CH643661A5 - Verfahren und reagens zur bestimmung von harnsaeure. - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und Reagens zur störungsfreien Bestimmung von Harnsäure, insbesondere in Serum und Plasma, mit Hilfe des Uricase/Katalase/Aldehyd-dehydrogenase-Systems.
Ein erhöhter Harnsäurespiegel im Serum (Plasma) stellt einen wichtigen Hinweis auf das Bestehen einer Gichtkrankheit dar. Die quantitative Analyse der Harnsäure im Serum gehört daher zu den im klinisch-chemischen Laboratorium häufig auszuführenden Untersuchungen.
Zur enzymatischen Bestimmung der Harnsäure werden bisher in der Praxis im wesentlichen zwei Methoden angewendet, die als Uricase-Methode und Urica-quant-Methode bekannt sind (vgl. «Methoden der enzymatischen Analyse» (Bergmeyer, H.U., Ed.), Band 2, (1974) 1999 bis 2005, Verlag Chemie). Neuerdings wurde ein neues enzymatisches Verfahren bekannt (DT-OS 24 50 726), das auf dem folgenden Prinzip beruht:
Uricase
Harnsäure + 2 H20 + 02 (EC 1•7*3*3)) Allantoin + C02 + H202
Katalase
H202 + Alkohol (EC 1'11»1«6> > Aldehyd + 2 H20
Aldehyd-Dehydrogenase j_ vr7\r>/m (EC 1.2.1.4 bzw. EC 1.2.1.5), -, ,
Aldehyd + NAD(P) + - : —- 9 Carbonsaure +
NAD(P)H + H+
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Die Bildung von NAD(P)H, gemessen an der Extinktionszunahme bei 340 nm, Hg 334 nm oder Hg 365 nm, ist der Harnsäuremenge proportional.
Verglichen mit der als Referenzmethode angesehenen Uricase-Methode zeichnet sich dieses neuere Verfahren nach Haeckel durch eine geringere Störanfälligkeit gegenüber Verunreinigungen im Analysenansatz aus, da die Messung im längerwelligen UV-Bereich durchgeführt wird (334 bis 365 nm anstelle von 293 bis 297 nm). Im Vergleich zum Urica-quant-Verfahren ist der Zeitbedarf pro Analyse wesentlich geringer, wodurch diese neuere Methode besonders gut für schnell laufende Analysenautomaten geeignet ist.
Bei Anwendung der oben beschriebenen Harnsäuretests nach Haeckel stellte sich heraus, dass in vielen Fällen, insbesondere bei Seren von Nierenkranken oder Leberkranken, so erhebliche Störungen des Tests durch Schleichreaktionen auftraten. Beim Arbeiten nach der Endwert-Methode findet man bereits, vor Zugabe der als Starter dienenden Uricase-Lösung eine NAD(P)H-Zunahme bzw. NADH-Abnahme. Ferner kommt die Reaktion auch nach Umsetzung der gesamten »s Harnsäure nicht zum Stillstand, sondern es wird weiterhin NAD(P)H gebildet. Die Geschwindigkeit dieser Schleichreaktionen beträgt bei 25 °C etwa 0,001 bis 0,004 AE/min, wobei ausserdem auch noch die Geschwindigkeiten vor dem
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Start und nach Ablauf der Harnsäurereaktion oft voneinander verschieden sind. Dies erschwert die genaue Auswertung der Messergebnisse sehr, da man die der umgesetzten Harnsäuremenge entsprechende Extinktionsdifferenz nur ungenau feststellen kann. Aus dieser Extinktionsdifferenz, dem Analysenansatz und dem molaren Extinktionskoeffizienten von NADH ist jedoch das Analysenergebnis zu berechnen.
Diese Schleichreaktionen machen sich bei der Harnsäurebestimmung auf kinetischer Basis noch weitaus störender als bei der Bestimmung nach dem Endwert-Verfahren bemerkbar. Bei den kinetischen Verfahren muss man bekanntlich zur stets erforderlichen Kalibrierung eine Standardbestimmung durchführen, wozu man im allgemeinen einen wässrigen Standard einsetzt (J. Ziegenhorn in «Grundlagen der enzymatischen Analyse») H. Bergmeyer, Seite 81 bis 85, Verlag Chemie (1977). Da bei dieser Standardanalyse keine Schleichre-aktionen auftreten, erhält man bei der Analyse der oben erwähnten Seren, in denen Schleichreaktionen auftreten, falsch positive bzw. negative Resultate; denn der auf die Harnsäure-Umsetzung zurückgehenden Reaktion überlagert sich die Schleichreaktion. Die kinetischen Tests sind jedoch für das automatisierte Laboratorium von grosser Bedeutung. Sie ermöglichen es, den Zeitbedarf pro Analyse drastisch zu reduzieren und nutzen somit die Analysenautomaten besser aus. Darüber hinaus sind sie im allgemeinen weniger anfällig gegen Störungen durch Trübungen oder Eigenfarbe der Probe als Endwert-Verfahren.
Wie beim Endwert-Verfahren können zwar auch bei den kinetischen Verfahren die durch Schleichreaktionen bedingten Störungen bis zu einem gewissen Grade durch die Bestimmung von Proben-Leerwerten berücksichtigt werden. Dies hat jedoch Nachteile; denn Proben-Leerwert-Bestimmungen bedeuten immer eine Verdoppelung des Zeit- und Reagensbedarfs bei der Durchführung der Analyse. Vor allem an modernen, schnell laufenden Analysenautomaten (Centrifugai Fast Analyzer und verwandte Geräte) beeinträchtigen Proben-Leerwert-Analysen die optimale Ausnutzung der Geräte sehr.
Je nach Ausmass der Schleichreaktion wurden Fehler von 5 bis 20% für die Analysenresultate festgestellt. Dies bedeutet eine starke Einschränkung der Anwendbarkeit der Haeckel-schen Methode zur Harnsäurebestimmung in der Routinediagnostik, wo bekanntlich Harnsäuretests besonders oft an Seren von Nierenkranken vorgenommen werden müssen. Gerade bei Gicht ist eine Erkrankung der Niere ausserordentlich häufig.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu schaffen, mit dem sich die geschilderten Störungen bei der Harnsäurebestimmungsmethode nach Haeckel vermeiden lassen.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäss durch ein Verfahren zur Bestimmung von Harnsäure in biologischem Material mittels Uricase, Katalase und Aldehyddehydrogena-se in Gegenwart von Alkohol und Nicotinamid-adenid-dinu-cleotid bzw. -phosphat [NAD(P)], welches dadurch gekennzeichnet ist, dass wenigstens eine Verbindung aus der Gruppe Oxalat, Malonsäuremononiedrigalkylester, Trihalogenäthanol, gegebenenfalls mit einer oder mehreren Niedrigalkylgruppen oder/und Halogenatomen substituiertes Pyrazol oder Pyridin, gegebenenfalls durch eine Niedrigalkylgruppe substituierte Pyridincarbonsäure, deren Amid oder Niedrigalkylester, Thioharnstoff, Isobutyramid oder chelatbildendes Komplexierungsmittel, wie Nitrilotriessigsäure oder Äthylendiamintetraessigsäure zugesetzt wird.
Als biologisches Material können insbesondere Serum und Blut, jedoch auch Harn, durch Zellaufschluss gewonnene Flüssigkeiten oder dergleichen, als Ausgangsmaterial eingesetzt werden.
Unter Niedrigalkylgruppen werden im Rahmen der Erfindung solche mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen verstanden. Halogenatome sollen im Rahmen der Erfindung in der Regel Chlor-, Brom- und Jodatome sein. Bei den Pyrazolderivaten werden solche bevorzugt, bei welchen ein Substituent in Stel-5 lung 4 steht. Bei den Pyridincarbonsäuren steht die Carboxyl-gruppe vorzugsweise in Stellung 3. Typische Beispiele für geeignete Verbindungen sind Pyrazol, 4-Brompyrazol, 4-Jod-pyrazol, 4-Chlorpyrazol, 4-Methylpyrazol, 4-Äthylpyrazol, 4-Propylpyrazol, 3,4-Dibrompyrazol, Pyridin, N-Methylnico-|u tinamid u.ä.
Die erfindungsgemäss einzusetzenden Zusatzmittel können einzeln oder in Kombination zugegeben werden. Während in vielen Fällen ein einziges Zusatzmittel ausreicht, um eine Schleichreaktion vollständig zu unterdrücken, wird doch 's der Zusatz von wenigstens zwei der erfindungsgemässen Mittel bevorzugt. Besonders bevorzugt wird die Verwendung eines Mittels aus der Gruppe Oxalat und Malonsäuremono-. niedrigalkylester zusammen mit einem oder mehreren Mitteln aus der Gruppe der Trihalogenäthanole, Isobutyramid, Thio-20 harnstoff, substituierten oder unsubstituierten Pyrazole, Pyridine oder Pyridincarbonsäuren. Unter den Oxalaten werden die Alkalisalze bevorzugt.
Das Verfahren kann nach dem Endwert-Verfahren durchgeführt werden, bei dem die Konzentration der Harnsäure 25 nach Ablauf der Reaktion aus der gemessenen Extinktionsdifferenz ermittelt wird. Ferner können kinetische Verfahren angewendet werden, bei denen die Geschwindigkeit der Reaktion als Messgrösse dient. Die Lehre, wie derartige kinetische Testsysteme beim Vorliegen von gekoppelten Enzymre-30 aktionen aufzubauen sind, ist aus der DT-OS 25 58 536 bekannt. Ausserdem ist aus DT-PS 24 40 011 bereits bekannt, dass die an sich für die Anwendung von kinetischen Verfahren zu niedrige Michaelis-Konstante der Uricase in bezug auf Harnsäure durch Zusatz eines kompetitiven Inhibitors schein-35 bar erhöht werden kann, so dass kinetische Messprinzipien benutzt werden können. Ein solcher kompetitiver Inhibitor ist z.B. Xanthin.
Die erfindungsgemäss zugesetzten Verbindungen werden in solchen Mengen verwendet, dass vorkommende Schleich-40 reaktionen vollständig unterdrückt werden. Die erforderlichen Mengen lassen sich leicht durch einen einfachen Vorversuch bestimmen. Im allgemeinen reichen jedoch Zusätze zwischen 0,005 und 0,5 Mol Zusatzverbindung pro Liter Reagens vollständig aus. In Einzelfällen können grössere oder kleinere « Zusätze in Betracht kommen.
Die Verfahrensbedingungen hinsichtlich pH-Wert, Zeit, Temperatur und dergleichen entsprechen im allgemeinen den aus der DT-OS 24 50 726 bekannten. Vorzugsweise wird bei pH 8,0 bis 9,0 gearbeitet unter Verwendung eines in diesem so Bereich seine maximale Kapazität aufweisenden Puffers. Besonders gute Ergebnisse wurden mit Diphosphatpuffer (K4P2O7/HCI) erzielt. Zweckmässig erfolgt die Bestimmung bei Raumtemperatur.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagens 55 zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens, enthaltend Uricase, Katalase, Aldehyddehydrogenase, Alkohol, NAD(P) und Puffer, welches dadurch gekennzeichnet ist,
dass es wenigstens eine Verbindung aus der Gruppe Oxalat, Malonsäuremononiedrigalkylester, Trihalogenäthanol, gege-m> benenfalls mit ein oder mehreren Niedrigalkylgruppen oder/ und Halogenatomen substituiertes Pyrazol oder Pyridin, gegebenenfalls durch eine Niedrigalkylgruppe substituierte Pyridincarbonsäure, deren Amid oder Niedrigalkylester, Thioharnstoff, Isobutyramid oder chelatbildendes Komple-65 xierungsmittel, wie Nitrilotriessigsäure oder Äthylendiamintetraessigsäure enthält.
Ein bevorzugtes Reagens der oben genannten Art enthält 1 x 102 bis 1 x 103 U/1 Uricase, 500 bis 1500 kU/1 Katalase,
643 661
500 bis 1000 U/1 Aldehyddehydrogenase, 0,3 bis 2 Mol/1 Äthanol, 0,5 bis 1,5 mMol/1 NAD+ oder NADP+, 20 bis 100 mMol/1 Puffer pH 8,0 bis 9,0 und 0,005 bis 0,5 Mol/1 Zusatzmittel.
Erfindungsgemäss gelingt es, wie oben beschrieben, störende Schleichreaktionen bei der Betimmung auszuschliessen und damit die Genauigkeit des Verfahrens zu verbessern und durch Einsparung von Proben-Leerwert-Bestimmung den Zeit- und Reagentienbedarf herabzusetzen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Beispiele 1 bis 27
Die nachstehend beschriebenen Beispiele wurden nach dem Endwert-Verfahren durchgeführt unter Verwendung folgender Reagentien:
Reagens 1
K4P207/HCl-Puffer (30 bis 50 mMol/1, pH 8,0 bis 9,0), Äthanol (0,3 bis 2 Mol/1), NAD+ (> 0,5 mMol/1), Katalase aus Rinderleber (> 500 kU/1), Aldehyddehydrogenase aus Hefe (> 500 U/1).
Reagens 2
Uricase aus Schweineleber (> 1,6 x 105 U/1).
Bestimmungsansatz
Messstrahlung: Hg 334 nm, 340 nm, Hg 365 nm; Schichtdicke der Küvette: 1 cm; Inkubationstemperatur: Raumtemperatur.
2,0 ml des Reagens 1 in Küvette pipettieren, 0,1 ml Probe zusetzen und mischen. Extinktion etwa 3 Minuten lang registrieren, auf Zeitpunkt der Zugabe von Reagens 2 extrapolieren und Ei bestimmen. 10 (il des Reagens 2 einmischen. Extinktion etwa 2 bis 10 Minuten lang registrieren, durch Extrapolation auf den Zeitpunkt der Zugabe von Reagens 2 E2 ermitteln.
Berechnung der Konzentration (c) der Harnsäure im Serum:
(X, = Hg 334 nm)
(\=Hg340 nm)
(?i= Hg 365 nm, NAD) (A.= Hg 365 nm, NADP)
c = (E2 —Ei)-3,41 mMol/1 c = (E2-E.)- 3,35 mMol/1 c = (E2-Ei)-6,20 mMol/1 c = (E2-Ei)-6,03 mMol/1
Bei- Probe spiel
Nr.
Coenzym Zusatzmittel (Mol/1)
Schleichreaktion AE/Minute
Urämiker-serum Nr. 1
Urämiker-serum Nr. 1
NAD - +0,004
NAD Pyrazol 0,000
(0,05-0,3)
Beispiel Nr.
20
25
10
11
35 12
13
14
Probenmaterial
Serum, Plasma, verdünnter Harn.
Bei dem wie oben beschrieben durchgeführten Verfahren wurden die aus der folgenden Tabelle ersichtlichen erfindungsgemässen Zusatzmittel eingesetzt. Die Tabelle gibt an die Art des verwendeten Probenmaterials, das eingesetzte Coenzym, die Verwendung des Zusatzmittels sowie die unspezifische Extinktionsänderung (Schleichreaktion) in E pro Minute. Die Beispiele 1,4,6, 8,10,13,17,22,24 und 26 sind Vergleichsbeispiele, die übrigen Beispiele erläutern die Erfindung.
15
50
16
17
60
18
19
65
Probe Coenzym Zusatzmittel
(Mol/1)
Urämiker-serum Nr. 1
Urämiker-serum Nr. 2
Urämiker-serum Nr. 2
Urämiker-serum Nr. 3
Urämiker-serum Nr. 3
Urämiker-serum Nr. 4
Urämiker-serum Nr. 4
Urämiker-serum Nr. 5
Urämiker-serum Nr. 5
Urämiker-serum Nr. 5
Urämiker-serum Nr. 6
Urämiker-serum Nr. 6
Urämiker-serum Nr. 6
Urämiker-serum Nr. 6 Urämiker-serum Nr. 6 Urämiker-serum Nr. 6 Urämiker-serum Nr. 6
Schleichreaktion AE/Minute
NAD Pyridin 0,000
(0,05-0,20)
NAD - +0,002
NAD 4-Methylpyridin 0,000 (0,1-0,3)
NAD -
+ 0,003
NAD a) Pyrazol 0,001 (0,05-0,15)
b)Natriumoxa- 0,000 lat
(0,05-0,15)
NAD - +0,002
NAD Trichloräthanol 0,000 (0,01-0,07)
NAD -
-0,003
NAD Natriumoxalat 0,000 (0,05-0,15)
NAD Malonsäuremo- 0,000 noäthylester (K-Saltz)
(0,05-0,15)
+ 0,003
NAD
NAD a) Pyrazol (0,05-0,15)
0,001
b)Malonsäure- 0,000 monoäthylester (K-Salz)
(0,05-0,15)
NAD a) Pyrazol 0,001
0,05-0,15)
b) Pyridin 0,000
(0,05-0,10) NAD Thioharnstoff 0,000 (0,1-0,2)
NADP -
+ 0,002
NADP Trichloräthanol 0,000 (0,01-0,07)
NADP a) Pyrazol (0,05-0,15)
0,001
b)Malonsäure- 0,000
monoäthylester
(K-Salz)
(0,05-0,15)
5
643 661
Bei
Probe
Coenzym Zusatzmittel
Schleich spiel
(Mol/1)
reaktion
Nr.
AE/Minute
20
Urämiker-
NADP
a) Pyrazol
0,001
serum
(0,05-0,15)
Nr. 6
b) Natrium-
0,000
oxalat
(0,05-0,15)
21
Urämikerse-
NADP
a) Pyrazol
0,001
rum
(0,05-0,15)
Nr. 6
b) Pyridin
0,000
(0,05-0,10)
22
Urämiker-
NADP
-
+ 0,003
serum
Nr. 7
23
Urämiker-
NADP
a) Trichlor
0,001
serum
äthanol
Nr. 7
(0,01-0,07)
b) Malonsäure-
0,000
monoäthylester
(K-Salz)
(0,05-0,10
24
Urämiker-
NAD
-
+ 0,002
serum
Nr. 8
25
Urämikerse-
NAD
EDTA
0,000
rum
(0,05-0,20)
Nr. 8
26
Serum
NAD
-
+ 0,001
Nr. 9
27
Serum
NAD
Isobutyramid
0,000
Nr. 9
(0,01-0,3)
+ = Extinktionszunahme — = Extinktionsabnahme
Aus den Beispielen 1 bis 27 geht hervor, dass erfindungsgemäss die störende Schleichreaktion vollständig unterdrückt werden kann, gleichgültig, ob es sich dabei um eine Extinktionszunahme oder Extinktionsabnahme handelt.
5
Beispiel 28
Zur Harnsäurebestimmung auf kinetischer Basis kann das folgende Reagens eingesetzt werden :
10 Reagens
K4P207/HCl-Puffer (30 bis 50 mMol/1, pH 8,0 bis 9,0), Äthanol (0,3 bis 2 Mol/1), NAD+ (> 0,5 mMol/1), Katalase aus Rinderleber (> 500 kU/1), Aldehyddehydrogenase aus Hefe (> 500 U/1), Uricase (470 bis 710 U/1), Xanthin, K-Salz 15 (180 bis 240 nmol/1).
Bestimmungsansatz
Durchführung der Analyse nach dem kinetischen «fixed-time-Verfahren» (vgl. DT-OS 25 58 536.8) unter Benutzung 20 eines GEMSAEC Fast Analyzers.
Messstrahlung: 340 nm; Inkubationstemperatur: 25 °C. Probe bzw. Standard 50 j_il
NaCl-Lösung, 0,9% 200 jxl
Reagens 500 jxl
25 Die erste Ablesung Ei wird 35 bis 100 Sekunden nach dem Start der Reaktion, die zweite Ablesung E2150 bis 200 Sekunden später durchgeführt. Unter Bezugnahme auf einen Standardansatz berechnet der Computer des Automaten die Harnsäurekonzentration (cprobe) nach der Formel:
30
Cprobe = C^"dard-(E2-E»)Probe mMol/l
(E2 Ei) Standard
Probenmaterial 35 Serum, Plasma, verdünnter Harn.
Die Durchführung der Versuche erfolgte analog wie bei den Beispielen 1 bis 27 mit und ohne Zusatz der erfindungsgemässen Zusatzmittel. Die Ergebnisse entsprachen dabei völlig denen, die mit den entsprechenden Zusätzen nach den 40 Beispielen 1 bis 27 erzielt wurden.
G
Claims (8)
1. Verfahren zur Bestimmung von Harnsäure in biologischem Material mittels Uricase, Katalase und Aldehydde-hydrogenase in Gegenwart von Alkohol und Nicotinamid-adenin-dinucleotid bzw. -phosphat, dadurch gekennzeichnet, 5 dass man wenigstens eine Verbindung aus der Gruppe Oxalat, Malonsäuremononiedrigalkylester, Trihalogenäthanol, gegebenenfalls mit einer oder mehreren Niedrigalkylgruppen oder/und Halogenatomen substituiertes Pyrazol oder Pyridin, gegebenenfalls durch eine Niedrigalkylgruppe substituierte '« Pyridincarbonsäure, deren Amid oder Niedrigalkylester, Thioharnstoff, Isobutyramid oder chelatbildendes Komple-xierungsmittel, zusetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass man als Komplexierungsmittel Nitrilotriessigsäure oder 15 Äthylendiamintetraessigsäure zusetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man 0,005 bis 0,5 Mol/1 Zusatzmittel verwendet.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch 20 gekennzeichnet, dass man wenigstens ein Zusatzmittel aus der Gruppe Oxalat und Malonsäuremononiedrigalkylester zusammen mit einem oder mehreren Zusatzmitteln aus der Gruppe der Trihalogenäthanole, Isobutyramid, Thioharnstoff, substituierten oder unsubstituierten Pyrazole, Pyridine 25 oder Pyridincarbonsäuren zusetzt.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man bei pH-Werten von 8,0 bis 9,0 arbeitet.
6. Reagens zur Durchführung des Verfahrens nach 30 Anspruch 1, enthaltend Uricase, Katalase, Aldehyddehydro-genase, Alkohol, Nicotinamid-adenin-dinucleotid bzw. -phosphat und Puffer, dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens eine Verbindung aus der Gruppe Oxalat, Malon-säuremononiedrigalkylester, Trihalogenäthanol, gegebenen- 35 falls mit einer oder mehreren Niedrigalkylgruppen oder/und
Halogenatomen substituiertes Pyrazol oder Pyridin, gegebenenfalls durch eine Niedrigalkylgruppe substituierte Pyridincarbonsäure, deren Amid oder Niedrigalkylester, Thioharnstoff, Isobutyramid oder chelatbildendes Komplexierungsmittel enthält.
7. Reagens nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
dass es als Komplexierungsmittel Nitrilotriessigsäure oder Äthylendiamintetraessigsäure enthält.
8. Reagens nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass es 1 x 102 bis 1 x 103 U/1 Uricase, 500 bis 1500 kU/1 Katalase, 500 bis 1000 U/1 Aldehyddehydrogenase, 0,3 bis 2 Mol/1 Äthanol, 0,5 bis 1,5 mMoI/1 NAD+ oder NADP+, 20 bis 100 mMol/1 Puffer pH 8,0 bis 9,0 und 0,005 bis 0,5 Mol/1 Zusatzmittel enthält.
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