DE4343082A1 - Mittel und Verfahren zur Bilirubin-Entstörung enzymatischer H¶2¶O¶2¶-Farbtests - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mittel und Verfahren zur Bilirubin-Entstörung von enzymatischen, über die Bildung von H₂O₂ durch Oxidasen ablaufenden Farbtests zur Bestimmung eines Analyten wie Creatinin und Harnsäure in biologischen Flüssigkeiten, wie beispielsweise Blut-Serum bzw. -Plasma.

Die Bestimmung von Creatinin und Harnsäure in Blut-Serum bzw. -Plasma spielt in der klinisch-chemischen Analyse eine wesentliche Rolle bei der Diagnose von Nieren- oder Gichterkrankungen.

Wegen ihrer außerordentlich hohen Spezifität und Genauigkeit sowie dem schnellen Ablauf unter milden Reaktionsbedingungen, üblicherweise innerhalb von ca. 5 bis ca. 10 Minuten im neutralen pH-Bereich bei Temperaturen zwischen ca. 25 bis 37°C, werden dabei bevorzugt enzymatische Methoden eingesetzt, und zwar insbesondere solche, bei denen als Endprodukt des jeweiligen Reaktionsablaufs H₂O₂ entsteht.

Das gebildete H₂O₂ läßt sich wiederum auf einfache Weise z. B. durch eine Peroxidase­ katalysierte Oxidation von Leuko-Farbstoffen, oder, besonders bevorzugt, durch die oxidative Kupplung von 4-Aminoantipyrin ("4-AAP") oder 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon ("MBTH") bzw. dessen in 6-Stellung sulfonierten Analogons ("MBTH-S") mit entweder Phenol oder Phenol- bzw. Anilin-Derivaten in Gegenwart von Peroxidase (EC 1.11.1.7) colorimetrisch quantifizieren, vgl. z. B. "Methods of Enzymatic Analysis" (H.U. Bergmeyer, Hrsg.), 3. Ausgabe, Verlag Chemie, Weinheim 1983, Band I, Seiten 210-221.

Im Falle der Creatinin- bzw. Harnsäure-Bestimmung werden aus Gründen der Nachweis­ empfindlichkeit als Kuppler für MBTH bzw. MBTH-S oder 4-AAP Phenol- oder Anilin- Derivate bevorzugt, insbesondere halogenierte Phenole wie z. B. 3,5-Dichlor-2-hydroxy­ benzolsulfonsäure, 2,4,6-Tribrom-3-hydroxy-benzoesäure ("TBHB") oder das analoge Trÿod- Derivat.

Beschreibungen von auf derartigen H₂O₂-Farbtests basierenden vollenzymatischen Creatinin- bzw. Harnsäure-Bestimmungsmethoden finden sich zum Beispiel in Fossati et al., Clin. Chem. 29, 1494-1496 (1983), Guder et al., J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 24, 889-902 (1986), Siedel et al., Anal. Letters 21, 1009-1017 (1988) (Creatinin-Tests) bzw. z. B. in Fossati et al., Clin. Chem. 26, 227-231 (1980), Town et al., J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 23, 591 (1985) sowie Gochman et al., Clin. Chem. 17, 1154-1159 (1971) (Harnsäure-Tests). Sie beruhen unter anderem auf folgenden Gesamtreaktionen:

a) Creatinin-Farbtest Variante I (Creatininase/Creatinase/Sarcosin-Oxidase-Weg, vgl. Guder et al.)

Da biologische Flüssigkeiten wie Blut-Serum bzw. -Plasma stets einen im Vergleich zu Creatinin nicht zu vernachlässigenden Gehalt an Creatin aufweisen, ist es bei dieser Reak­ tionsführung erforderlich, in einem ersten Reaktionsschritt bzw. einem ersten Reagenz ohne Creatininase nur den Abbau von Creatin zu bewerkstelligen und in einem zweiten Reaktionsschritt bzw. Reagenz mit Creatininase Creatinin zu H₂O₂ umzusetzen. Die Konzentration an Creatinin in der zu analysierenden Probe läßt sich dann unter Mit­ führen eines Creatinin-Standards (z. B. 2 mg/dl) aus der Differenz zwischen der im zwei­ ten und im ersten Reaktionsschritt gebildeten Farbstoff-Menge berechnen.

b) Creatinin-Farbtest Variante II (Creatinin-Iminohydrolase/N-Methylhydantoinase/ N-Carbamoylsarcosin-Hydrolasc/Sarcosin-Oxidase-Weg, vgl. Siedel et al.)

c) Harnsäure-Farbtest (vgl. Town et al.)

Ein seit langem bekanntes Problem bei der Anwendung derartiger H₂O₂-Farbtests, insbe­ sondere bei der Analyse von Blut-Serum bzw. -Plasma, ist ihre Störanfalligkeit gegenüber Bilirubin, das konzentrationsabhängig aufgrund eines unspezifischen H₂O₂-Verbrauchs, ins­ besondere in Gegenwart von Peroxidase, zu verminderten Farbstoffausbeuten führt und damit das Meßergebnis z. T. stark verfälschen kann, vgl. z. B. Witte et al., Clin. Chem. 24, 1778-1782 (1978).

In Fällen von über die H₂O₂-Bildung ablaufenden Farbtests für vergleichsweise hoch kon­ zentrierte Blut-Serum- bzw. Plasma-Bestandteile wie z. B. Gesamtcholesterin (Normalkon­ zentration im Serum ca. 5,5 mmol/l, Bestimmung z. B. mit der "ChOD-PAP-Methode", Boeh­ ringer Mannheim GmbH, Kat.-Nr. 1 489 437) kann diese Störung weitgehend durch die Ver­ wendung eines möglichst niedrigen Probe- zu Reagenzvolumen-Verhältnisses d. h. 1 : 100, umgangen werden.

Wenn dagegen niedrige Analytkonzentrationen bestimmt werden müssen, wie dies eben unter anderem bei Blut-Serum- bzw. -Plasma-Creatinin oder -Harnsäure der Fall ist (Konzentration im Normal- bzw. Entscheidungsbereich ca. 0,09 bzw. ca. 0,2-0,4 mmol/l), und aus Gründen der Meßgenauigkeit ein Probe- zu Reagenzvolumenverhältnis von ca. 1 : 30 bis 1 : 40 (v/v) eingehalten werden muß, können schon Serum- oder Plasma-Bilirubinmengen ab ca. 2 mg/dl zu einer um mehr als 10% erniedrigten Wiederfindung im Farbtest führen.

Ein mit am häufigsten angewandtes Mittel zur Reduzierung der Bilirubin-Interferenz in enzy­ matischen H₂O₂-Tests ist der Zusatz von Kaliumhexacyanoferrat(II) (K₄[Fe(CN)₆]) zum jeweiligen Testreagenz, wobei üblicherweise K₄[Fe(CN)₆]-Konzentrationen von ca. 5 bis maximal 50 µmol/l (Endkonzentration im Testansatz) eingesetzt werden; vgl. z. B. Nägele et al., Methods in Enzymatic Analysis (H.U. Bergmeyer, Hrsg.) 3. Ausgabe, Verlag Chemie, Weinheim 1985, Band VIII, Seiten 12-18 (Triglycerid-Farbtest, "GPO-PAP-Methode"), Fossati et al., Clin. Chem. 29, 1494-1496 (1983) bzw. Guder et al., J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 24, 889-902 (1986) (Creatinin-Farbtest), sowie Fossati et al., Clin. Chem. 26, 227-231 (1980) (Harnsäure-Farbtest).

Mit derartigen Konzentrationen gelingt zwar eine ausreichende Bilirubinentstörung bis zu etwa 10 mg Bilirubin/dl in enzymatischen Farbtests für z. B. die Bestimmung von Serum- bzw. Plasma-Triglyceriden (GPO-PAP-Methode, vgl. Nägele et al.), im Falle der Creatinin- oder Harnsäure-Bestimmung wird damit jedoch keine ausreichende Farbtest-Störfreiheit erreicht. Unter Störfreiheit ist dabei zu verstehen, daß die Analyt-Wiederfindung im Normal- bzw. Entscheidungs-Konzentrationsbereich um nicht mehr als 10% vom wahren, mit einer unab­ hängigen Referenzmethode gemessenen Wert abweicht.

Da aber gerade Blut-Serum- bzw. -Plasma-Bestandteile wie unter anderem Creatinin oder Harnsäure häufig in Proben bestimmt werden müssen, die zugleich stark ikterisch sind, d. h. z. T. Bilirubin-Konzentrationen von über 10 bis 15 mg/dl aufweisen, besteht der Bedarf an einem Mittel und Verfahren, das eine Bilirubin-Entstörung der entsprechenden, über einen H₂O₂-Farbtest ablaufenden Bestimmungsmethoden mindestens bis zu diesem Bilirubin-Kon­ zentrationsbereich ermöglicht.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß Kaliumhexacyanoferrat(II) dem jeweiligen Testreagenz in Konzentrationen von mindestens 0,1 mmol/l bis ca. 10 mmol/l, ins­ besondere von 0,15 mmol/l bis ca. 6 mmol/l (Endkonzentration im Testansatz) zugesetzt wird. Ganz besonders bevorzugt wird Kaliumhexacyanoferrat(II) in einem Bereich von 0,2 mmol/l bis ca. 3 mmol/l zugesetzt.

Der Zusatz von K₄[Fe(CN)₆] kann zum kompletten, beide der genannten Farbkuppler- Substanzen zugleich enthaltenden Testreagenz erfolgen. Dabei kann sich das Reagenz auf­ grund einer durch K₄[Fe(CN)₆]-induzierten, unspezifischen Farbkupplung jedoch gelegentlich einfärben.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens bzw. Reagenzes besteht daher darin, daß die Reagenzmischung in zwei Komponenten aufgeteilt wird.

In einem ersten Teilreagenz ("R1") können entweder die Komponenten für eine Vorab­ reaktion - wie zum Beispiel für Creatin im Falle des Creatinin-Farbtests nach Variante I - oder für die Ermittlung eines Probenleerwerts enthalten sein. Mit einem zweiten Teilreagenz ("R2") erfolgt die eigentliche Nachweisreaktion. Das Reagenz für die Nachweisreaktion enthält insbesondere das für den zu bestimmenden Analyten spezifische Enzym. Kaliumhexa­ cyanoferrat(II) kann dabei in R1 und/oder R2 enthalten sein, wobei die oben beschriebenen Konzentrationsangaben einzuhalten sind.

Beispielsweise enthält R1 für die Bestimmung von Creatinin nach Variante I sämtliche für die Creatin-Abreaktion erforderlichen Komponenten, d. h. die Enzyme Creatinase, Sarcosin- Oxidase und Peroxidase sowie geeignete Farbstoff-Kupplungssubstanzen wie beispielsweise 4-AAP und TBHB. Bevorzugt wird in diesem Fall Kaliumhexacyanoferrat(II) zu R2 zuge­ setzt. R2 enthält bevorzugt lediglich das Enzym Creatininase in geeigneten Puffersystemen. Ein geeignetes Puffersystem ist beispielsweise Kalium- oder Natrium-Phosphatpuffer, in Konzentrationen von ca. 10 bis 100 mmol/l, bevorzugt von 20 bis 50 mmol/l, mit einem pH- Wert von ca. 7,5 bis 8,5, bevorzugt von ca. 7,8 bis 8,2.

Es besteht jedoch auch die Möglichkeit, in R1 lediglich einen der beiden Farbkuppler, bevorzugt insbesondere ein Phenol- oder Anilin-Derivat, vorzulegen und den zweiten Farbkuppler, bevorzugt 4-AAP, R2 zuzufügen. In diesem Fall kann der Kaliumhexacyano­ ferrat(II)-Zusatz zu entweder R1 und/oder R2 erfolgen.

Im Fall z. B. des Creatinin-Tests nach Variante H kann das zweite Teilreagenz anstelle von oder neben Enzymen andere zum Start der Nachweisreaktion erforderliche Bestandteile wie entweder ATP oder Magnesium-Ionen enthalten. Kaliumhexacyanoferrat wird dabei bevor­ zugt im Zweikomponentensystem derjenigen Reagenzkomponente zugesetzt, die entweder keinen oder nur einen der beiden Farbkuppler enthält.

Beim Harnsäure-Test enthält R1 bevorzugt nur einen der beiden Farbkuppler wie insbeson­ dere ein Phenol- oder Anilin-Derivat, bevorzugt TBHB, während sich die restlichen für die enzymatische Bestimmung von Harnsäure erforderlichen Komponenten, d. h. Uricase, Peroxi­ dase und 4-AAP (s. S. 3 oben) in R2 befinden. Außerdem können sowohl in R1 als auch in R2 geeignete Puffersubstanzen wie beispielsweise Natrium- oder Kalium-Phosphat in Konzentra­ tionen von 20 bis 150 mmol/l, insbesondere von 50 bis 100 mmol/l, mit einem pH- Wert von ca. 7,0 bis 8,5, bevorzugt von 7,5 bis 8,0, enthalten sein.

Außerdem können die Teilreagenzien bzw. das Reagenz weitere Zusätze wie unter anderem oberflächenaktive Mittel, beispielsweise Triton® X-100 (Isooctylphenol-Polyethylenglycol­ ether) oder Thesit® (n-Dodecanol-Polyethylenglycolether) in Konzentrationen von 2 bis 10 g/l, bevorzugt von 3 bis 6 g/l, enthalten.

Der erfindungsgemäße Zusatz von K₄[Fe(CN)₆] kann auch für andere, auf H₂O₂-liefernden Oxidase-Reaktionen basierenden Farbtests zur Analyt-Bestimmung in biologischen Flüssig­ keiten, insbesondere in Blut-Serum bzw. -Plasma, wie z. B. von Theophyllin (Theophyllin- Oxidase-Reaktion), Lactat (Lactat-Oxidase-Reaktion), Oxalat (Oxalat-Oxidase-Reaktion) usw. angewandt werden; die entsprechenden Reaktionen bzw. Testansätze sind dem Fachmann geläufig und bedürfen hier keiner näheren Erläuterung.

Abb. 1 zeigt die Störung von Bilirubin bei der Bestimmung von Creatinin, wobei o 4 µmol/l Kaliumhexacyanoferrat(II) (Stand der Technik),
Δ mit K₄[Fe(CN)₆], 0,76 mmol/l (Endkonzentration) in R1
+ mit K₄[Fe(CN)₆], 0,23 mmol/l (Endkonzentration) in R2 miteinander verglichen sind.

Abb. 2 zeigt die Störung von Bilirubin bei der Bestimmung von Harnsäure, wobei
49 µmol/l K₄[Fe(CN)₆] und
o mit K₄[Fe(CN)₆], 0,82 mmol/l (jeweils Endkonzentration) in R1 miteinander verglichen sind.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher.

Beispiel 1

Bestimmung von Creatinin gemäß Farbtest-Variante I in einem mit Bilirubin-Ditaurat zu Konzentrationen entsprechend bis zu 20 mg Bilirubin/dl aufgestocktem Humanserum.

Die Messungen wurden mit einem handelsüblichen, vollenzymatischen Creatinin-Farbtest (Creatinin PAP, Boehringer Mannheim GmbH, Kat.-Nr. 1178 652) ohne bzw. mit dem erfin­ dungsgemäßen K₄[Fe(CN)₆]-Zusatz zu entweder R1 oder R2 mit einem BM/Hitachi 717- Analysengerät und den dafür in der Arbeitsanleitung angegebenen Geräteeinstellungen bei 37°C durchgeführt (Probevolumen 10 µl, R1-Volumen 250 µl, R2-Volumen 50 µ, Wellen­ längen 700-505 nm, Kalibration mit "calibrator for automated systems", Boehringer Mann­ heim GmbH, Kat.-Nr. 759 350).

In der handelsüblichen Form enthält der Farbtest in R1 K₄[Fe(CN)₆] in einer Konzentration von 5 mmol/l entsprechend einer Endkonzentration im kompletten Testansatz von 4,0 µmol/l; in der erfindungsgemäßen Ausführung wurde K₄[Fe(CN)₆] (in Form des Trihydrats, MW 422,4) zum einen zu R1 in einer Menge von 4 mg/10 ml entsprechend einer Endkonzentration im kompletten Testansatz von 0,76 mmol/l, zum andern zu R2 in einer Menge von 3 mg/5 ml entsprechend einer Endkonzentration im kompletten Testansatz von 0,23 mmol/l zugefügt.

Wie aus der Abb. 1 zu ersehen ist, führt der Bilirubin-Zusatz zu dem Humanserum (Creatinin in einer Konzentration von 1,5 mg/dl enthaltend) mit dem handelsüblichen Creatinin-Faibreagenz mit 4,0 µmol K₄[Fe(CN)₆]-Endkonzentration im Test bereits ab ca. 3 mg/dl Bilirubin zu einer um mehr als 10% gegenüber dem unaufgestockten Serum ernied­ rigten Wiederfindung, während mit dem erfindungsgemaßen Zusatz von K₄[Fe(CN)₆] sowohl zu R1 als auch R2 die Wiederfindungsgrenze von 90% erst ab einer Bilirubin-Konzentration von ca. 17-20 mg/dl unterschritten bzw. erreicht wird.

Für die Praxis ist in diesem Fall der erfindungsgemäße K₄[Fe(CN)₆]-Zusatz zu R2 vor­ zuziehen, da dieses Reagenz lediglich aus einer wäßrigen, gepufferten sowie geringe Mengen an Tensid (Triton® X-100, 0,3%) enthaltenden Creatininase-Lösung besteht, mithin auch über längere Aufbewahrungsdauer keine Verfärbung stattfinden kann (die bei Vermischen von R1 mit R2 im Analysengerät auftretende Reagenzleerwert-Färbung ist über die Inkubations­ zeit von max. 5 min hinweg auch bei einer Meßtemperatur von 37°C dem handelsüblichen Reagenz praktisch vergleichbar und verschwindend gering).

Beispiel 2

Bestimmung von Harnsäure gemäß Farbtest c) in einem mit Bilirubin-Ditaurat zu Konzen­ trationen entsprechend bis zu 20 mg Bilirubin/dl aufgestocktem Humanserum.

Die Messungen wurden mit einem handelsüblichen vollenzymatischen Harnsäure-Farbtest (Harnsäure PAP, Boehringer Mannheim GmbH, Kat.-Nr. 1 446 819) zum einen ohne, zum anderen mit dem erfindungsgemäßen K₄[Fe(CN)₆]-Zusatz zu R1 mit einem BM/Hitachi 717- Analysengerät und den dafür in der Arbeitsanleitung angegebenen Geräte-Einstellungen bei 37°C durchgeführt (Probevolumen 7 µl, R1-Volumen 250 µl, R2-Volumen 50 µl, Wellen­ längen 660-505 nm, Kalibration mit "calibrator for automated systems", Boehringer Mann­ heim GmbH, Kat.-Nr. 759 350).

In beiden Fallen wurde den Reagenzien R1 außerdem noch ein Tensid (Thesit®, n-Dodeca­ nol-Polyethylenglycolether) in einer Konzentration von jeweils 5,0 g/l zugefügt.

In der handelsüblichen Form enthält der Farbtest in R2 K₄[Fe(CN)₆] in einer Konzentration von 0,3 mmol/l entsprechend einer Endkonzentration im kompletten Testansatz von 49 µmol/l; in der erfindungsgemäßen Ausführung wurde K₄[Fe(CN)₆] (in Form des Trihy­ drats, s. o.) zu R1 in einer Menge von 8 mg/20 ml zugefügt entsprechend einer End­ konzentration im kompletten Testansatz von 0,77 mmol/l + 0,049 mmol/l = 0,82 mmol/l.

Wie aus der Abb. 2 zu ersehen ist, führt der Bilirubin-Zusatz zu dem Humanserum (Harnsäure in einer Konzentration von 6,8 mg/dl enthaltend) mit dem handelsüblichen, mit Tensid versetzten Harnsäure-Farbreagenz mit 49 µmol K₄[Fe(CN)₆]-Endkonzentration im Test bereits ab ca. 7,5 mg/dl Bilirubin zu einer um mehr als 10% gegenüber dem unauf­ gestockten Serum erniedrigten Wiederfindung, während mit dem erfindungsgemäßen Zusatz von K₄[Fe(CN)₆] zu R1 die Wiederfindungsgrenze von 90% erst bei einer Bilirubin- Konzentration von ca. 20 mg/dl erreicht wird.

Da im vorliegenden Harnsäure-Test die beiden Farbkuppler TBHB und 4-AAP getrennt voneinander in R1 (TBHB) bzw. R2 (4-AAP) vorliegen, kann der erfindungsgemäße Zusatz von K_R4[Fe(CN)₆] alternativ sowohl in R1 als auch R2 erfolgen, ohne daß sich das Ergebnis der Bilirubinentstörung ändert.

Claims (19)

1. Verfahren zur colorimetrischen enzymatischen Bestimmung eines Analyten in biologi­ schen Flüssigkeiten mittels einer H₂O₂-bildenden Oxidase und Nachweis des gebildeten H₂O₂ durch eine Peroxidase-abhängige Farbreaktion, dadurch gekennzeich­ net, daß man der Testreagenzlösung mindestens 0 1 mmol/l (Endkonzentration) Kaliumhexacyanoferrat(II) zusetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Kaliumhexacyanoferrat(II) in Konzentrationen von ca. 0,2 bis 10 mmol/l zusetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Testreagenzlösung aus einem ersten Reagenz (R1) zur Bestimmung des Probenleerwerts und aus einem zweiten Reagenz (R2) für die Analyt-Nachweisreaktion besteht und Kaliumhexacyanoferrat(II) in R1 und/oder R2 enthalten ist.

4. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Farbreaktion die Peroxidase-katalysierte Kupplung von 4-Aminoantipyrin oder 3-Me­ thyl-2-benzothiazohnon-hydrazon bzw. 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon-6-sulfon­ säure mit entweder Phenol oder einem Phenol- bzw. Anilin-Derivat verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Phenol- Derivat 2,4,6-Tribrom-3-hydroxybenzoesäure, 2,4,6-Trÿod-3-hydroxybenzoesäure oder 3,5-Dichlor-2-hydroxybenzolsulfonsäure verwendet wird.

6. Verfahren nach Ansprüchen 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Farbkupplungskomponenten 4-Aminoantipyrin oder 3-Methyl-2-benzothiazolinon- hydrazon bzw. 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hvdrazon-6-sulfonsäure einerseits und Phenol oder das Phenol- bzw. Anilin-Derivat andererseits gemeinsam zu R1 zuge­ setzt werden.

7. Verfahren nach Ansprüchen 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß man getrennt voneinander Phenol oder das Phenol- bzw. Anilin-Derivat zu R1 und 4-Aminoantipyrin oder 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon bzw. 3-Methyl-2-benzo­ thiazolinon-hydrazon-6-sulfonsäure zu R2 zusetzt.

8. Verfahren nach Ansprüchen 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß Kalium­ hexacyanoferrat(II) zu R2 zugesetzt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Analyten um Creatinin oder Harnsäure handelt.

10. Reagenz zur colorimetrischen enzymatischen Bestimmung eines Analyten in biologi­ schen Flüssigkeiten mittels einer H₂O₂-bildenden Oxidase und Nachweis des gebildeten H₂O₂ durch ein Peroxidase-abhängige Farbreaktion, dadurch gekennzeich­ net, daß die Testlösung mindestens 0,1 mmol/l (Endkonzentration) Kaliumhexacyano­ ferrat(II) enthält.

11. Reagenz nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es Kaliumhexa­ cyanoferrat(II) in Konzentrationen von ca. 0,2 bis 10 mmol/l enthält.

12. Reagenz nach Ansprüchen 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz aus einem ersten Teilreagenz (R1) zur Bestimmung des Probenleerwerts und aus einem zweiten Reagenz (R2) für die Analyt-Nachweisreaktion besteht und Kaliumliexa­ cyanoferrat(II) in R1 und/oder R2 enthalten ist.

13. Reagenz nach Ansprüchen 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß für die Farbreaktion zum H₂O₂-Nachweis die Peroxidase-katalysierte Kupplung von 4-Aminoantipyrin oder 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon bzw. 3-Methyl-2-benzo­ thiazolinon-hydrazon-6-sulfonsäure mit entweder Phenol oder einem Phenol- bzw. Anilin-Derivat verwendet wird.

14. Reagenz nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es als Phenol- Derivat 2,4,6-Tribrom-3-hydroxybenzoesäure, 2,4,6-Trÿod-3-hydroxybenzoesäure oder 3,5-Dichlor-2-hydroxybenzolsulfonsäure enthält.

15. Reagenz nach Ansprüchen 12, 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß es die Farbkupplungskomponenten 4-Aminoantipyrin oder 3-Methyl-2-benzothiazolinon- hydrazon bzw. 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon-6-sulfonsäure einerseits und Phenol oder das Phenol- bzw. Anilin-Derivat andererseits gemeinsam in R1 enthält.

16. Reagenz nach Ansprüchen 12, 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß es getrennt voneinander Phenol oder das Phenol- bzw. Anilin-Derivat in R1 und 4-Aminoantipyrin oder 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon bzw. 3-Methyl-2-benzo­ thiazolinon-hydrazon-6-sulfonsäure in R2 enthält.

17. Reagenz nach Ansprüchen 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß es Kaliumhexacyanoferrat(II) in R2 enthält.

18. Reagenz nach einem der Ansprüche 10 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß es sämtliche für die Bestimmung von Creatinin oder Harnsäure erforderlichen Komponenten umfaßt.

19. Verwendung von Kaliumhexacyanoferrat(II) in Konzentrationen von mindestens 0,1 mmol/l zur Bilirubin-Enstörung von Peroxidase-abhängigen colorimetrischen H₂O₂- Nachweissystemen.