DE2450726C3 - Verfahren zur enzymatischen quantitativen Bestimmung von Wasserstoffperoxid - Google Patents

Verfahren zur enzymatischen quantitativen Bestimmung von Wasserstoffperoxid

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Description

Die Bestimmung der Wasserstoffperoxidkonzeniration spielt in medizinischen Laboratorien, insbesondere m der klinischen Chemie eine zunehmend wichtige Rolle als Indikatorreaktion bei verschiedenen Analysenverfahren. Beispielsweise kann Glucose (Blutzucker) mit Hilfe von Glucoseoxidase durch Umsetzung mit 1 MoI Wasser und 1 Mol Sauerstoff in Gluconsäure und Wasserstoffperoxid, Harnsäure mit Hilfe von Uricase durch Umsetzung mit 2 Mol Wasser und 1 Mol Sauerstoff in Allantoin, Kohlendioxid und Wasserstoffperoxid und Cholesterin mit Hilfe von Choleslcrinoxidase mit 1 Mol Wasser und I Mol Sauerstoff in /J4-Cholestenon und Wasserstoffperoxid überführt werden.
Über die Bestimmung der Wasserstoffperoxidkonzentration kann man somit beispielsweise die Glucosekonzentration. Harnsäurekonzentration bzw. Cholesterinkonzentration in der Ausgangslösung bestimmen. Dabei wurden bisher vorwiegend zwei Indikalorreak tionen angewendet.
Bei der Glucoscbestimmung v/urde das gebildete Wasserstoffperoxid unter der katalytischcn Wirkung von Pcroxidase mn einem reduzierten Wasserstoffdo nator. /. B. o-Dianisidm. umgeset/i Die Konzentration des dabei gebildeten Farbstoffes wurde gewöhnlich durch die Lichtabsorption der Losung nach der Umsetzung bei einer bestimmten Wellenlänge ermittelt. Da aber der hxtinktionskoeffizient des gebildeten Farbstoffes nicht bekannt ist. mußte hierzu in jeder Testserie eine Standardlösung mit analysiert werden, was das Testverfahren umständlich und aufwendig machte. Außerdem wurden die Ergebnisse dieses Verfahrens durch Verschiedene Störstoffe, wie Ascorbinsäure, gestöri, so daß es beispielsweise für Urinanaly· sen nicht brauchbar war.
Eine aus »Clin. Chim. Ada«, 31, Seiten 421 bis 426 (1971), Und »Z. Klin. Chcm. Klin. Biochem.«, 12, Seile 226 (1974), bekannte Indikatorreaklion bei der Bestimmung von HarnsSure oder Cholesterin war die Umsetzung des in der Reaktion gebildeten Wasserstoffperoxids mit Methanol unter Einwirkung von Katalase, wobei sich Formaldehyd und Wasser bildete. Der Formaldehyd wurde mit CH3COCH2COCH3 und Ammoniak unter Bildung von 3,5-Diacetyl-l,4-dihydrolutidin umgesetzt Dieser Farbstoff wurde dann wiederum photomelrisch gemessen, und zwar mit Licht einer Wellenlänge von 410 nm.
ίο Auch der Extinktionskoeffizient dieses Farbstoffes ist nicht bekannt, so daß wiederum in jeder Restserie eine Standardlösung mit analysiert werden mußte. Außerdem war der Reaktionsablauf sehr langsam und dauerte bei Serumanalysen etwa 60 Minuten, und es traten auch hier Störinterferenzen durch die hohen Konzentrationen an Ascorbinsäure auf.
Aus der GB-PS 10 67 238 ist ein Glucosebestimmungsverfahren bekannt, bei dem die Glucose mittels Glucoseoxidase in Gluconsäure und Wasserstoffperoxid
IQ .rVarrtiItAn witrA Hoc Waccorct^rfner/wi/t luii-rl mti ΜΪΙΓα
— gkfiipuiVWII "" w> l^HU »« HUUW* UlWI ■ ^WI VTmW π>·κ ■ ·!·» ■ ■■,,«·
von Katalase mit Alkohol unter Bildung von Aldehyd und Wasser umgesetzt Letzteres wird dann mit einem farbbildenden Reagens umgesetzt, und dieses wird kolorimetrisch bestimmt. Auch für dieses Reaktionsschema gelten die bereits angeführten Nachteile, daß eine Standardlösung mitgeführt werden muß und daß Störinterferenzen auftreten.
Aus »Methoden der enzymatischen Analyse«, 2. Auflage, Band 2, 1970, Seite 1467, ist es weiterhin bekannt. Acetaldehyd mit NAD in Gegenwart von Aldehyddehydrogenase zu Acetat und NADH umzusetzen. In dieser Literaturstelle ist ausdrücklich gesagt, daß eine quantitative Oxidation von Acetaldehyd bei dieser Reaktion nicht möglich sei, weswegen als Meßgröße die Reaktionsgeschwindigkeit diene, d. h. dieses Verfahren ausschließlich als kinetische Bestimmungsmethode durchführbar sei. Tatsächlich ist bei Nacharbeitung dieser Methode festzustellen, daß selbst in mehreren Stunden die Reaktion noch keinen Endpunkt erreicht, so daß diese Literaturstelle keine Anregung für ein in der Praxis anwendbares Verfahren geben konnte.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand somit darin, eine enzymatische Bestimmungsmethode für H.'Ch zu bekommen, welche einen möglichst raschen quantitativen und störungsfreien Reaktionsabiauf gewährleistet.
Das crfindungsgemäße Verfahren zur enzymatischen quantitativen Bestimmung von Wasserstoffperoxid durch mit Katalase katalysierte Umsetzung des
w Wasserstoffperoxids nut einem Alkohol ist dadurch gekennzeichnet, daß man den dabei gebildeten Aldehyd in Anwesenheit der Katalase und des Alkohols in Gegenwart von Aldehvddehydrogenase mit der oxidierten form von Nicotinamidadenindinucleotid (NAD) oder von Micotinamidadenindinucleotidphosphat (MADP) umsetzt und nach Ablauf der Reaktion mit Hilfe des bekannten F.xtinktionskoeffizienten von NADH bzw NADPH die Konzentration dieser redu/icrten formen (N ADH bzw NADPH) bestimmt.
ho Da der Extinktionskoeffizient von NADH bzw. NADPH bekannt ist, ist es nicht erforderlich, eine Standardlösung mitzuführen.
Weitere Vorteile sind die, daß der Reaktoinsablauf rasch ist und daß die Reaktionen nicht durch Stöfstoffe gestört werden, insbesondere nicht solche, die in üblichen biologischen Medien, wie Urin* und Serumpräben, enthalten sind, wie beispielsweise Ascorbinsäure.
Die beiden in dem Verfahren nach der Erfindung
ablaufenden Reaktionen lassen sich durch folgende Reaktionsgleichungen wiedergeben:
Katalase
HiO2 + Alkohol
Aldehyd + NAD(P) +
Aldehyd H- 2H1O
Als Aldehyddehydrogenasen können beispielsweise folgende verwendet werden:
Aldehyd: NAD Oxidoreductase EC 1,ZU. ίο
Aldehyd: NADP Oxidoreductase EC. 1.2.1.4.
Aldehyd: NAD(P) Oxidoreductase E.C. 1.2.15.
Benzaldehyd: NADP Oxidoreductase EC. 1.2.1.7. Betainaldehyd: NAD Oxidoreductase EC 121.8. Formaldehyd: N vD Oxidoreductase EC 1.2.1.1.
Beispiel
Das Beispiei betrifft die Bestimmung der Harnsäurekonzentralion. Hierzu 'vorder, folgende Reaktiop.slösungen verwendet:
1. Pyrophosphat-Puffer: Tetra-natriumdiphosphat-10-hydrat,0,l Mo!/LpH=8,6
2. Katalase 20 mg/ml
3. Uricase 2 mg/ml, täglich eine Verdünnung ansetzen: 20 μΙ + 200 μΐ zweimal destilliertes Wasser
4. NAD-Lösung 10 mg/ml
5. Äthanol
6. Aldehyddeiiydrogenase EC. 1.2.13. isoliert aus Leber, spezifische Aktivität: 0,5 U/mg Protein
Vor jeder Serie wurde ein Reaktiotisgemisch aus den Lösungen 1, 2, 4, 5 und 6 λι den folgenden Mischungsverhältnissen angesetzt:
Pyrophosphat-Puffer
Katalase
500 Teile 0,5 Teile
+ NAD(P)H + H+
NAD-Lösung
Äthanol
Aldehyddehydrogenase
20 Teile
40 Teile
etwa 25 U/ml
Von diesem Reaktionsgemisch wurden in eine Halbmikroküvette (Schichtdicke 1 cm) 500 μΐ pipettiert Danach wurden in die Halbmikroküvette 50 μΐ der zu untersuchenden Probe (Harnsäurelösung) sowie 20 μΐ Uricaselösung (Reaktionslösung 3) gegeben.
Vor der Zugabe der Uricase-Lösung wurde zunächst die Mischung aus Reaktionsmischung und zu bestimmender Probe 2 Minuten stehengelassen, um eventuell auftretende Reaktionen von Bestandteilen dieser beiden Lösungen ablaufen zu lassen. Erst dann folgte der Start der eigentlichen Reaktionen durch Zugabe der Uricaselösung. Der Ablauf der Reaktion wurde mit einem Photometer und einem Schreiber bei einer Wellenlänge von 334 nm registriert. Die Reaktion war nach etwa 3 Minuten beendet. Als Probe wurde in diesem Beispiel eine wäßrige Lösung mit einer Harnsäurekonzentration von 5000 μΜοΙ/l verwendet
Identische Resultate wurden mit der Aldehyddehydrogenase EC. 1.2.1.5. (isoliert aus Hefe nach J. F. Clark und W. B. Jakoby, Journal of Biological Chemistry, 245, 6065, 1970) und NADP erhalten. Bei diesen Versuchen wurden anstelle von Lösung 1 und 4 folgende Lösungen verwendet:
1. Pyrophosphat-Kaliumchlorid-Puffer: Tetra-natriumdiphosphat. 0.1 Mol/l, und Kaliumchlorid, 0,1 Mol/l, pH = 8,6
4. NADP-Lösung 10 mg/mJ.

Claims (2)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur enzymatischen quantitativen Bestimmung von Wasserstoffperoxid durch mit Katalase katalysierte Umsetzung des Wasserstoffperoxids mit einem Alkohol, dadurch gekennzeichnet, daß man den dabei gebildeten Aldehyd in Anwesenheit der Katalase und des Alkohols in Gegenwart von Aldehyddehydrogenase mit der oxidierten Form von Nicotinamidadenindinucleotid (NAD) oder von Nicotinamidadenindinucleootidphosphat (NADP) umsetzt und nach Ablauf der Reaktion mit Hilfe des bekannten Extinktionskoeffizienten von NADH bzw. NADPH die Konzentration dieser reduzierten Formen (NADH bzw. NADPH) bestimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man aus Harnsäure in Gegenwart von Uricase gebildetes Wasserstoffperoxid quantitativbestimmt.
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