DE2913722B1 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Wasserstoffperoxid - Google Patents

Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Wasserstoffperoxid

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Description

  • Um Schleichreaktionen bei solchen Fällen auszuschließen, ist es aus der DE-OS 27 18588 bekannt, dem Testansatz bestimmte organische Verbindungen zuzusetzen. Diese Verbindungen sind aber nicht geeigent, Schleichreaktionen auszuschalten. Insbesondere hat der Zusatz dieser Verbindungen bei Seren bestimmter Patienten, insbesondere solcher mit hohem Gehalt an Leberenzymen, keinerlei Einfluß.
  • Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand somit darin, in dem Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Katalase und Aldehyddehydrogenase Schleichreaktionen möglichst umfassend auszuschalten und so die Bestimmungsgenauigkeit des Verfahrens bei allen Patienten zu bekommen und dieses Bestimmungsverfahren mit seinen oben geschilderten Vorteilen umfassend anwenden zu können.
  • Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Wasserstoffperoxid in biologischem Material durch Umsetzung mit einem Alkohol und Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD) bzw. Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat (NADP) in Gegenwart von Katalase und Aldehyddehydrogenase erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man die Umsetzung in Gegenwart wenigstens eines praktisch farblosen Ammoniumsalzes durchführt, das nicht oxidierend und nicht reduzierend ist und den pH-Wert des jeweiligen Testansatzes nicht unter 7,5 und nicht über 9,5, vorzugsweise nicht unter 8,0 und nicht über 9,0 hinaus verschiebt.
  • Als biologisches Material kommen beliebige Körperflüssigkeiten in Betracht, insbesondere Serum und Blut, jedoch auch Harn, durch Zellaufschluß gewonnene Flüssigkeiten oder dergleichen.
  • Die genannten Ammoniumsalze können dem Testansatz getrennt von dem Testreagens zugesetzt werden, doch ist es zweckmäßig, die Ammoniumsalze bereits dem Testreagens selbst zuzusetzen. Günstigerweise verwendet man die Ammoniumsalze in einer Menge von 5 bis 500 mMol, vorzugsweise von 20 bis 300 mMol, besonders in einer Menge von 50 bis 200 mMol je 1 Testreagens. Beispielsweise verwendet man 50 oder 100 oder 200 mMol je 1 Testreagens.
  • Als Ammoniumsalze können solche anorganischer oder organischer Säuren verwendet werden. Bevorzugt werden Ammoniumsulfat, -chlorid, -acetat, -oxalat oder -carbonat oder Diammoniumhydrogenphosphat verwendet. Besonders bevorzugt sind Ammoniumchlorid und Ammoniumsulfat. Weitere Beispiele verwendbarer anorganischer Ammoniumverbindungen sind Ammoniumbromid, Ammoniumrhodanid, Ammoniumolybdat, Ammoniumfluorophosphat, Ammoniumnitrat und Ammoniumthiosulfat.
  • Bei der Auswahl der Ammoniumverbindungen muß lediglich darauf geachtet werden, daß diese nicht durch eine Eigenfärbung die Extinktionsbestimmung beeinträchtigen, daß sie nicht in einem Maße oxidierend oder reduzierend wirken, daß dadurch das Analysenergebnis verfälscht würde, und daß sie in wäßriger Lösung nicht so stark sauer oder alkalisch reagieren, daß sie den für die Reaktion erforderlichen pH-Wert im Bereich von 8,0 bis 9,0 über diese Grenzen hinaus verschieben würden.
  • Beispielsweise Ammoniumhydroxid, Monoammoniumdihydrogenphosphat und Diammoniumhydrogencitrat sind in Konzentrationen von 100 mMol/l Testreagens nicht brauchbar, da sie zu einem pH-Wert oberhalb 10 bzw. unterhalb 7 führen. Wenn aber in der Beschreibung und den Ansprüchen davon die Rede ist, daß solche Ammoniumsalze verwendet werden sollen, daß sie den pH-Wert des jeweiligen Testansatzes nicht unter 8,0 und nicht über 9,0 hinaus verschieben, so bedeutet dies, daß die Auswahl nach dem jeweiligen Testansatz, dem jeweiligen Testreagens, insbesondere dem darin verwendeten Puffer, und der zu verwendenden Konzentration des Ammoniumsalzes auszuwählen sind. Wenn weiterhin davon die Rede ist, daß die verwendeten Ammoniumsalze nicht oxidierend oder reduzierend wirken sollen, so bedeutet auch dies, daß sie in der verwendeten Konzentration und dem verwendeten Testreagens sowie in dem zu verwendenden Testansatz nicht zu Oxidations- oder Reduktionsreaktionen führen dürfen, die das Testergebnis gegenüber dem einer quantitativen Umsetzung von H202 verfälschen würden.
  • Die gleichen Ausführungen gelten auch für die Ammoniumsalze organischer Säuren, wobei der jeweilige Säurerest beispielsweise aus einer aliphatischen oder aromatischen oder heterocyclischen Monocarbonsäure oder Dicarbonsäure stammen kann. Aliphatische Mono-und Dicarbonsäuren mit 1 bis 20, vorzugsweise 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, besonders mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sind bevorzugt. Unter den aromatischen Carbonsäuren sind beispielsweise Benzoesäure und deren durch Halogenatome, Nitrogruppen, Hydroxylgruppen, Alkylgruppen (besonders mit 1 bis 10 vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen), Carboxz gruppen und andere Substituenten substituierte Derivate zu nennen. Der Benzoesäurerest kann gewöhnlich mit bis zu 3 dieser Gruppen substituiert sein. Spezielle Beispiele von Ammoniumsalzen organischer Säuren sind Ammoniumoxalat, Ammoniumacetat, Ammoniumbenzoat, Ammoniumtartrat und die Ammoniumsalze der hierzu homologen Säuren.
  • Als Alkohol können in dem Verfahren besonders Methanol, Äthanol oder Propanol verwendet werden.
  • Äthanol ist hiervon bevorzugt.
  • Es wurde gefunden, daß durch den Zusatz wenigstens eines der angegebenen Ammoniumsalze Schleichreaktionen auch in solchen Fällen beseitigt werden können, wo die Zusatzstoffe gemäß der DE-OS 27 18588 erfolglos blieben. Besonders wichtig ist das beanspruchte Verfahren für die Bestimmung von Harnsäure, da dort in besonderem Maße Fälle auftreten, die zu Schleichreaktionen neigen. Bei der Bestimmung der Harnsäure wird dem enzymatischen Gemisch zusätzlich zu Katalase und Aldehyddehydrogenase in bekannter Weise als Starter Uricase zugesetzt. Im Falle der Glucosebestimmung wird die Reaktion durch Glucoseoxidase und im Falle der Cholesterinbestimmung durch Cholesterinoxidase gestartet.
  • Als Aldehyddehydrogenase kann beispielsweise Oxidoreduktase E.C. 1.2.1.3., E.C. 1.2.1.4., E.C. 1.2.1.5., E.C. 1.2.1.7., E.C. 1.2.1.8. oder E.C. 1.2.1.1. verwendet werden.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren kann nach dem kinetischen Bestimmungsverfahren oder nach dem Endwert-Bestimmungsverfahren durchgeführt werden.
  • Im ersteren Fall dient die Geschwindigkeit der Reaktion als Meßgröße, im letzteren Fall wird die Konzentration des Wasserstoffperoxids nach Ablauf der Reaktion mit Hilfe des Extinktionskoeffizienten ermittelt, wobei. da der Extinktionskoeffizient von NADH und NADPH hinreichend bekannt ist, keine Standardlösung mitgeführt werden muß.
  • Da die Reaktion im pH-Bereich von 8,0 bis 9,0 durchgeführt werden muß, ist es üblich, dem Testansatz bzw. bereits dem Testreagens einen üblichen Puffer pH 8,0 bis 9,0 zuzusetzen. Gute Ergebnisse werden mit Diphosphatpuffer (K4P207/KCI) erzielt. Die übrigen Verfahrensbedingungen, wie Zeit, Temperatur und dergleichen, entsprechen jenen, die in der DE-OS 2450726 beschrieben sind. Zweckmäßig erfolgt die Bestimmung bei Raumtemperatur.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Reagens zur Durchführung des obigen Verfahrens. Dieses Reagens enthält Katalase, Aldehyddehydrogenase, einen Alkohol, NAD bzw. NADP und Puffer und ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich wenigstens ein praktisch farbloses Ammoniumsalz enthält, das nicht oxidierend und nicht reduzierend ist und den pH-Wert des jeweiligen Testansatzes nicht unter 7,5 und nicht über 9,5 hinaus verschiebt.
  • Zweckmäßig enthält das Reagens nach der Erfindung das Ammoniumsalz oder die Ammoniumsalze in einer Menge von 5 bis 500 mMol, vorzugsweise 20 bis 300 mMol, besonders 50 bis 200 mMolje 1 des Reagens.
  • Ein besonders bevorzugtes Reagens der obengenannten Art enthält 300 bis 2000 kUlI Katalase, 100 bis 1000 U/l Aldehyddehydrogenase, 0,25 bis 2,5 Mol/l Äthanol, 0,25 bis 1,5 mMol/l NAD oder NADP, 25 bis 120 ruMolil Puffer pH 8,0 bis 9,0 und 5 bis 500 mMol/l Ammoniumsalz.
  • Zweckmäßig enthält dieses Reagens als Stabilisatoren zusätzlich 5 bis 500 mMol/l Äthylendiamintetraessigsäure oder deren Alkalisalze, 0,5 bis 50 mMol Glycin und 0,001 bis 1% (Gew. pro Vol.) Albumin.
  • Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
  • Beispiele 1 bis 9 Die folgenden Beispiele wurden nach dem Endwert-Verfahren und unter Verwendung der folgenden Reagenzien durchgeführt: NADP 1,06 mMoVl Katalase 17,5 x 102 kUlI Aldehyddehydrogenase 250 Ull Äthylendiamintetraessigsäure-Natriumsalz 67 mMol/l Glycin 3,33 mMoVl Albumin 0,0125% (Gew. pro Vol) Reagens 2 Uricase aus Schweineleber (l;1 x 104 LilI) Bestimmungsansatz Meßstrahlung: Hg 334 nm, 340 nm, Hg 365 nm, Schichtdicke der Küvette 1 cm, Inkubationstemperatur: Raumtemperatur.
  • 2,0 ml Reagens 1 werden in die Küvette pipettiert, 0,1 ml Probe wird zugesetzt und vermischt Die Extinktion wird ca. 5 min lang registriert, auf den Zeitpunkt der Zugabe des Reagens 2 extrapoliert, und E1 wird bestimmt. 10 ul Reagens 2 werden zugemischt.
  • Die Extinktion wird ca. 15 min registriert, durch Extrapolation auf den Zeitpunkt der Zugabe von Reagens 2 extrapoliert, und E2 wird ermittelt.
  • Berechnung der Konzentration (c) der Harnsäure im Serum: Reagens 1 C= (E2-E1) . 3,4tmMol/l ( = Hg334 nm) K4P207/KC1-Puffer je 42 mMolll, pH 8,5 C = (E2 - E1). 3,35 mMol/l (A = Hg 340 nm) Äthanol 1,43 mMol/l C= (E2-E1) ' 6,03 mMol/l (A = Hg 365 nm, NADP) Probenmaterial: Serum Bsp. Nr. Probe Coenzym Zusatzmittel, mol/l Schleichreaktion E/min 1 Serum 1 NADP NH4CI (lOOmMol/l) 0,000 2 Serum 1 NADP - 0,004 3 Serum 1 NADP (NH4)2(SO4) (200 mMol/l) 0,000 4 Serum 2 NAD (NH4)2HPO4 (100mMol/l) 0,000 5 Serum 2 NADP (NH4)2HPO4 (lOOmMol/l) 0,000 6 Serum 2 NADP - 0,002 7 Serum 2 NAD - 0,004 8 Serum 3 NADP NH4CH300- (1SOmMol/l) 0,000 9 Serum 3 NADP - 0,003 Aus den Beispielen 1 bis 9 geht hervor, daß die Schleichreaktionen durch Zusatz der untersuchten Ammoniumsalze voll unterdrückt werden können.

Claims (1)

  1. Patentansprüche: 1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Wasserstoffperoxid in biologischem Material durch Umsetzung mit einem Alkohol und Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD) bzw. Nicotin-amid-adenin-dinucleotid-phosphat (NADP) in Gegenwart von Katalase und Aldehyddehydrogenase, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in Gegenwart wenigstens eines praktisch farblosen Ammoniumsalzes durchführt, das nicht oxidierend und nicht reduzierend ist und den pH-Wert des jeweiligen Testansatzes nicht unter 7,5 und nicht über 9,5 hinaus verschiebt 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das bzw. die Ammoniumsalz(e) in einer Menge von 5 bis 500 mMol, vorzugsweise 20 bis 300 mMol, besonders 50 bis 200 mMol je Liter Testreagens verwendet.
    3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Ammoniumsulfat, -chlorid, -acetat, -oxalat oder -carbonat oder Diammoniumhydrogenphosphat verwendet 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Ammoniumsalz verwendet, das den pH-Wert des jeweiligen Test- ansatzes nicht unter 8,0 und nicht über 9,0 hinaus verschiebt 5. Reagens zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 3, enthaltend Katalase, Aldehyddehydrogenase, einen Alkohol, NAD bzw. NADP und Puffer, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich wenigstens ein praktisch farbloses Ammoniumsalz enthält, das nicht oxidierend und nicht reduzierend ist und den pH-Wert des jeweiligen Testansatzes nicht unter 7,5 und nicht über 9,5 hinaus verschiebt 6. Reagens nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es das bzw. die Ammoniumsalz(e) in einer Menge von 5 bis 500 mMol, vorzugsweise 20 bis 300 mMol, besonders 50 bis 200 mMol je Liter Reagens enthält.
    7. Reagens nach Anspruch 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß es 300 bis 2000 kUlI Katalase, 100 bis 1000 Ull Aldehyddehydrogenase, 0,25 bis 2,5 Mol/l Äthanol, 0,25 bis 1,5 mMol/Liter NAD oder NADP, 25 bis 120 mMol/Liter Puffer pH 8,0 bis 9,0 und 5 bis 500 mMol/Liter Ammoniumsalz enthält.
    8. Reagens nach Anspruch 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich 5 bis 500 mMoVLiter Äthylendiamintetraessigsäure, deren Alkalisalz oder Nitrilotriessigsäure, 0,5 bis 50 mMoVLiter Glycin und 0,001 bis 1% (Gew. pro Vol) Albumin enthält Die Bestimmung der Wasserstoffperoxidkonzentration in biologischen Materialien spielt in medizinischen Laboratorien, insbesondere in der klinischen Chemie, eine zunehmend wichtige Rolle als Indikatorreaktion bei verschiedenen Analyseverfahren. Beispielsweise kann Glucose in der Form von Blutzucker mit Hilfe von Glucoseoxidase in Gluconsäure und Wasserstoffperoxid, Harnsäure mit Hilfe von Uricase durch Umsetzung mit 2 Mol Wasser und 1 Mol Sauerstoff in Allantoin und Wasserstoffperoxid und Cholesterin mit Hilfe von Cholesterinoxidase mit 1 Mol Wasser und 1 Mol Sauerstoff in a4-Cholestenon und Wasserstoffperoxid überführt werden. Mit der quantitativen Bestimmung der Wasserstoffperoxidkonzentration kann man somit die Glucosekonzentration, Harnsäurekonzentration bzw. Cholesterinkonzentration in der wäßrigen Ausgangslösung bestimmen.
    Aus der DE-OS 2450726 ist ein gegenüber früheren Bestimmungsmethoden verbessertes enzymatisches Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Wasserstoffperoxid in biologischen Materialien bekannt, bei dem das Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Katalase und Aldehyddehydrogenase mit Alkohol unter Bildung des entsprechenden Aldehyds und dieser seinerseits mit Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD) bzw. Nicotinamid-adenin-dinuclenotid-phosphat (NADP) umgesetzt wird. Das Verfahren verläuft nach dem folgenden Reaktionsschema: Die Bildung von NADH bzw. NADPH, die an der Extinktionszunahme bei 340 nm, Hg 334 nm oder Hg 365 nm gemessen wird, ist der gebildeten Wasserstoffperoxidmenge proportional.
    Dieses Verfahren hat den Vorteil eines überraschend schnellen Reaktionsablaufes und einer geringen Störanfälligkeit gegenüber Verunreinigungen im Analysenansatz, insbesondere gegenüber Ascorbinsäure. Der schnelle Reaktionsablauf macht das Verfahren geeignet für schnellaufende Analysenautomaten nach der kinetischen Bestimmungsmethode und für die Endwert-Bestimmungsmethode.
    Es hat sich aber gezeigt, daß bei bestimmten Krankheitsbildern Schleichreaktionen auftreten, die die Bestimmungsgenauigkeit teilweise erheblich beeinträchtigen, da bereits vor der Zugabe des als Starter dienenden Enzyms NADH bzw. NADPH gebildet wird und auch nach Umsetzung des gesamten Wasserstoftperoxids die Reaktion unter Bildung von NADH bzw NADPH noch nicht zum Stillstand kommt. In solchen Fällen läßt sich daher die Extinktionsdifferenz nicht genau feststellen, so daß auch das Analysenergebnis ungenau wird, da dieses an Hand der Extinktionsdifferenz berechnet wird.
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