge­ mäß bestimmt werden kann, beträgt 0 bis 200 millimolar, ange­ geben als die Konzentration in einer Probe. Diese Konzentra­ tion deckt den in üblichen Blutserumproben beobachteten Chlo­ rid-Konzentrationsbereich von 70 bis 130 millimolar voll ab. Somit ist es erfindungsgemäß möglich, eine quantitative Be­ stimmung von Chloridionen in einer Blutserumprobe mit einer zu­ friedenstellend hohen Genauigkeit durchzuführen.

Der bevorzugte Konzentrationsbereich der einzelnen Komponen­ ten in den Reagentien ist nachstehend angegeben. Für das erste Reagens gelten folgende bevorzugten Bereiche: α-Glucosidase: 80 bis 110 KU/Liter; β-Glucosidase: 2,5 bis 3 KU/Liter; 4a-Amylase: 2 bis 20 KU/Liter; Ca²⁺ (Ca-EDTA): 0,75 bis 1,5 Millimol/Liter; EDTA: 30 bis 100 Millimol/Li­ ter; Phosphatpufferlösung: 0,1 m/Liter, pH-Wert 7,0; Nitrat-reduktase: 2 bis 20 KU/Liter, Nitrit-reduktase: 2 bis 20 KU/Liter; und NADH: 8 bis 80 Millimol/Liter.

In bezug auf die Bestandteile des zweiten Reagens gelten die folgenden bevorzugten Bereiche: Ca²⁺ (Ca-EDTA): 0,75 bis 1,5 Millimol/Liter; EDTA: 30 bis 100 Millimol/Liter; 2-Chlor-4-nitrophenyl-β-D-maltoheptaosid: 3,8 bis 7,5 Milli­ mol/Liter.

Es ist auch möglich, 2,5% Maltopentose anstelle von 2-Chlor- 4-nitrophenyl-β-D-maltoheptaosid zu verwenden.

Wie in den vorstehenden Abschnitten erläutert ist, wird er­ findungsgemäß ein Verfahren zur quantitativen Analyse von Chloridionen bereitgestellt, bei dem eine Stufe zur Zersetzung von Nitrat- und Nitritionen enthalten ist, um nachteilige Ein­ flüsse von Nitrit- und Nitrationen auszuschalten, so daß das Verfahren eine hohe Ionenspezifität aufweist. Somit läßt sich erfindungsgemäß eine quantitative Analyse von Chloridionen unter Erzielung einer hohen Genauigkeit durchführen.

Claims (16)

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Chloridionen, wobei

• a) eine Chloridionen enthaltende Probe mit inaktiver Amylase, einer Calciumionen enthaltenden Komplexverbindung und einem kom­ plexbildenden Reagens, das mit Calciumionen unter Bildung einer Komplexverbindung reagieren kann, behandelt, und
• b) die Menge an erhaltener aktiver Amylase, die durch die Chloridionen in der Probe aus der inaktiven Amylase gebildet worden ist, unter Verwendung eines Reagens zur Bestimmung der Amylaseaktivität gemessen und dadurch die Menge an Chloridionen in der Probe bestimmt wird,

dadurch gekennzeichnet, daß man die Chloridionen enthaltende Probe mit einem Reagens zur Zersetzung von Nitritionen oder mit einem Reagens zur Zersetzung von Nitrat- und Nitritionen behandelt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich beim Reagens zur Zersetzung von Nitritionen um eine Nitrit-reduktase handelt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich beim Reagens zur Zersetzung von Nitrit- und Nitrationen um ein Reagens mit einem Gehalt an Nitrit­ reduktase und Nitrat-reduktase handelt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich beim komplexbildenden Reagens um Ethylendiamin­ tetraessigsäure (EDTA) handelt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der inaktiven Amylase um eine inaktive Amy­ lase handelt, die durch Behandeln einer Säugetier-α- Amylase mit einem komplexbildenden Reagens, das mit Calciumionen unter Bildung einer Komplexverbindung reagie­ ren kann, erhalten worden ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Calciumionen enthaltenden Komplexverbin­ dung um Calcium-äthylendiamintetraacetat (Ca-EDTA) han­ delt.

7. Testpackung zur quantitativen Bestimmung von Chloridionen mit

• a) einer inaktiven Amylase,
• b) einer Calciumionen enthaltenden Komplexverbindung,
• c) einem komplexbildenden Reagens, das mit Calciumionen unter Bildung einer Komplexverbindung reagieren kann und
• d) einem Reagens zur Bestimmung der Amylaseaktivität,

gekennzeichnet durch den zusätzlichen Gehalt an (e) einem Reagens zur Zersetzung von Nitritionen oder einem Reagens zur Zersetzung von Nitrat- und Nitritionen.

8. Testpackung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem ersten und einem zweiten Reagens besteht, wobei das erste Reagens eine Kombination der Reagentien (a), (b), (c) und (e) enthält und das zweite Reagens das Reagens (d) enthält.

9. Testpackung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich beim Reagens zur Zersetzung von Nitrat- und Nitritionen um ein Reagens mit einem Gehalt an Nitrat­ reduktase und Nitrit-reduktase handelt.

10. Testpackung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge der Calciumionen enthaltenden Komplexverbin­ dung erheblich größer als die Menge der eingesetzten in­ aktiven Amylase ist.

11. Testpackung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich beim komplexbildenden Reagens um EDTA handelt.

12. Testpackung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Calciumionen enthaltenden Komplexverbin­ dung um Ca-EDTA handelt.

13. Testpackung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der inaktiven Amylase um eine inaktive Amy­ lase handelt, die durch Behandeln einer Säugetier-α- Amylase mit einem komplexbildenden Reagens, das mit Calciumionen unter Bildung einer Komplexverbindung rea­ gieren kann, erhalten worden ist.

14. Testpackung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich beim Reagens zur Bestimmung der Amylaseaktivität um ein Reagens mit einem Gehalt an 4-Nitrophenyl-α-D- maltopentaosid, 2-Chlor-4-nitrophenyl-β-D-maltopentaosid oder 2-Chlor-4-nitrophenyl-β-D-maltoheptaosid handelt.