DE2913722C2

DE2913722C2 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Wasserstoffperoxid

Info

Publication number: DE2913722C2
Application number: DE19792913722
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Ing.(Grad.) 6451 Neuberg Flemming
Original assignee: HUMAN GESELLSCHAFT fur BIOCHEMICA und DIAGNOSTICA MBH 6204 TAUNUSSTEIN DE
Current assignee: HUMAN GESELLSCHAFT fur BIOCHEMICA und DIAGNOSTICA MBH 6204 TAUNUSSTEIN DE
Priority date: 1979-04-05
Filing date: 1979-04-05
Publication date: 1981-09-17
Also published as: DE2913722B1

Description

Die Bestimmung der Wasserstoffperoxidkonzentration in biologischen Materialien spielt in medizinischen Laboratorien, insbesondere in der klinischen Chemie, eine zunehmend wichtige Rolle als Indikatorreaktion bei verschiedenen Analyseverfahren. Beispielsweise kann Glucose in der Form von Blutzucker mit Hilfe von Glucoseoxidase in Gluconsäure und Wasserstoffperoxid, Harnsäure mit Hilfe von Uricase durch Umsetzung mit 2 Mol Wasser und 1 Mol Sauerstoff in Allantoin und Wasserstoffperoxid und Cholesterin mit Hilfe von Cholesterinoxidase mit 1 Mol Wasser und 1 Mol Sauerstoff in 4⁴-Cholestenon und Wasserstoffperoxid überführt werden. Mit der quantitativen Bestimmung der Wasserstoffperoxidkonzentration kann man somit die Glucosekonzentration, Harnsäurekonzentration bzw. Cholesterinkonzentration in der wäßrigen Ausgangslösung bestimmen.

Aus der DE-OS 24 50 726 ist ein gegenüber früheren Bestimmungsmethoden verbessertes enzymatisches Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Wasserstoffperoxid in biologischen Materialien bekannt, bei dem das Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Katalase und Aldehyddehydrogenase mit Alkohol unter Bildung des entsprechenden Aldehyds und dieser seinerseits mit Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD) bzw. Nicotinamid-adenin-dinuclenotid-phosphat

(NADP) umgesetzt wird. Das Verfahren verläuft nach dem folgenden Reaktionsschema:

H₂O₂ + Alkohol

Knlakisc Aldehyd + 2 H₂O

Aldehyd+ NAD(P)⁺ _{Carbonsäurc + ΝΛΙ)(Ρ)1Ι +} „-

Die Bildung von NADH bzw. NADPH, die an der Extinktionszunahme bei 340 nm, Hg 334 nm oder Hg 365 nm gemessen wird, ist der gebildeten Wasserstoffperoxidmenge proportional.

Dieses Verfahren hat den Vorteil eines überraschend schnellen Reaktionsablaufes und einer geringen Störanfälligkeit gegenüber Verunreinigungen im Analysenansatz, insbesondere gegenüber Ascorbinsäure. Der schnelle Reaktionsablauf macht das Verfahren geeignet für schnellaufende Analysenautomaten nach der kinetischen Bestimmungsmethode und für die Endwcrt-Bestimmungsmethocle.

Es hat sich aber gezeigt, daß bei bestimmten Krankheitsbildern Schleichreaktionen auftreten, die die Bestimmungsgenauigkeit teilweise erheblich beeinträchtigen, da bereits vor der Zugabe des als Starter dienenden Enzyms NADH bzw. NADPH gebildet wird und auch nach Umsetzung des gesamten Wasserstoffperoxids die Reaktion unter Bildung von NADH bzw. NADPH noch nicht zum Stillstand kommt. In solchen Fällen läßt sich daher die Extinktionsdifferenz nicht genau feststellen, so daß auch das Analysenergebnis ungenau wird, da dieses an Hand der Extinktionsdifferenz berechnet wira.

Um Schieichreaktionen bei solchen Füllen auszuschließen, ist es aus der DE-OS 27 18 588 bekannt, dem Testansatz bestimmte organische Verbindungen /u/usetzen. Diese Verbindungen sind aber nicht geeigent, Schleichreaktionen auszuschalten. Insbesondere hat der Zusatz dieser Verbindungen bei Seren bestimmter Patienten, insbesondere solcher mit hohem Gehalt an 1 eberenzymen. keinerlei Einfluß.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand somit darin, in dem Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Wasserstoffperoxid in Gegenwart von !Catalase und Aldehyddehydnogenase Schleichreaktionen möglichst umfassend auszuschalten und so die Bestimmungsgenauigkeit des Verfahrens bei allen Patienten zu bekommen und iJieses Bestimmungsverfahren mit seinen oben geschilderten Vorteilen umfassend anwenden zu können.

Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Wasserstoffperoxid in biologischem Material durch Umsetzung mit einem Alkohol und Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD) bzw. Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat (NADP) in Gegenwart von Katalase und Aldehyddehydrogenase erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man die Umsetzung in Gegenwart wenigstens eines praktisch farblosen Ammoniumsalzes durchführt, das nicht oxidierend und nicht reduzierend ist und den pH-Wert des jeweiligen Testansatzes nicht unter 7,5 und nicht über 9,5, vorzugsweise nich« unter 8,0 und nicht über 9,0 hinaus verschiebt

Als biologisches Material kommen beliebige Körperflüssigkeiten in Betracht, insbesondere Serum und Blut, jedoch auch Harn, durch Zellaufschluß gewonnene Flüssigkeiten oder dergleichen.

Die genannten Ammoniumsalze Wonnen dem Testansatz getrennt von dem Testreagens zugesetzt werden, doch ist es zweckmäßig, die Ammoniumsalze bereits dem Testreagens selbst zuzusetzen. Günstigerweise verwendet man die Ammoniumsalze in einer Menge von 5 bis 500 mMoi, vorzugsweise von 20 bis 300 mMol, besonders in einer Menge von 50 'Js 200 mMol je 1 Testreagens. Beispielsweise verwendet man 50 oder 100 oder 200 mMol je 1 Testreagens.

Als Ammoniumsalze können solche anorganischer oder organischer Säuren verwendet werden. Bevorzugt werden Ammoniumsulfat, -chlorid, -acetat, -oxalat oder -carbonat oder Diammoniumhydrogenphosphat verwendet. Besonders bevorzugt sind Ammoniumchlorid und Ammoniumsulfat. Weitere Beispiele verwendbarer anorganischer Ammoniumverbindungen sind Amino· niumbromid, Ammoniumrhodanid, Ammoniumolybdat, Ammoniumfluorophosphat, Ammoniumnitrat und Ammoniumthiosulfat

Bei der Auswahl der Ammoniumverbindungen muß lediglich darauf geachtet werden, daß diese nicht durch eine Eigenfärbung die Extinktionsbestimmung beeinträchtigen, daß sie nicht in einem Maße oxidierend oder reduzierend wirken, daß dadurch das Analysenergebnis verfälscht würde, und daß sie in wäßriger Lösung nicht so stark sauer oder alkalisch reagieren, daß sie den für die Reaktion erforderlichen pH-Wert im Bereich von 8,0 bis 9,0 über diese Grenzen hinaus verschieben würden.

Beispielsweise Ammoniumhydroxid, Monoammoniumdihydrogenphosphat und Diammoniumhydrogencitrat sind in Konzentrationen von IOOmMol/1 Testreagens nicht brauchbar, da sie zu einem pH-Wert oberhalb 10 bzw. unterhalb 7 führen. Wenn aber in der Beschreibung und den Ansprüchen davon die Rede im. daß solche Ammoniumsalze verwendet werden sollen, daß sie den pH-Wert des jeweiligen Testansaizes nicht unter 8,0 und nicht über 9,0 hinaus verschieben, so bedeutet dies, daß die Auswahl nach dem jeweiligen Testansatz., dem jeweiligen Testreagens, insbesondere dem darin verwendeten Puffer, und der zu verwenden den Konzentration des Ammoniumsal/es aiis/iiwiihlen sind. Wenn weiterhin davon die Rede ist, daß die verwendeten Ammoniumsalze nicht oxidierend oder reduzierend wirken sollen, so bedeutet auch dies, daß sie in der verwendeten Konzentration und dem verwende-

-, ten Testreagens sowie in dem zu verwendenden Testansatz nicht zu Oxidations- oder Reduktionsreaktionen führen dürfen, die das Testergebnis gegenüber dem einer quantitativen Umsetzung von H₂O₂ verfälschen würden.

in Die gleichen Ausführungen gelten auch für die Ammoniumsalze organischer Säuren, wobei der jeweilige Säurerest beispielsweise aus einer aliphatischen oder aromatischen oder heterocyclischen Monocarbonsäure oder Dicarbonsäure stammen kann. Aliphattsche Mono-

r> und Dicarbonsäuren mit 1 bis 20, vorzugsweise 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, besonders mil I bis 4 Kohlenstoffatomen sind bevorzugt Unter den aromatischen Carbonsäuren sind beispielsweise Benzoesäure und deren durch Halogenatome, Nitrogruppen, Hydroxyl-

_>ii gruppen, Alkylgruppen (besonders mit I bis 10, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen), Carboxylgruppen und andere Substituenten substituierte Derivate zu nennen. Der Benzoesäurerest kann gewöhnlich mit bis zu 3 dieser Gruppen substituiert sein. Spezielle

r> Beispiele von Ammoniumsalzen organischer Säuren sind Ammoniumoxalat, Ammoniumacetat, Ammoniumbenzoat, Ammoniumtartrat und die Ammoniumsalze der hierzu homologen Säuren.

Als Alkohol können in dem Vei fahren besonders

κι Methanol, Äthanol oder Propanol verwendet werden. Äthanol ist hiervon bevorzugt.

Es wurde gefunden, daß durch den Zusatz wenigstens eines der angegebenen Ammoniumsalze Schleichreaktionen auch in solchen Fällen beseitigt werden können,

ι-, wo die Zusatzstoffe gemäß der DE-OS 27 18 588 erfolglos blieben. Besonders wichtig ist das beanspruchte Verfahren für die Bestimmung von Harnsäure, da dort in besonderem Maße Fälle auftreten, die zu Schleichreaktionen neigen. Bei der Bestimmung der

ι» Harnsäure wird dem enzymatisthen Gemisch zusätzlich zu Katalase und Aldehyddehydrogenase in bekannter Weise als Starter Uricase zugesetzt. Im Falle der Glucosebestimmung wird die Reaktion durch Glucoseoxidase und im Falle der Cholesterinbestimmung durch

r> Cholesterinoxidase gestartet.

Als Aldehyddehydrogenase kann beispielsweise Oxidoreduktase EC. 1.2.1.3, E.C. 1.2.1.4., EC 1.2.1.5, E.C. 1.2.1.7.. E.C 1.2.1.8. oder E.C. 1.2.1.1. verwendet werden.

Vi Das erfindungsgemäße Verfahren kann nach dem kinetischen Bestimmungsverfahren oder nach dem Endwert-Bestimmungsverfahren durchgeführt werden. Im ..rsteren Fall dient die Geschwindigkeit der Reaktion als Meßgröße, im letzteren Fall wird die Konzentration

ν· des Wasserstoffperoxids nach Ablauf der Reaktion mit Hilfe des F.xtinktionskoeffizicnten ermittelt, wobei, da der Extinktionskoeffizient von NADH und NADPH hinreichend bekannt ist. keine Standardlösung mitgeführt werden muß.

wi Da die Reaktion im pH-Bereich von 8,0 bis 9,0 durchgeführt werden muß, ist es üblich, dem Testansatz bzw. bereits dem Testreagens einen üblichen Puffer pH 8,0 bis 9,0 zuzusetzen. Gute Ergebnisse werden mit Diphosphatpuffer (K4p?O;/KCI) erzielt. Die übrigen Verfahrensbedingiingen, wie Zeit, Temperatur und dergleichen, entsprechen jenen, die in der DHOS 24 50 726 beschrieben sind. Zweckmäßig erfolgt die Bestimmung bei Raumtemperatur.

Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Reagens zur Durchführung des obigen Verfahrens. Dieses Reagens enthält Katalase, Aldehyddehydrogenase, einen Alkohol, NAD bzw. NADP und Puffer und ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich wenigstens ein praktisch farbloses Ammoniumsalz enthält, das nicht oxidierend und nicht reduzierend ist und den pH-Wert des jeweiligen Testansatzes nicht unter 73 und nicht über 93 hinaus verschiebt. Zweck näßig enthält das Reagens nach der Erfindung das Ammoniumsalz oder die Ammoniumsalze in einer Menge von 5 bis 500 mMol, vorzugsweise 20 bis 300 mMol, besonders 50 bis 200 mMol je I des Reagens.

Ein besonders bevorzugtes Reagens der obengenannten Art enthält 300 bis 2000 kU/1 Katalase, 100 bis 1000 U/l Aldehyddehydrogenase, 0,25 bis 2.5 Mol/l Äthanol, 0,25 bis 1,5 mMoi/1 NAD oder NADP, 25 bis 120 mMol/l Puffer pH 8,0 bis 9,0 und 5 bis 500 mMol/1 Ammoniumsalz.

Zweckmäßig enthält dieses Reagens als Stabilisatoren zusätzlich 5 bis 500 mMol/l Äthylendiamintetraessigsäurc oder deren Alkaüsalze, 03 bis 50 mMol Glycin und 0,001 bis 1 % (Gew. pro Vc-..) Albumin.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiele 1 bis 9

Die folgenden Beispiele wurden nach dem Endwert-Verfahren und unter Verwendung der folgenden Reagenzien durchgeführt:

NADP 1,06 mMol/l

Kaialase 173 x 10³kU/l

Aldehyddehydrogenase 250 U/l
Äthylendiamintetraessig-

'■ säure-Natriumsalz 67 mMol/l

Glycin 333 mMol/l

Albumin 0,0125%

(Gew. pro Vol.)

'" Reagens 2

Uricase aus Schweineleber
(1,1 χ 10⁴U/!)

Bestimmungsansatz

Meßstrahlung: Hg 334 nm, 340 ran, Hg 365 nm. Schichtdicke der Küvette 1 cm, Inkubationstemperatur: Raumtemperatur.

2,0 ml Reagens 1 werden in die Küvette pipeuiert. 0,1 ml Probe wird zugesetzt und vermischt. Die Extinktion wird ca. 5 min lang registriert, auf den Zeitpunkt der Zugabe des Reagens 2 extrapoliert, und E\ wird bestimmt. 10 μΙ Reagens 2 werden zugemischt. Die Extinktion wird ca. 15 min registriert, durch Extrapolation auf den Zeitpunkt der Zugabe von Reagens 2 extrapoliert, und E₂ wird ermittelt.

Berechnung der Konzentration fender Harnsäure im Serum:

Reagens 1 K^PzOz/KCI-Puffer Äthanol	Probe	I	je 42 mMol/l, pi 183 1,43 mMol/l	C = (E_:- E₁) ■ 3.41 mMol/l (λ = C = (Ez- Ei) · 3,35 mMol/l (Λ = C = (E₂-E₁) ■ 6.03 mMol/l (λ =	Hg 334 nm) Hg340nm) Hg 365 nm. NADI
Probenmaterial: Serum	Serum	I
Bsp. Nr.	Serum	I	Cocn/yni	/usiil/mitlcl. mol/l	Schlcichrcaktion Vj min
1	Serum	2	NADP	NII₁CI (KH)mMol/l)	0,000
2	Scrum	2	NAl)P	-	0,004
3	Scrum	2	NAI)P	(NN₄MSO₁) <2iX)mMol/l)	0,000
4	Scrum	2	NAI)	(NII₄HIPO₁ (KX) niMol/l)	0,000
5	Scrum	3	NAl)P	(NIL)₁IIPO, (l(H)mMol/l)	0,000
6	Scrum	3	NAI)P		0,002
7	Scrum	NAI)	-	0,004
8		NAI)P	NII₄CIhOO H5()niMol/l)	0,(XX)
9		NAI)P		0,003

Aus den Beispielen I bis 9 geht hervor, daß die S.hlc salze νοί'ι unterdrück! werden können.

y.¹ honen durch /us;it/ der untersuchten Ammonium

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Wasserstoffperoxid in biologischem Material durch Umsetzung mit einem Alkohol und Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD) bzw. Nicotin-amid-adenin-dinucleotid-phosphat (NADP) in Gegenwart von Katalase und Aldehyddehydrogenase, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in Gegenwart wenigstens eines praktisch farblosen Ammoniumsalzes durchführt, das nicht oxidierend und nicht reduzierend ist und den pH-Wert des jeweiligen Testansatzes nicht unter 7,5 und nicht über 9,5 hinaus verschiebt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das bzw. die Ammoniumsalz(e) in einer Menge von 5 bis 500 mMol, vorzugsweise 20 bis 300 mMol, besonders 50 bis 200 mMol je Liter Testreagens verwendet

3. Verfahren nach Anspruch i und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Ammoniumsulfat, -chlorid, -acetat, -oxalat oder -carbonat oder Diammoniumhydrogenphosphat verwendet

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Ammoniumsalz verwendet, das den pH-Wert des jeweiligen Testansatzes nicht unter 8,0 und nicht über 9,0 hinaus verschiebt.

5. Reagens zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 3, enthaltend Katalase, Aldehyddehydrogenase, einen Alkohol, NAD bzw. NADP und Puffer, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich wenigstens ein praktisch farbloses Ammoniumsalz enthält, das nicht oxidierend und nicht reduzierend ist und den pH-Wert des jeweiligen Testansatzes nicht unter 7,5 und nicht über 9,5 hinaus verschiebt

6. Reagens nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es das bzw. die Ammoniumsalz(e) in einer Menge von 5 bis 500 mMol, vorzugsweise 20 bis 300 mMol, besonders 50 bis 200 mMol je Liter Reagens enthält.

7. Reagens nach Anspruch 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß es 300 bis 2000 HJ/1 Katalase, 100 bis 1000 U/l Aldehyddehydrogenase, 0,25 bis 2,5 Mol/l Äthanol, 0,25 bis 1,5 mMoi/Liter NAD oder NADP, 25 bis 120 mMol/Liter Puffer pH 8,0 bis 9,0 und 5 bis 500 mMol/Liter Ammoniumsalz enthält

8. Reagens nach Anspruch 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich 5 bis 500 mMol/Liter Äthylendiarr.intetraessigsäure, deren Alkalisaiz oder Nitrilotriessigsäure, 03 bis 50 mMol/Liter Glycin und 0,001 bis I % (Gew. pro Vol.) Albumin enthält