DD269919A5 - Ionenbestimmung in Fluiden - Google Patents

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ion
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Michael Harold Town
Georg-Burkhard Kresse
Uwe Herrmann
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Univ Southern Australia
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Ionen in biologischen und nichtbiologischen Fluiden, wie Blut, Serum, Plasma, Urin, Schweiss, Hirn-Rueckenmark, Fluessigkeit, Lymph- oder Darmsekretionen, Exudate, waessrige Extrakte oder Mischungen. Erfindungsgemaess wird der Einfluss dieser Ionen auf die Aktivitaet eines Enzyms ermittelt. Das Enzym kann eine Transferase, eine Hydrolase, eine Oxidoreduktase oder eine Lyase sein. Bei den zu bestimmenden Ionen kann es sich um Kalium, Natrium, Calcium, Magnesium, Mangan, Lithium, Blei, Zink, Kupfer, Eisen, Hydrogencarbonat, Chlorid, Ammonium handeln. Unter Zuhilfenahme eines Bindemittels, beispielsweise Pyruvatkinase, Glyceroldehydrogenase oder Acetaldehyd-dehydrogenase kann das zu bestimmende Ion auf den fuer die Messung optimalen Konzentrationsbereich gebracht werden.

Description

45. Zusammensetzung nach Anspruch 31, gekennzeichnet dadurch, daß sie umfaßt:
Calpainl
Suc-Leu-Met-p-nitroanilid Chelatbildner L-Cystein 2-Mercaptoethanol Puffer Imidazol-HCI pH
E/l bis 40 000 E/l
1 mmol/l bis 20 mmol/l 0,01 mmol/lbis 1 mmol/l 1 mmol/l bis10mmol/l 1 mmoi/l bis10mmol/l 10 mmol/l bis 100 mmol/l 5-8 (bevorzugter Bereich 7-7,5)
46. Zusammensetzung nach Anspruch 31, gekennzeichnet dadurch, daß sie umfaßt: HEPES oder einen anderen chloridfreien
Puffer pH
— Amylase
— Glucosidase 4,6-Ethyliden-G-PNP
0,01 mmol/lbis 0,5 mmol/l 6,5-7,5
60 E/l bis 6 000 E/l
000 E/l bis 300 000 E/l
0,5 mmol/l bis 10 mmol/l
47. Lusammensetzung nach Anspruch 31, gekennzeichnet dadurch, daß sie umfaßt:
Citratpuffer pH
Cysteamin GlyArg-p-nitroanilid CathepsinC
O,01mol/I bisQ,2mol/l 4-7 (bevorzugt: 5,0-5,5) 1 mmol/l bis 20 mmol/l 1 rnmo'/l bis20mmol/l 2mE/ml bis100nE/ml
48. Zusammensetzung nach Anspruch 31, gekennzeichnet dadurch, daß sie umfaßt:
ß-D-Galactos'dase NPG
Kryptofix(R) 221 Puffer, pH 7,5-7,8 Mg1"
EGTA(Li-SaIz) Serumalbumin
E/! 7 500 E/l
0,25 mmol/lbis 5 mmcl/l 0,2 mmol/l bis 5 mmol/l 1 mmol/l bis 10 mmol/l 0,01 mmol/lbis 10 mmol/l 0,01 mmol/lbis 5 mmoi/l Og/I bis 5 g/l
Anwendungsgebiet der Erfindung Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Ionen in Fluiden, wie z. B. Blut, Serum, Plasma, Urin u.a. Die Erfindung
wird angewandt in der klinischen Diagnostik.
Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf Verfahien und Reagenzien zur Bestimmung von Ionen, nachstehend zu
analysierende Komponenten gonannt, in biologischen und nichtbiologischen Fluiden.
Die Erfindung basiert auf der Fähigkeit vieler zu analysierender Komponenten, die Aktivität eines empfindlichen Enzyms zu
stimulieren oder zu inhibieren. Die analytisch zu erfassenden Komponenten können Kationen oder Antonen sein, als Meta,! oder
Nichtmetall, frei oder gebunden vorliegen. In der Pi ixis wird häufig festgestellt, daß die zu analysierende Komponente in der Probe in einer Konzentration vorliegt, die außerhalb des Empfindlichkeitsbereiches von dem relevanten analytischen Indikatorenzym liegt oder aber eine Störung durch Anwesenheit cnderer Ionen hervorgerufen wird, auf die das Enzym ebenfalls
empfindlich reagiert. Die vorliegende Erfindung nimmt sich dieser Probleme an und löst sie auf unterschiedlichen Wogen.
-5- 269 919 Charakteristik des bekannten Standes rier Technik
in der Praxis der klinischen Biochemie stellt die Messung von Elektrolyten im Serum einen der r ibräuchlichsten analytischen Testes dar, die die Krankenhäuser durchführen. Diese Messungen werden nicht nur bei Routineuntersuchungen verlangt, sondern auch häufig bei Notfällen und lebensbedrohenden Situationen, bei denen die Analysengeschwindigkeit bedeutsam wird. Weil in Krankenhäusern eine der Hauptursachen von Verzögerungen der Probentransport von den Stationen zu den diagnostischen Laboratorien ist, wäre eine Methode, die sich neben dim Krankenbett leicht durchführen läßt, in Notsituationen von besonderem Wert.
In der klinischen biochemischen Praxis ist die Flammenphotomotrie eine gängige Methode zur Analyse von Kalium und Natrium. Dieser Meßvorgang leitet sich von dem Prinzip ab, daß bestimmte Atome angeregt werden, wenn man sie mit Wärme aktiviert, und dann, wenn sie in ihren Grundzustand zurückkehren, Licht mit einer charakteristischen Wellenlänge zu emittieren. Die Intensität der Lichtenergie bei der charakteristischen Wellenlänge, die von den Atomen in der Ramme erzeugt wird, ist der Zahl der in der Flamme angeregten Atome direkt proportional, was wiederum zur Konzentration der interessierenden Substanz in der Probe direkt proportional ist. Die benötigte Apparatur ist kompliziert und relativ teuer und verlangt den Einsatz von brennbaren Gasen.
Eine alternative Methode, besonders für Natrium, Kalium und Chlorid, ergibt sich aus dem Einsatz von ionenselektiven Elektroden. Ideal wäre, wenn jede fciektrode nur eine ionenselektive Eigenschaft besi'.en würde, was es ihr ermöglichen würde, nur auf das eine lon auch anzusprechen. In der Praxis ist dies jedoch nicht der Fall, und bei allen Ionen selektiven Elektroden gibt es Störionen. Außerdem sind ionenspezifische Elektroden nicht absolut spezifisch, obwohl sich im allgemeinen Korrekturen vornehmen lassen. Die Elektrode mißt das Potential, was sich bei der Anwesenheit des spezifischen Ions ausbildet. Die Instrumentierung ist relativ teuer. Keine der Methoden läßt sich spektrophotometrisch durchführen und desha:b ergibt sich aus der Notwend!gkeit zur Ionen-Messung eine beträchtliche Zunahme an Komplexität bei kommerziell erhältlichen klinischen Analysegerän-n, wobei die meisten von ihnen in erster Linie für spektrophotometrische Bestimmungen ausgelegt wurden. Um in der Praxisanwendung erfolgreich zu sein, erfordern beide Methoden eine beträchtliche Menge an Erfahrung und Sachkenntnis.
In ähnlicher Weise wird bei der Routinebestimmung vcn Chlorid mittels coulometrischer Verfahren eine spezielle Instrumentierung benötigt. Die Beendigung der Bildung von unlöslichem Silberchlorid als Reaktionsprodukt verursacht einen Anstieg beim elektrischen Strom, was bei dieser Titrationstechnik den Endpunkt signalisiert. Alternativ dazu können auch potentiometrische Bestimmungen angewandt wer 1»n, die aber ebenfalls sehr zeitaufwendig sind und eine zusätzliche Instrumentierung einschließer:
Daneben gibt es für Chlorid eine Anzahl von photometrisc'ien und titrimetrischen Verfahren, wie z. B.:
— die titrimetrische Bestimmung von freien Hg2+-lonen über den Diphenylcarbazon-Komplex;
— die kolorimetrische Bestimmung des Eisenrhodanid-Komplexes, der nach der Dissoziation von Quecksilberkomplexen bei der Fällung von HgCI2 entsteht (Sksggr Clin. Chem. 10,1964, S. 918f.; Schmidt, Zentralblatt Pharm. 124 [9), 1985, S. 527 f.);
— - die kolometrische Bestimmung an Chloranilsäure aus dem entsprechenden Ouecksilbersalz (Renschier);
— Bestimmung des gefärbten Cu2+-Komplexdes der Diethyl-dithiocarbaminsäure aus dem farblosen Quecksilbersafo (Deutsche Offenlegungsschrift 2.137.146);
— die ziemlich verbreitete TPTZ-Methode (Tripyridyl-s-triazin) (R.Fried, Zeitschr. KMn. Chem., KIm. Bioch. 10,1972, S.Z80f.; DOS 2.153.387), die in ähnlicher Weise aus der Dissoziation eines Quecksilberkomplexes zur Bildung eines ge'ä. I ten Metallkomplexes führt.
Ein Hauptgrund für das Zurückziehen dieser Methoden ist der, daß Lösungen mit stark toxischen Substanzen verwendet Werden. Einige dieser Methoden sind kompliziert und ungenau (z. B. die Titrationsmethode). Viele der Reagenzien sind instabil und die Kalibrierungskurven verlaufen nicht linear (z. B. bei der Rhodanid-Methode). Einigevon die&en Methoden erfordern darüber hinaus eine Vorbehandlung, um Störungen durch den Proteingehalt in der Probe zu beseitigen. Eine verbesserte TPTZ-Methode wird in Wo. 83/0026870 beschrieben, jedoch ist der Einsatz von toxischen Quecksilberverbindungen noch immer ein Nachteil. Die einzig kolorimetrische Methode ohne Einsatz von Quecksilberionen ist die der Bestimmung von Hexachloro-Komplexen des FE (III) in einer Perchlorsäure haltigen Lösung (F. Hoppe, Ther. Ggw. 110[4), 1971, S.554f.) (H.Mahner, Zeitschr. KMn. Chem., klin. Biochem. 11(11], 1973, S. 451 f.; W.T.Law, Clin. Chem. 26 [13] 1980, S. 1874 f.; US-Pat. 4.278.440). Eine beträchtliche Limitierung bei dioser Methode ergibt sich aus dem Einsatz von stark sauren Reagenzien, die korrosiv sind und sich deshalb nicht mit mechanischen Pipettiersystemen vertragen. Ein weiterer Nachteil ist die Störung durch Bilirubin in der Probe.
Calcium ist ein weiteres Beispiel für einen Elektrolyten, der routinemäßig im klinischen Laboratorium bestimmt wird. Die Konzentration dieses Metallions in Körpf flüssigkeiten wird in einem engen Bereich reguliert. Pathologisch hohe oder niedrige Konzentrationen können zu lebensbedrohenden Erkrankungen, wie Niereninsuffizienz, Entzündung der Bauchspeicheldrüse, Krampfsyndrom und kongestive Herzinsuffizienz, führen.
Eine der ersten Methoden zur Bestimmung von Calcium wurde von Tisdall (J. Biol. Chem. 33, S. 461-645,1925) beschrieben, bei der c'as Calcium mit Oxalsäure gefällt wird, was wiederum kolorimetrisch bestimm; wird. Die Methode beinhaltet eine Zentrifugierungsstufe und ist von daher sehr zeitaufwendig; sie ist nicht spezifisch für Calcium und sie hängt von der sorgfältigen Handhabung der Proben ab. Die Methode wurde in vielen Laboratorien erfolgreich in Form von tetnmetrischen und kolorimetrischen Verfahren eingesetzt. Das erstere Verfahren verfügt jedoch über den Nachteil, daß die Verfahrensweise kompliziert und unhandlich ist sowie große Probenvolumina erfordert. Beim letzteren beeinflußt Calcium die Farbe eines Farbstoffs, z. B. von ortho-Kresolphthalein-Komplexon, so daß dies mit Hilfe eines Photometers gemessen werden kann. Wegen der Einfachtheit der Methodee wurde sie für das klinische Laboratorium automatisiert. Jedoch beinhaltet die Methode den Einsatz von aggressiven, stark alkalischen Lösungen und toxischen Substanzen. Es tritt dabei aber besonders die Tendenz auf, daß sie durch eine Reihe von Serumb^standteilen wie Lipide, Proteine, Phosphat und Bilirubin gestört wird, und folglich kommt es beim Vergleich mit der Ergebni *s Jn von der Atomsabsorption und der Flammenphotoemtrie als Referenzmethoden zu keiner guten Übereinstimmung. Ein weiterer Nachteil des kolorimetrischen Verfahrens ist der, daß die Kalibrierungskurven nicht linear verlaufen und die Farbe zum großen Teil von der Temperatur abhängig ist.
Von W. H. Outlaw und Π. H. Lowry werden in Analytical Biochemistry 92, S. 370-374 (1979) einu enzymvermittelnde Bestimmung zur Messung von Kaliumionen in Geweben beschrieben. Bei dieser Methode wird die Pyruvatkinase au·. Kaninchenmuskeln eingesetzt, die durch Kalium· um' Natriumionen aktiviert wird, wobei das erstere lon um etwa das vierzigfache effektiver ist. Wegen der Nichtspezifität der N ithode läßt sie sich jedoch dort in geeigneter Weise einsetzen, z. B. beim Pflanzenmaterial, wo din Kaliumionen die vorherrschen Kationen sind, aber nicht für Messungen in Körperflüusigkeiten wie Serum, in denen ein -Ifcizigfac'ter Überschuß an Natriumionen besteht. Deshalb rufen die Natriumionen nicht zu akzeptierende Störungen hervor, wenn das von Lowry und Mitjrb. beschriebene enzymatische Photometrieverfahren angewandt wird, um Kalium im Plasma odor Serum zu ermitteln. Ein weiteres Problem dabei ist, daß Ammoniumionen eine vergleichbare Aktivierung wie die Kaliunionen ergeben. Die obei erwähnte Publikation behandelt oder löst nicht diese kritischen Proble-ne im bezug auf die Analyse der Kaliumionen .n biologisches Fluiden, z.B. Serum, noch wird eine Bestimmungsmethode für die Natriumionen vorgeschlagen.
Ziel der Erfindung i it die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens zur Bestimmung von Ionen in Fluiden, mit dem die Nachteile des bakar. .en Verfahrens vermieden werden.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung iregt > ie Aufgabe zugrunde, eine neue Technologie zur Bestimmung von Ionen in Huiden zu entwickoln sowie eine Zusammensetzung von bestimmten Komponenten zur Verfügung zu stellen, die für die Ausführung des neuartigen Verfahrens geeignet ist.
Eriindungsgemäß werden Verfahren jelöst durch ein Verfahren gelöst durch ein Verfahren zur lonenbestimmung (Analysenkomponenten) in Fluide·":., in denen der Einfluß von den Ionen auf die Aktivität eines Enzyms gemessen wird. Bei den Fluiden kann es sich sowohl um ein biologisches als auch um ein nichtbiologisches Fluid handeln, wie z. B. um Blut, Serum, Plasma, Urin, Schweiß, Hirn-Rückenmark-Flüssigkeit, Lymph- oder Darmsekretionen, Exudate oder Transsudate oder um einen wäßrigen Extrakt oder' m eine Mischung.
Ein wesentliches Merkmal dieser Erfindung ist die Verwendung von selektiven Bindemitteln, um die freie Konzentration an der zu analysierenden Komponente in den Optimalbereich für das analytische Enzym zu bringen, besonders dann, wenn die Verdünnung des Fluids nicht praktikabel ist. Ein weiteres Element der Erfindung ist der Einsatz von konkurrierenden Inhibitoren für das relevante analytische Enzym, um seine Empfindlichkeit auf die zu analysierenden Komponente herabzusetzen, wodurch die Messung letzterer bei einer höheren Konzentration möglich ist. Dies ist z. B. dann besonders von Nutzen, wenn die selektiven Bindemittel nicht so ohne weiteres verfügbar sind oder sie einen unakzeptierbar hol.en Preis haben.
Ein änderet Merkmal der Erfindung ist, daß selektive Bindemittel eingesetzt werden, um die freien Konzentrationen an Störionen auf Gehalte zu bringen, wo der Störeinfluß nicht mehr bedeutsam ist. Der Einsatz wurde auch deshalb vorgenommen, weil der konkurrierende Inhibitor effektiver mi. den Störionen als mit den zu bestimmenden Ionen in Wechselwirkung tritt, wodurch die Empfindlichkeit des Enzyms zur Analysenkomponente, bezogen auf das Störion, zunimmt.
Wichtiges Element ist die Wahl der optimalen Reaktionsbedingungen, einschließlich der Auswahl von einem geeignet in· Isoenzym, so daß die stimulierenden oder inhibierenden Effekte bei' ior zu analysierenden Komponente größer sind all die von den Störionen. Außerdem muß die Wirkung der zu analysierenden Komponente und der Störionen auf din Aktivität des analysierenden Enzyms additiv sein, so daß, wenn die Konzentration der Störionen bekannt ist, sich die Kc zentration von der zu analysierenden Komponente einfach aus der Differenz ermitteln läßt. Wo ein Störion bei der Analyse mit einer relativ konstanten Konzentration auftritt, ist die Möglichkeit gegeben, eine entsprechende Konzentration von dem Störion bei Standard-(Kalibrier-)Lösungen mit einzusetzen.
Eine andere Methode zur Bestimmung solcher zu analysierenden Komponenten ist die Verwendung eines Te«ts mit konkurrierender Bindung, bei dem die zu bestimmende Komponente ein anderes lon aus dem Bindungsmittel ei*,. >*t und die Wirkungen von dem freigssetzten lon auf die Aktivität eines geeigneten Enzyms ermittelt wird.
Diese allgemeinen Prinzipien lassen sich am besten im Detail bei ihrer Anwendung auf die Bestimmung von Kalium-, Natrium-, Calcium-, Chlorid- und Bicarbonat-Ionen im Plasma oder Serum illustrieren. Sie sind jedoch auf ein weites Spektrum von Ionen anwendbar, so u.a. auf die Kationen Magnerlijm, Mangan, Lithium, Blei, Zink, Eisen und andere Schwermetall. Beispiele für Nichtmetallionen, die sich messen lassen, sind die Protonen oder Ammoniumionon.
Substanzen lassen sich ebenfalls bestimmen, die, wie im Falle von Harnstoff, zu einem Ansteigen von Ammoniumionen führen.
Geeignete Enzyme
Zu den Enzymen, die sich beispielsweise einsetzen lassen (siehe HJ.. Evans und Mitarb., Ann. Rev. Plant Ph> siol. 17, S. 47,1966), gehören:
Transferasen wie die phosphorhaltigen, gruppenübertragenden Transferasen. Eine derartige Transferase kann eine Pyruvatkinase sein. An Stelle der Pyruvatkinase lassen sich auch andere Kinasen, wie z. B. die Adenylatkina se oder aber die Hexokinase, die empfindlich auf Magnesium- oder Manganionen reagieren, verwenden. Eine weitere Transferase ist die Acetatkinase (aus E. coli) oder die Pyridoxalkinase aus dem Gehirn, die auf Zinkionen empfindlich ansprechen.
Hydrolasen sind z. B. Gl) cosidasen, wie die α- oder ß-D-Galactosidase (aus Escherichia coli), die Carboxype otidase (aus der Bauchspeicheldrüse von Rindern), die Collagenase (aus dem Clostridium hystolicum), die Amylase (aus dem Speichel oder der Bauchspeicheldrüse) oder die Phosphoglycolat-phosphatase.
Ebenso werden Peptidhydrolasen, zu denen die cystein- und thiolabhängig en Proteinasen mit den speziellen Beispielen Calpain I und Il (auch als Calcium-aktivierte, neutrale Proteasen bezeichnet) gehören, vr η Sasaki und Mitarb, im J. Biol. Chem. 259,
S. 12489-12494.. beschrieben. Die zuletzt genannten Enzyme lassen sich aus r iner Vielzahl von tierischem Gewebe isolieren und reinigen, wie Leber und Niere der Ratte, menschliche und Schweineerythroc /ten, Gehirn des Rindes und Skelettmuskeln von
Kaninchen, wobei die Methode von A.Kitaharr und Mitarb, angewandt wird, die im J. Biochem. 95, S. 1759-1766 (1984) beschrieben wird. Ein weiteres Brispiel ist die Dipeptidyl-ar.iinopeptidase I (E.C. 3.4.14.1, Cathepsin C), siohe J.Ken McDonald, Bioch. Biophys. Res. Commun. 2· * (5), S. 66,771 f. Eine andere Quelle für Enzyme sind Proteine, die mittels Genrekomünationstechniken erhalten werden.
Oxidoreductasen sind z.B. die Glycerol-dehydrogenase (aus dem Enterobacter aerogeies), die Acetaldehydrogenase (aus der Molke) oder die Tyrosinase (Catecholoxida3e).
Lyasen sind ζ. β. die Aldolase »aus der Molke) oder die Carboanhydrase (aus den Erythrocy*en vom Rind). Andere geeignete Enzyme sind verschiedene Enzyme aus halophilen Organismen. Eine andere Enzymquelle sind Proteine, die mit Hilf» von Gen-Rekombinationstechniken gewonnen werden.
Seloktive Bindemittel: Es stehen eine große Zahl an Bindemittel zur Bindung von der zu analysierenden Komponente oder von den Störionen zur Verfügung. Solche Binde- oder Maskierungssubstanzen sind Stoffe mit Einbuchtungen, mit Ausbuchtungen, Kronenether, Stoffe mit Seitenkelten, in Kugelform oder halbkugelförmig vorliegende Stoffe, Stoffe mit schüsseiförmiger Gestalt und Kombinationen davon, natürlich vorkommende lonophore, z. B. Antibiotica, cyclische Peptide wie Valinomycin, Komplexone und Chelatisierungsmittel, z. B. Iminodiessigsäure, EDTA, Nitriloessigsäure und Derivate davon. Solche Verbindungen werden in der Zeitschrift Kontakte von Merck beschrieben: 1977, Nr. 1, S. 11 ff. und 29ff.; Nr. 2, S. 16ff., Nr.3, S. 36ff.; Phasentransfer-Katalysatoren, Eigenschaften und Anwendungen (Merck-Schuchardt) 1987, thermodynamische und kinetische Daten für die Wechselwirkung Kation-makrozyklische Vorbindung; R. M. Izatt und Mitarb., Chemical Review 85, S.271-339 (1985); Daten für die Biocherritsche Forschung, 1986, R. M.C.Dawson und Mitarb. (Herausg.), 3. Auflage, S.399-415, Clarendon Press, Oxford; F.Vögtle und Mitarb., Chem. Macrocycles, Springer Verlag, New York, 1985; G.W.Gokel und Mitarb. (Herjusg), Synthese von makrocyclischen Polyethern, Springer Verlag, New York, 1982; M.Hiraoka (Herausg.), Kronen-Verbindungen, Elsevier, Amsterdam, Oxford, New York, 1982; J. M. Lehn und Mitarb., J. Am. Chem. Soc. 97, S. 6700-6707 (1975); G.Schwarzenbach und Mitarb., HeIv. Chim. Acta 28, S.828 (1945); S.F.A. Kettle, Koordinationsverbindungen, Tacshentext 3, Verlag Chemie, Weinheim/Berqstr. 1972; A. E. Martell und Mitarb., Die Chemie der Metallchelatverbindungen, Verlag Chemie, Weinheim/Bergstr. 1958; M.Becke-Goehring und Mitarb., Komplexchemie, Springer Verlag, 1970; F. «ober, Grundlegender Komplexchemie, Otto SaIIe Verlag, Frankfurt (Main) 1979; G.Schwarzenbach und Mitarb., HeIv. Chim. Acta 31, S. 1029 (1948); R.G.PearsonundMitarh., Scienco 151, S. 172 (1966).
Beispiole für Chelatisierungsminui, die zur Pindung von mehrwertigen Ionen in der Lage sind, hierbei besonders zweiwertige Kationen, sind die Ethylengly^ol-bis-(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure (als EGTA bezeichnet) und die Ethylendinitrilotetraessigsäureu'DTA).
Während viele Bindemittel existieren, die mehrwertige Ionen binden können, z. B. EDTA und deren Derivate, sind Mittel für die Bindung von einwertigen Ionen weniger gebräuchlich. Tetraphenylborat bindet Koliumionen. Eine Gruppe von Verbindungen mit weitergehenden Möglichkeiten sind jedoch Verbindungen mit Einbuchtungen, Cryptanden, als Beispiole für Reagenzien, die selektiv einwertige Kationen in wäßrigen Lösungen binden können (siehe R. M. Izatt uivj Mitarb., Chem. Reviews 85, S. 271-339). Spezielle Beispiele für Cryptanden sind das Kryptofix"" in Form von verschiedenen Verbindungen von Merck-Schuchardt, ro z.B.:
4,7,13,16,21-Pentaoxa-1,10-diazabicyclo[8.8.5|-tricosan als Kryptofix"" 221 im Merck-Schuchardt-Katalog, S.4Ü8, von 1987/88, Katalog-Nr. 810646 (K221);
4,7,13,16,21,24-Hexaoxa-1,10-diazabicyclo(8.8.8)-hexacosan als Kryptofix"" 222 im Merck-Schuchardt-Katalog von 1987/88, S.438, Katalog-Nr. 810647 (K222).
Als Maskierungsmittel für die Beseitigung von störenden Anionen lassen sich die folgenden Substanzklassen potentiell nutzen: Anioncryptanden, Heterocyclophane, Catapinanden und anorganische Metallkomplexe oder unlösliche Salze. Spezielle Beispiele für komplexbildende Verbindung ;.: mit Anionen sind in der Literatur beschrieben, so z. B. Azamono- oder Azapolycyclen, makrocyclische quarternäre Tetraederverbindungen, makrocycüsche Bismetallkomplexo, Makrocyclen mit kovalent eingebauten Lewissäure-Zentren, protonierte oder alkylierte quarternäre Cryptanden oder Catapinanden (F. P. Schmidtchen, Nachrichten Chem. Techn. lab. 36 (1) 1988, S.8f.; E. Graf, J. Amer. Chem. Soc. 98 (20), 1976, S.6403f.; C. H.Park, J. Amer. Chem. Soc. 90 (9), 1968, S.2431 f.) sowie auch z. B. der Hexachlorokomplex von Fe (III) oder Silbernitrat. Die Funktion der Bindemittel: Diese Bindemittel werden für die folgenden Zwecke eingesetzt:
1. Die selektive Bindung von Störionen.
2. Die Kc. nzentration vor der zu analysierenden Komponente auf optimale Meßgehalte herabzusetzen, wenn die Verdünnung der Probe nicht durchführbar ist.
3. Bei einer Ausführungsform der Erfindung liegt ein Vorgang vor, bei dem das Bindemittel vorhanden ist und einen Komplex mit den „lndikator"ionen eingeht und aus diesem Komplex werden die Indikatorionen stöchiometrisch von den zu analysierenden Ionen ersetzt, wobei der Einfluß von den ersetzten Indikatorionen auf die Aktivität eines Enzyms bestimmt wird, woraus 'ich ein indirektes Maß für die Konzentration an den zu analysierenden Ionen ergibt. Zum Beispiel ist bei solch einem Meßvorgang die Pyruvatkinaso des Enzym, die Indikationsionen sind das Kalium, beim Bindemittel handelt es sich um Kryptofix11" 221 und das zu bestimmende lon ist Natrium; oder das Enzym ist eine Kinase, das Indikatorion ist Mg2+, das Bindemittel ist ein Chelatisierungsmittel, z. B. EDTA, und das lon ist ein Metall; oder das Enzym ist die Pyridoxalkinase, das Indikationsion ist Zn2', das Bindemittel ist Kryptofix"" 221 und das lon int ein Schwermetall; oder das Enzym 'St a-Amylase, das Bindemittel ist Ag oder Hg und Jas zu bestimmende lon ist Chlorid; oder das Enzym ist Collagenase, das Bindemittel ein Chelatisierungsmittel wie EDTA und das zu bestimmende lon ist Calcium.
Fluide für die Analyse: Die biologischen Fluide, bei denen die Messung für die zu bestimmenden Komponenten vorgenommen wird, sind Blut, Serum, Plasma, Schweiß, Transsudate und Exudate odf-i Urin als Beispiel. Andere Beispiele für Fluide sind Leitungswasser oder Extrakte von Nahrungsmitteln oder Früchten oder fermentierte Flüssigkeiten wie Wein. Anwendung der allgemeinen Prinzipien auf die Bestimmung von Kalium· und Natriumionen Die wesentlichen Anforderungen für eine zufriedenstellende Methode zur Bestimmung von Kaliurnionen im Serum oder Plasma, die auf der Empfindlichkeit der Pyruvatkinase auf Kaliumionen beruht, sind die Überwindung der Störungen durch Ammonium- und Natriimionen. Gemäß den in dieser Erfindung ausgeführten allgemeinen Prinzipien läßt sich dies mittels einer oder mehrerer der folgenden Verfahrensweisen erreichen:
1. Die selektive Bindung von Nstrli mionen mit einem geeigneten Bindemittel, z. B. Kryp ' 221.
2. Die Auswahl bei Bacillus stearothermophilus anstatt von Kaninchenmuskeln als Quelle Cot r'yruvatkinase, weil das bakterielle Enzym eine Empfindlichkeit für! !aliumionen aufweist, die im Verhältnis zu den Natriumionen doppelt so groß ist wie beim Muskelenzym.
3. Die EinbßAohung vor. Ionen ?ls konkurrierende Inhibitoren für das sensitive Indikatorenzym in dem Assay, wie z. B. die Verwendung von Lithiumiornn, die mit den Natrium- und Kaliumionen in Konkurrenz treten.
4. Die enzymatische Entfernung On Ammoniumionen.
Weil Lithiumionen als Konkurrent (,egonüber den Kaliumionen weniger wirksam sind, ergibt sich als Nutzeffekt eine Zunahme der relativen Empfindlichkeit von der Pyruvatkinase gegenüber den Kaliumionen um weitere 50%, bezogen auf die Natriumionen. Außerdem verhalten sich die Wirkungen von Kalium- und Natriumionen auf die Aktivität der Pyruvatkinase bei Vorhandensein der Lithiumionen additiv und nicht gemeinsam darauf einwirkend. Dies schafft die t löglichkeit zur Konzentrationsmessung von entweder der Kalium- oder der Natriumionen, vorausgesetzt, die Konzentration des anderen Ions ist bekannt.
Durch die Anwendung der Verfahrensweisen 2 und 3 in Abwesenheit eines Bindemittels ist es möglich, daß die relative Emfindlichkeit von der Pyruvatkinase auf Kalium- und Ne' jmionen sich in der Größenordnung von 100:1 bewegt. Dies bedeutet, daß selbst bei extrem abnormalen Natriumionen Konzentrationen von 110 oder von 170mmol/l der Fehler für die gemessene Konzentration an Kaliumionen 0,? mmol/l nicht übersteigt, bezogen auf eine Natriumionen-Konzentration im Plasma von 140mmol/l (Beispiel A). Dies wird hinsichtlich vieler klinischer Anwer.dungszwecke als nicht ausreichend exakt angesehen. Wenn jedoch der wahre Konzentrationswert für Natriumionen irn Plasma bekannt ist, sind genaue Messungen von Kaliumionen bis hinunter zu ±0,05 mmol/l durchführbar (Beispiel B). Wenn die Verfahrensweisen 1-3 kombiniert werden und ein Bindemittel, z. B. Kryptofix<R> 221, vorhanden ist, läßt sich die relative Empfindlichkeit der Pyruvatkinase für Kaliumionen, bezogen auf die Natriumionen, auf größer 500:1 steigern. Unter diesen Ger ebenheiten ist es nicht erforderlich, die Natriumionenkonzentration zu kennen, um die Kaliumionon-Konzentration m Plasma bis auf 0,05mmol/l genau zu bestimmen (Feispiel C).
Diese Methoden zur Bestimmung des Kaliumions demonstrieren die Anwendbarkeit der allgemeinen, in der Erfindung ausgeführten Prinzipien bezüglich der Verminderung von Störungen. Auf der anderen Seite läßt sich die Messung von Natriumionen im Serum oder Plasma an besten durch die Anwendung dieser Prinzipien bei der Regulierung der effektiven Konzentration an der zu analysierenden Komponente illustrieren. Ein Hilfsmittel zur Messung von Natriumionen, wie es in dieser Erfindung aufführt ist, stellt der Einsatz eines Enzyms dar, dessen Aktivität auf Natriumionen anspricht. Ein Beispiel für solch ein Enzym ist c ie 3-Galactosidase (Kuby und Mitarb., J. Amer. Chem. Soc. 75, S.890,1953). Jedoch ist der Bereich der Natriumionen-Konzentration, in dem dieses Enzym am empfindlichsten reagiert, sehr viel niedriger ist alt. sich dies üblicherweise und ohne Verdünnungsschritt in der Plasmaprobe erreichen läßt.
Im Einklang mit den in dieser Erfindung ausgeführten Prinzipien werden die folgenden Verfahrensweisen angewandt, um die effektive Natriumionen-Konzontration auf optimale Gehalte herabzusetzen, sofern die Verdünnung der Probe nicht durchführbar ist.
1. Die Verwendung von einem Natriumionen-Bindemittel wie i'ryptofix"" 221.
2. Der Einsatz von Lithiumionen als konkurrierender Inhibitor für die ß-Galactosidase, wodurch sich die Empfindlichkeit des Enzyms gegenüber den Natriumionen verringert.
Die Kombination der Verfahrensweisen 1 und 2 ist einfach und ermöglicht die Bestimmung der Natriumionen im Plasma und im Serum unter Verwendung von ß-Galactosidase, wobei sich die Menge von dem Bindemittel so rr.dnipulieren läßt, daß das-Signal für die Natriumionen-Konzentrationen von kleiner 110mmol/l ein Minimum wird, wohingegen das Signal für den üblichen analytischen Bereich (110-170 mmol/l) verstärkt wird 'Beispiel D).
Die Natriumionen lassen sich auch mit Hilfe der Pyruvatkinase messen, vorausgesetzt, die Bedingungen sind so gewählt, daß die Stimulierung der Enzymaktivität durch Kaliumionen hernbgesetzt ist und ein Kaliumionen-Bindemittel, z. B. Kryptofix(n> 222, in dem Reaktionsgemisch enthalten ist (Beispiel E).
Eine andere Methode zur Bestimmung der Natriumionen-Konzentration im Plasma besteht darin, daß man die Kaliumionen aus Kryptofix"" 221 durch Natriumionen verdrängt und die freigesetzten Kaliumionen-Kcnzentration im Plasma stimulieren (Beispiel F).
Andere Ausführungsformen der Erfindung sind Gemische und Reagenzien für die Bestimmung von Ionen in biologischen und nichtbiologischen Flu>den.
Das gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete Reaganz kann in gelöster oder fester Form verfügbar sein. Es kann infolge Durchtränken auf einem geeigneten Träger vor'^qsn. Es läßt sich ein diagnostisches Mittel in Form eines Teststreifens herstellen, indem ein Trägermaterial, vorzugsweise Filterpapier als Vlies aus Cellulose oder einer synthetischen Faser, mit Lösungen durchtränkt wird, bei deriün die erforderlichen Reagenzien in leichtflüchtigen Lösungsmitteln, z.B. Aceton, vorliegen, wie sie üblicherweise bei der Produktion von Teststreifen eingesetzt werden. Dies kann in einem oder mehreren Durchtränkungsschritten erfolgen. Die fertigen Testpspicrc kor.r.sr, als solche uanuizt werden oaer Dei der Handhabung auf bekannte Weise festgeklemmt werden oder aber vorzugsweise zwischen synthetischen Harzen und engmaschigen Sieben versiegelt.
Die Ausführungsform der Erfindung wird nachfolgend ausführlicher beschrieben, woraus ersichtlich wird, daß die Erfindung keineswegs auf eines der Details oder eine Kombination davon, die beschrieben werden, begrenzt ist und insbesondere lassen sich mechanische oder chemische Variationen neben den in dieser Ausführungsform beschriebenen verwerten.
Detaillierte Beschreibung der analytischen Methoden für Kailumionen
Dieser Abschnitt beschreibt ausführlicher die Methoden für die Kaliumionen-Bestimmung in Anwendung der in dieser Erfindung beschriebenen Prinzipien. Für die Bestimmung der Kaliumionen wird ein Fluid, ζ. B. das Blutplasma, mit einer gepufferten Mischung, die Adenosin-disphosphat (ADP), Phosphoenolpyruvat (PEP), reduziertes Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NADH), Pyruvatkinase (PK) und Lactat-dehydrogenase (LDH) enthält, inkubiert. Die Bildung von Pyruvat und anschließend von Lactat in dieser Mischung, wobei die Reaktionen durch PK und LDH katalysiert werden, ist vollkommen von der Anwesenheit der entsprechenden Kationen abhängig, denn bei deren Fehlen ist PK tatsächlich inaktiv. NADH absorbiert am stärksten bei 340 nm, wohingegen dies bei NAD nicht der Fall ist.
Unter den für die Analyse gewählten Bedingungen, die die Anwesenheit von Manganionen einschließen, was von der bakteriellen PK benötigt wird, ist die Geschwindigkeit der NAÜH-Oxidation der Konzentration an Kaliumionen proportional (sieho die Beispiele A-C)
Unter diesen Bedingungen laufen die feigenden Reaktionen ab:
PK
(1) PEP + ADP + H+ —» Pyruvat + ATP
LDH
(2) Pyruvat + NADH + H+ — > Lactat + NAD+
Die Geschwindigkeit der Reaktion (1) wird von der Konzentration der in dem System vorhanden Kaliumionen bestimmt und cies wiodciium limitiert dit Geschwindigkeit der Reaktion (2). Es gib mehrere Möglichkeiten, nach denen diese Reaktionsgeschwindigkeiten gemessen werden können. Eine der t'tandardmethoden ist die spektrophotometrische Geschwindigkeitsmessung des Vorbrauchs an NADH bei der Reaktion (2). NADH absorbiert stark bei 340 nm, wohingegen dies bei NAD nicht der Fall Ist. Dementsprechend liefert die Abnahme bei der Absorbanz der Reaktionsmischung bei 340nm (oder einer alternativen Wellenlänge) eine direktes Maß für die Reaktionsgeschwindigkeit und daraus läßt sich auf die in der Mischung vorhandene Kaliumionen-Konzentration s jhließen. Andererseits ergibt sich ein Vorteil aus der Tatsache, daß bei beiden Reaktionen (1) und (2) H+ verbraucht wird, folglich ergibt sich in der Reaktionsmischung eine Verringerung der Protonenkonzentration. Der G^ochwindigkeitsabfall bei der Ptu'onenkornentration läßt sich rnii einem. τΗ-Meßgerät oder über eine Tit. ai!?n bestimmen. Boi diesen zuletzt genannten Fällen wird die anzuwendende Pufferkonzentration viel geringer sein als bei der spaktrophotometrischen Technik. Auch andere Ausrüstungen, wie das Fluorometer oder das Luminometer, lassen sich als Monitor für die Aktivität der P/ruvatkinase einsetzen.
Eu gibt eine Anzahl weiterer Methoden zur Detektierung der Ansammlung von Pyruvat in Verbindung mit der PK-Aktivität. Dazu gehören Methoden zur Messung des anorganischen Phosphats, des verbrauchten Sauerstoffs oder des Wasserstoffperoxids; von Acetylphosphat oder Kohlendioxid, was bei der enzymatischen Wirkung der Pyruvatoxidase erzeugt wird; der Bildung von Hydrazon mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin; die Mejsung der Reaktanten oder dor Produkte von der enzymatischen Wirkung der Pyruvatcarboxylase, der Pyruvatdecarboxylase oder der Pyuvatdehydrogenase; die Verwendung von Flavin-gekoppelten Systemen; und die Isotopenmethoden zur Messung winziger Konzentrationen an Substraten (M. N. Berry und Mitarb., Anal. Biochem. 118, S.344-35211981]).
Bei einer Zusammenstellung von 200 Serumproben wurde eine gute Übereinstimmung mit anderen Methoden, wie der flammenphotometrischen Bestimmung oder den Messungen mit der ionensensitiven Elektrode, erzielt. Eine signifikante Störung bei der Methode ergibt sich aus den Ammoniumionen, die im allgemeinen im Serum \ orhanden sind oder sich beim Steherlassen ansammeln. Die Möglichkeit einer Ammonium-Störung läßt sich vollständig umgehen, indem man dem Reaktionsgemisch a-Ketoglutarat (KG) und Glutamat-dehydrogenase (GDH) zusetzt. Die Ammon'umi jnen werden bei der Vorinkubation entsprechend der Reaktion
Ά\-\Λ + + KG + NADH -— ) Glutamat + NAD+
entfernt.
In Lösungen wie Urin, in denen der Ammoniumionen-Gehalt hoch sein kann, lallt sich eine gekoppelte Reaktion benutzen:'
Uli* + KG + KADPI-! ) Glutamet + MADP
Glucosc-6-P + K1ADP ) 6-Phosphogluconot + NADPII
Die gekoppelte Methode verwendet die Glucose-e-phosphat-dehydrogenaw. Vorausgesetzt, daß das zugegebene Glucose-6-P und das a-KG im Überschuß zu den vorhandenen Ammoniumionen vorliegen, we/den alle Ammoniumionen entfernt, während das NADH in dem Reaganz erhalten bleibt.
Die typischen Konzentrationsbereiche der wichtige: ι Reagenzien für die enzymatische Bestimmung von Kaliumionen bei 370C unter Verwendung einer 10μΙ Probe an Plasma oder Serum sind:
PK (B. stearothermophilus 50ζ/Ι bis 10 000 E/l
PEP (neutralisiertes TrLs-SgIz) 0, I mmol/l bis 30 mmol/l
Kryptofixim221 0mmol/l bis 30 mmol/l
NADH 0,01 mmol/l bis 0,8 mmol/l
Puffer, pH 7-8 50mmol/l bis 500 mmol/l
Mn2^ oder Mg2+ 1 mmol/l bis 10 mmol/l
LiCI 2 mmol/l bis 100 mmol/l
ADP (säurefrei) 0,5 mmol/l bis 10 mmol/l
LDH (bestimmt bei 25°C) 5 000 E/l bis 100 000 E/l
Serumalbumin 0g/l bis 5 g/l
GDH (bestimm \... ) 2 500 E/l bis 20 000 E/l
KG (säurefrei) 1 mmol/l bis 10 mmol/l
Ein anderes Beispiel ist Glycerol-dehydrogenase (E. C. C. Lin und Mitarb., B. 235, S. 1820,1960), das empfindlich auf Kaliumionen reagiert. Die typischen Konzentrationsbereiche der wichtigen Rearjf «izien für die enzymatische Bestimmung der Kaliumionen bei 370C unter Verwer dung von der Glycerol-dehydrogenase sind:
Glyceiol-dehydrogena?o 50 E/l bis 1000 E/l
Glycerol 0,3mol/l b!s3mol/l
KryptofixIRI221 Ommol/I bis 30 mmol/l
NAD 0,1 mmol/l bis 5,0 mmol/l
Puffer, pH 9 20mmol/l bis 500 mmol/l
Serumalbumin O g/l bis 5 g/l
GDH (bestimmt bei 260C) 2 500 E/l bls20000C/l
KG (säurefrei) 1 mmol/l bis 10 mmol/l
Ein weiteres Enzym, das empfindlich auf Kaliumionen reagiert, istdio Acetaldehyd-dehydrogem se (S. Black, Arch. Biochem. Biophys. 34, S. 86,1951). Die typischen Konzentrationsbereiche von den wichtigen Reagenzien für die enzymatische Bestimmung der Kaliumic nen bei 370C unter Verwendung der Acotaldeh> d-dehydrogenase sind:
Acetaldehy l-dehydrogenase 50 E/l bis 10 000 E/l
Glyoolaldehyd 0,3 mmol/l bis 30 mmol/l
Kryptofix(RI221 O.Ttmol/l bis 30 mmol/l
NAD 0,05 mmol/l bis2,0mmol/!
Piffer,pH7-8 50 mmol/l bis 500 mmol/l
Oithiothreitol 0,1 mmol/l bis 2 mmol/l
Serumalbumin Og/I bis 5 g/l
GDH (bestimmt bei 25°C) 2 500 E/l bis 20 0OC E/l
KG (säurefrei) 1 mmol/l bis 10 mmol/l
Daa Glycolaldehyd kann durch Acetaldehyd (0,02 mmol/l bis 1 mmol/l) ersetzt werden.
Die Acetc'o'ehyd-dehydrogenase zeigt ebenfalls eine Esterase-Aktivität, so daß die Kaliumionen-Konzentration durch Überwachung der Freisetzung von 4-Nitrophenol aus dem 4-Nitrophenylacetat bestimmt werden kann. Die typischen Konzentrationsbereiche für die wichtigen Reagenzien bei der enzymatischen Bestimmung der Kaliumionen bei 370C auf der Grundlage der Esterase-Aktivität von der Acetaldehyd-dehydrogenase sind:
Acetaldehyd-dehydrogenase 50 E/l bis 10 000 E/l
4-Nitrophenylacetat 0,1 mmol/l bis C mmol/l
KryptofixIRl221 Ommol/I bis 30 mmol/l
NADH 0,001 mmol/l bis 0,1 mmol/l
Puffer, pH 7-8 50 mmol/l bis 500 mmol/l
Dithiothreitol 0,1 mmol/l bis 2,0 mmol/l
Serumalbumin Og/I bis 5 g/l
GDH (bestimmt bei 250C) 2 500 E/l bis 20 000 E/l
KG (säurefrei) 1 mmol/l bis 10 mmol/l
Die Bestimmung der Natriumionen
Irn Prinzip ist die Messung der Natriumionen unter Verwendung von PK vergleichbar mit der von Kaliumionen. Jedoch existieren dabei bestimmte, grundlegende Unterschiede. Im ersten Fall i«t PK etwa 40-100mal empfindlicher gegenüber dem Kdliumion als beim Natriumion, was von den oben beschriebenen Inkubationsbedingungen abhängt. Folglich, selbst wenn Natriumionen im Plasma mit einer Konzentration des 30fac!ten von der Kaliumionen-Konzentration auftreten, stört letzteres die Natriumionen-Messung.
Gemäß den in dieser Erfindung angenommenen allpemeinen Prinzipien werden Lithiumionen weggelassen, ist PK aus Kaninchenmuskeln das zu bevorzugende bakterielle Enzym und Magnesiumionen lassen sich anstelle von Manganionen verwenden. Bei einer Methode werden die Kaliumionen spezifisch an Krynofixm) 222 gebunden und die Wirkungen von Natriumionen auf die PK-Aktivität direkt gemessen (Beispiel E).
Die typischen Konzentrationsbereiche für die wichtigen Reagenzien zur enzymatischen Bestimmung der Natriumionen bei 370C unter Verwendung der Pyruvatkinase sind:
PK (K jninchenmuskeln) 50 E/l bis10C00E/l
PEP (neutralisiertes Tris-Salz) 3 mmol/l bis 30 mmol/l
Kryptofix{R1222 0,4 mmol/l bis 4 mmol/l
NADH 0,01 mmol/l bisO,8mmol/i
Puffer, pH 7-9 50 mmol/l bis 500 mmol/l
Mg2+ 1 mmol/l bis 10 Πιιτιοΐ/Ι
ADP (säurefrei) 0,5 mmol/l bis 10 mmol/l
LDH (bestimmt bei 250C) 5 000 mmol/l bis 100 000 E/l
Serumalbumin Og/I bis 5 g/l
GDH (bestimmt bei 250C) 2 500 E/l bis 20 000 E/l
KG (säurefrei) 1 mmol/l bis 10 mmol/l
Bei einer anderen Methode läßt man die Kaliumionen aus Kryptofix"" 221 durch die Natriumionen verdrängen, so daß die freigesetzten Kaliumionen die Aktivität von PK in dem Maße stimulieren wie hoch die Konzentration der Natriumionen ist (Beispiel F).
Die typischen Konzentrationsberaiche die wichtigen Reagenzien für die enzymatische Bestimmung der Natriumionen bei 370C unter Verwendung der Pyruvatkinase, mit der die Verdrängung der Kaliumionen aus Kryptofix"" 221 bestimmt wird, sind:
PK (Kanlnchenm jskeln) 60 E/l bls10000E/l
!1EP (neutralisier ;es Tris-Salz) 0,3mmol/l bit 30 mmol/l
KryptoflxIHI221 1 rr.mol/l bis 10 mmol/l
NADH 0,01 mmol/l bis 0,8 mmol/l
Puffer, pH 9-10 50mmol/l bis 600 mmol/l
Mg1+ ' mmol/l bis 10 mmol/l
ADP(säu.ofrei) 0,5 mmol/l bls10mmol/l
LOH (bestimmt bei 250C) 5 000 E/l bli 100 000 E/l
KCI 2 mmol/l bit 10 mmol/l
Sorumalbumin O g/l bis 5 g/l
GDH (bestimmt bei 25"C) 2 SOO E/l bis 20 000 E/l
KG (säurefrei) 1 mmol/l blsiOmmo'/l
Eine exaktere und präziee Ausführungsform iur Bestimmung wendet ein Natriumionen-abhängigos Enzym an, wie z. B. ß-Galactosidase (Beispiel D).
Blutplasma wird mit einer gepufferten Mischung, die das 2-Nitrophenyl-ß-Ogalactopyranosld (NPG) und das Enzym ß-D-Galactosidase enthält, inkubiert. Die von der ß-D-Galactosidase katalysierte Reaktion ist von dem Vorhandensein von Natriumionen abhängig und demzufolge ist die Aktivitätsrate ein Maß fü die Natriumlonen-Konzontration. Ein grundlegendes Merkmal für diese Methode ist die Verwendung einer entsprechenden M inge an dem selektiv Natrlumlonan bindenden Mittot (z.B. Kryptofix""221) zur Messung im Serum oder anderen biologischer Fluiden, in denen die NaUiumlonen-Konzentration 100 mmol/l übersteigen kann, um damit die Natriumionen-Konzentrat'on herabzusetzen, so daß das Enzym sehr empfindlich auf kleine Veränderungen in der Natriumionen-Konzentration innerhalb des gebräuchlichen analytischen Meßbereichs (110-170mmol/l) reagiert. Unter den für die Analyse gewählten Bedingungen, die das Vorhandensein von mäßig hohen Konzentrationen en Magnesium- und Lithiumionen einschließen, die die Geschwindigkeit der Bildung von 2-Nitrophenol und Galactose tatsächlich zur gemessenen Konzentration an Natriumionen proportional. Magnesiumionen werden für eine optimale fi-üalactosidase-Aktivität benötigt. Lithiumionen konkurrieren mit den Natriumionen und folglich steigt din Kn, des Enr.-ms für Natriumionen.
Als Substrat für die ß-D-Gal&ctosidase sind viele andere Verbindungen geeignet. Ganz allgemein wird die Galactosidase-haltigo Probe mit einem entsprechenden ß-D-Galactosidase-Substrat vermischt, wobei das Substrat von dom Enzym aufgespalten wird und eines von den Spaltprodukten wird auf geoignete Weise detektiort. Entweder wird das Glycon, was durch die Wirkung dos Enzyms freigesetzt wurde, oder aber das Aglycon gemessen. In c'er Hegel wird das letztere bestimmt. Als Substrat kann die natürliche Lactose verwendet werden, aber als besonders vortei hnft erweist sich die Benutzung eines chromogenen Galactosids. So werden in Biochem. Z. 333, S. 209 (1960), das Phe.iyl-ß-D-galactosid wie auch einigo weitere Derivate, die am aromatischen Ring substituiert wurden, wie z. B. 2-Nitrophenyl-ß-D-galactosid (NPG) und 3-Nitrophenyl-ß-D-galactosid, als Substrate für die ß-D-G ilactosidase beschrieben. Die durch Hydrolyse freigesetzten Phenole werden photometrisch im UV-Bereich oder im Felle der Nitrophenole im kurzwelligen sichtbaren Welienlängonberoich bestimmt. Eine oxidative Kopplung mit Aminoantipyrin kann sich als Indikatorreaktion anschließen (siehe Anal. Biochem. 40, S.281 (1971)). Andere Substrate werden in der Deutschen Offenlegungssrhrift 3.345.748 und 3.411.574 beschrieben.
Die typischen Konzentrationsbereiche der wichtigen Reagenzien für die enzymatisch« Bestimmung von Natriumionen bei 37"C unter Verwendung einer 10μΙ Probe aus Plasma oder Serum sind:
ß-D-Galactosidase
KryptofixIRl221
Puffer, pH 7-9,5
EGTA (Lithiumsalz) Serumalbumin EGTA bedeutet Ethylenbis-(oxyethylennitrilo)-tetraessigsäure. Es wird auch möglich sein, die Analyse von Natrium- und Kaliumionen enzymatisch in der gleichen Küvette, In Form eines Doppeltests, durchzuführen (siehe Beispiel G). Die Bestimmung der Calclumlonen
Für die Messung der Calciumio.ien wird eine Blutplasma-Probe (oder eine andere Körperflüssigkeit) mit einer gepufferten Mischung, die das Peptidsubstrat Succinyl-leucin-methionin-p-nitroanilid und das Enzym Calpain I enthält, inkubiert. Die von Calpain I katalysierte Reaktion ist von dem Vorhandensein von Calciumionen abhängig und folglich ist die Aktivitätsrate ein Maß für die Calciumionen-Konzentration. Ein grundlegendes Merkmal bei dieser Methode Ist die Verwendung von Chelatisierungsmitteln, die in der Lage sind, die Calciumionen spezifisch zu binden, um deren Konzentration in den Bereich herabzusetzen, in dem das Enzym ar» - mpfindlichsten anspricht. Unter den für die Analyse gewählten Bedingungen, wobei die Anwesenheit von L-Cystein und 2-Mt. japtoethanol einbezogen wird, ist die Geschwindigkeit der p-Nitroanilin-Bildung tatsächlich der Konzentration an gemessenem Calcium proportional
Bevorzugte Peptidsubstrate lassen sich mit der allgemeinen Formel
R-Pn-P2-P1-X
beschrb'b' :i, wobei R einen Acetyl-, Benzoyl-, Carbobenzoxy-, Succinyl-, Tert-Butoxy-carbonyl- oder 3-(2-furyl-)acryloyl-Rest üar.-rteli'; 'VPj-Pi sind eine Peptidkette mit mindestens zwei Resten unter Bevorzugung für Tyr, Met, Lys oder Arg in der Pr Position und einen Leu- oder Val-Rest in der P2-Position; und X stellt eine chromogene oder fluorogene Gruppe dar, die durch die
25 E/l bis 7 500 E/l
0,25 mmol/l bis 5 mmol/l
0 mmol/l bis 10 mmol/l
200 mmol/l bis 500 mmol/l
0,01 mmol/l bis 10 mmol/l
0 mmol/l bis 20 mmol/l
Og/I bis S g/l
Wirkung des Enzyme freigesetzt wird und zu einer dotektierbaren Färb- oder Fluoreszenzänderung führt. X kann ein Nitrophenyl-, Naphthyl- oder Thiobenzylester, aber auch eine Nitroanilin-, Naphthylamln- oder Methylcumarin-Gruppe mit oder ohne weiteren Substituenten am aromatischen Ring :ein. Einige geeignete Peptid-Derivate wurden auch von T. Sasaki und Mitarb, im J. Bio). Chetn. 259, S. 12489-12494, beschrieben, als Beispiele seien genannt Succinyl-Leu-Met-MCA (MCA = 4-Methylcumarin-7-amid), Succinyl-Leu-Tyr-MCA, Succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA und tert-Butoxy-carbonyl-Val-Leu-Lys-MCA. Weitere synthetische Substrate werden irn Bergmeyer HU (Herausg.), Methoden der enzymatfschen Analyse, 3. Aufl., Bd. 5, S.84-85 (1984), beschrieben
Dio Konzentrationsbereiche der Verbindungen für solch eine Bestimmungsmethode und der Reagenzien sind:
Calpainl
Suc-Leu-Met-p-nitroanilid Chelatisierungsmittel
L-Cystein
2-Mercaptoethanol
Puffer Imidazol-HCI
pH 6-8 (bevorzugter Bereich 7-7,5)
Das Sternchen bedeutet, daß die Einheit als Enzymmenge definiert ist, bei der die Absorbanz bei 750 nm nach 30 min Inkubation bei 3O0C mit Casein als Substrat um 1,0 erhöht wird (N. Yoshimura und Mitarb., J. Biol. Chem. 258, S.8883-8889 [1983]). Jeder Puffer, der in dem geforderten pH-Bereich einen pK-Wert besitzt und für Calcium eine vernachlässigbare Bindekapazität aufweist, kann bei dem Test eingesetzt werden. Gute Puffer sind (nach N. E. Good und Mitarb., Biochem. 5, S. 467-477 [1966]) z. B. Tris, HEPES, MOPSO, BES, TES und Imidazol, die diese Anforderungen erfüllen (siehe Beispiel H). Anstelle von Calpain I kann Collagenase verwendet werden und die Bestimmung wird mit 0,02 bis 0,2 mmol/l an L-lsoleucyl-L-analylglycyl-ethylester beim pH 6,5-7,5 fluorometrisch vorgenommen.
Die Bestimmung von Chloridionen Bei der Bestimmung von Chlorid im Blut wird das Plasma mit einer gepufferten Mischung aus 0,01 mol/l Cv „teamin, 4 mmol/l Gly-Phe-p-nitroanilid und 0,02 E/ml Cathepsin C inkubiert. Die Bildung von p-Nitroanilin ist völlig von den. Vorhandensein der Chloridionen abhängig. Darüber hinaus können selektive Bindemittel zugesetzt werden, um die Störung durch Bromidionen zu
eliminieren oder die Aktivität der Chloridionen herabzusetzen, so daß ihre Konzentration auf den optimalen Bereich für das
Enzym eingestellt wird. Unter den für die Analyse gewählten Bedingungen (siehe Beispiel 5) ist die Bildungsrate a η p-Nitroanilin
1000 E/l bis 40 000 Ε/Γ1
1 mmo!/l bis 20 mmol/l
0,01 mmol/l bis 1 mmol/l
1 mmol/l bis 10 mmol/l
1 mmol/l bis 10 mmol/l
10 mmol/l bis 100 mmol/l
Gly-Arg-MI!-0-MOo -2SiL1SL3SiD-S-) Gly-Arg + H9M-Ji-MO9
der Konzentration an Chloridionen in der Probe proportional. In diesem Beispiel wird die Reaktionsgeschwindigkeit durch
Messung von der Absorptionszunahme bei 405 nm bestimmt. Die Konzentrationsbereiche von den Verbindungen bei einer derartigen Bestimmungsmethode sind: Citratpuffer 0,01-0,2 mol/l
pH 4 -7 (bevorzugt: 5,0-5,5)
Cysteamin 1 -20 mmol/l Gly-Arg-p-nitroanilid 1 -20 mmol/l Cathepsin C 2 -100mE/ml Jeder Puffer, der in dem geforderten pH-Bereich einen pK-Wert besitzt und eine vernachlässigbare Chloridkonzentration
aufweist, kann bei dem Test eingesetzt weiden. Beispiele für Enzyme aus allen oben aufgelisteten Kategorien (Transferasen,
Hydrolasen, Oxidoreduktasen und Lyasen) besitzen, wie aus der Literatur hervorgeht, eine Chloridabhängigkeit, insbesondere
dann, wenn die Enzyme aus halophilen Organismen stammen. Über die Chloridabhängigkeit von Enzymen des Peptidase-Typswurde bereits ausführlich geschrieben. Zum Beispiel katalysieren sowohl die Dipeptidylpeptidase I (Cathepsin C), EC 3.4.14.1 (J.
Ken McDonald, Bioch. Bioph. Res. Communication 24 [5] 1966, S.771 f) als auch die Dipeptidylpeptidase III, EC 3.4.14.3 (J. Ken McDonald, J. Biol. Chem. 241 (7) 1966, S. 1494 f.) die Hydrolyse von Oligopeptid-Derivaten von deren endständiger Aminogruppe
aus. Ein anderes Beispiel ist das Umwandlungsenzym Angiotensin, EC 3.4.15.1, eine Dipeptidylcarboxypeptidase, die bei einerbreiten Palette von Oligopeptiden an deren endständiger Carboxylgruppe die hydrolytische Freisetzung von Dipeptidenkatalysiert (P.Bunning und Mitarb., Bioch. 26,1987, S.3374 f.; R.Shapiro und Mitarb., Bioch. 22,1983, S.3850 f.).
Anstelle von Gly-Arg-p-nitroanilid lassen sich auch völlig andere Dipeptid- oder Oligipeptid-Substrate verwenden. Bevorzugte Peptid-Substrate können durch die allgemeine Formel
R-Pn-P1-X
beschrieben werden, wobei sich bei den Dipeptidylpeptidase-Enzymen mit R = H und Pn - P1 eine Peptidkette mit mindestens zwei endständigen Gruppen ergibt, X stellt eine chromogene oder fluorogene Gruppe dar, die durch die Wirkung des Enzyms freigesetzt wird, so daß sich eine detektierbare Färb- oder Fluoreszenzänderung ergibt. Dabei kann X ein Nitrophenyl-, Naphthyl- oder Thiobenzylester oder aber eine Nitroanilin·, Naphthylamin- oder Methylcumarin-Gruppe sein, wobei sich am aromatischen Ring keine oder weitere Substituenten befinden können. Im Falle von dem Dipeptidylcarboxypeptidase-Enzym stellt X die endständige Aminogruppe dar und auf der anderen Seite von ddt Peptidkette ist R eine chromogene oder fluorogene Gruppe, die durch die Wirkung des Enzyms freigesetzt wird. Bei R kann es s ch um eine N-2-Furanacryloyl- oder Benzoyl-Gruppe mit oder ohne weiteren Substituenten handeln (siehe Beispiel I).
Bei einem weiteren Beispiel zur enzymatischen Bestimmung von Chloridionen (Beispiel J) wird Plasma mit einem gepufferten Gemisch aus 4,6-Ethyliden(G7)-p-nitrophenyl(G1)-, D-maltopheptaosld (4,6-Ethyliden-G7PNP) (5 mmol/l), a-Amyldse (0,60E/ml) und a-Glucosidase (= 30E/ml) inkubiert. Die Bildung von p-Nitrophenol ist vollkommen von dem Vorhandensein der Chloridanionen abhängig, wobei wiederum entweder die Vorverdünnung, kleine ProbeivOlumina oder selektive Bindemittel zur Anwendung gelangen, um die Chloridionen-Konzentration auf den optimalen Enzymbereich einzustellen. Das Testprinzip wird unten zusammengefaßt. Die Reaktionsgeschwindigkeit wird durch die Messung der Absorptionszunahme bei 405 nm bestimmt.
5 Sthyliden-G7PHP + 5 l!p0 «^
Gl"
2-Ethyliden-G8 + 2 G2PNP + 2 Ethyliden-G4 + 2 G3PNP + Ethylider-G3 + G4PNP
?. G0PIlP + G,PMP + 10 l!o0 -ίίζ23:αΞ22^β22—) A p>v + 10 G
(P'.'.P a p-'litrophenol,· G a Glucose) Die Konzentrhtionsbereiche der Verbindungen, die bei einer derartigen Bestimmung eingesetzt werden, sind:
HEPES oder ein anderer, chloridfreier Puffer 0,01-0,5 mmol/l
pH 6,5-7,5
a-Amylase 60-6 000 E/l
a-Glucosid&se 3 000-300 000 E/l
4,6-Ethyliden-G7PNP 0,5-10 mmol/l.
Die oben bei Cathepsin C (Beispiel I) diskutierten Testvariationen lassen sich auch auf das Beispiel J anwenden. Die Bestimmung von Schwermetallionen
Diese Metalle werden von Cryptanden wie Kryptofix"" 221 und Kryptofix"" 222 fest gebunden. Von ihnen werden deshalb andere Metalle verdrängt, die nur locker gebunden sind. Ein Beispiel für ein leicht zu verdrängendes Metallion ist Zink. Zinkionen kommen im Plasma in einer sehr niedrigen Konzentration vor. Demzufolge ist es möglich, die an K 221 komplex gebundenen Zinkionen einem gepufferten Serumgemisch zuzusetzen. Wenn ein Schwermetall vorhanden ist, werden Zinkionen freigesetzt, und ihr Auftreten wird durch die Stimulierung von Pyridoxalkinase (aus dem Gehirn von Schafen) ermittelt. Dies ist ein Enzym mit hoher Empfindlichkeit auf Zinkionen. Viele weitere und ähnliche Bindungstests sind durchführbar, so daß das beschriebene Assay nur als Beispiel angeführt wurde und nicht auf dieses begrenzt ist
Die Bestimmung von Hydrogencarbonationen
Die Hydrogencarbonationen lassen sich unter Variation der in dieser Erfindung dargestellten Prinzipien messen. Viele Liganden, z. B. von den Cryptanden, siknci pH-empfindlich, und diese Eigenschaft läßt sich bei der Messung von Hydrogencarbonat ausnutzen. Wichtig dabei ist der Vorteil, daß Hydrogencarbonat in der Lage ist, Protonen zu neutralisieren. Es läßt sich zeigen, daß sich der pH-Wert einer sehr leicht gepufferten Serumprobe, der Salzsäure zugesetzt wurde, als Funktion der Hydrogencarbonat-Konzentratinn verändert. Der End-pH-Wert wird durch den Gehalt an freien Natriumionen (mit ß-Gelactosidase) erfaßt, die bei Vorhandensein eines pH-sensitiven loinenbindemittels, wie z. B. Kryptofix"" 221, auftreten und diese stellen eine Funktion der ursprünglichen Hydrogencarbonat-Konzentration dar. Im wesentlichen wird so vorgegangen, daß das Serum mit dem gleichen Volumen Salzsäure (75 mmol/l) auf einen pH-Wert von etwa 4,5 eingestellt wird, um alle Hydrogencarbonat- in Hydroxylionen umzuwandeln. Anschließend reagiert es mit einem Testsystem beim pH 7,5-7,8 unter Verwendung eines verdünnten Tris-Puffers (5 mmol/l), wobei das System ein Ionen-selektives Enzym, z. B. ß-Galactosidase, und ein entsprechend pH-empfindliches lonenbindemittel enthält. Die Natriumionen-Konzentration der Probe muß bekannt sein, um genaue Ergebnisse zu erhalten, da eine notwendige Korrektur auf Basis des Natriumionen-Gehalts der Probe vorzunehmen ist. Diese Methode ist wesentlich empfindlicher als die Verfahren mit chromogenen Indikatoren für die Erfassung des pH-Wertes (Beispiel K).
Die typischen Konzentrationsbereiche der wichtigen Reagenzien für die enzymatische Bestimmung von Hydrogencarbonationen bei 37°C und unter Verwendung einer 10-μΙ- Plasma- oder Serumprobe sind:
ß-D-Galactosidase 250 E/l bis 7 500 E/l
NPG 0,25 mmol/l bis 5 mmol/l
Kryptofix"" 221 0,2 mmol/l bis 5 mmol/l
Puffer, pH 7,5-7,8 1 mmol/l bisiOmnol/l
Mg2+ 0,01 mmol/l bis 10 mmol/l
EGTA(Li-SaIz) 0,1 mmol/l bis 5 mmol/l
Serumalbumin 0g/l bis 5 g/l.
Die Notwendigkeit zur Korrektur bei der Natriumionen-Konzentration läßt sich durch die Verwendung eines Enzyms (z. B. Pyridoxalkinase) umgehen, welches empfindlich auf Spurenmetalle (z. B. Zinkionen) reagiert, die im Normalfall in einer mikromolaren Konzentration im Plasma vorliegen. Vorausgesetzt, daß die Bindung des Spurenmetalls uj diesem Bindemittel pH-sensitiv erfolgt und es eine eine vergleichbare Affinität wie die Natriumionen zu Kryptofix"" 221 besitzt, lassen sich auch Hydrogencarbonationen bestimmen, wobei neben den bereits im Plasma vorliegenden Zinkionen davon woitere in ausreichender Konzentration dem Reaktionsgemisch zugesetzt werden. Folglich kommt es zu keiner Störung durch die endogenen Zinkionen.
Die oben beschriebenen Methoden sind einfach, sehr schnell, genau und präzise und lassen sich mit kostengünstigen Apparaturen durchführen. Die Laborgefährdung durch brennbare Gase läßt sich ebenso vermeiden wie viele Probleme, dio im Zusammenhang mit ionenselektiven Elektroden auftreten. Die Methode läßt sich bei ihrer Anwendung mit einer großen Ausrüstung koppeln, an der verschiedene Analysen durchgeführt werden, sie kann aber auch bei Notfallsituationen in der Nähe der Bettstelle mit billigen Einzelgeräten Verwendung finden. Die Abpackung in Form eines Testbestecks befindet sich in der Entwicklung. Außerdem können die Bestimmung von Kalium- und Natriumionen-Konzentrationen nacheinander in der gleichen Küvette vorgenommen werden (Beispiel G). Es ist auch vorgesehen, daß die Methode, die sich in der Sprechstunde des Arztes nutzbringend anwenden läßt, in einem Gerät und unter Verwendung von Trockenchemikalien durchgeführt werden kann. Obwohl diese Methode für den Einsatz bei automatischen Spektrometer^ entwickelt wurde, läßt sie sich ohne weiteres auch an automatischen und an per Hand betriebenen Laborausrüstungen, wie Fluorometern, Luminometern, Isotopenzählgeräten usw., anpassen.
Ausführungsbeispiel
Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele ausführlicher beschrieben, wobei hiervon einem Probevolumen voi. ιομΐ an Plasma oder Serum ausgegangen wird.
Bei den folgenden Beispielen wird ein kleines Probevolumen (10μΙ, falls keine anderen Aussagen beim Serum oder Plasma gemacht werden) mit dem Reagenz 1 gemischt, dies enthält eine bestimmte Zeit, im allgemeinen 0,1-5 min., inkubiert. Während der Inkubationszeit werden die Absorbanzwerte ganz normal und in regelmäßigen Abständen abgelesen. Das Reagenz 2, was den Indikator in Form eines Enzyms enthält, wird danach zugesetzt und die Reaktionsgeschwindigkeit verfolgt. In einigen Beispielen enthält das Reagenz 1 das Indikatorenzym und das Reagenz 2 das entsprechende Substrat. In den Beispiolon sind die fertigen Reaktionsmischungen angegeben, nachdem die Probe, das Reagenz 1 und das Reagenz 2 vermischt wurden.
Beispiel A Messung der Kaliumlonen-Konsentratior. unter Verwendung von Pyruvatkinase ohne ein Natriumionen-Bindemittel, die Natriumionen-Konzentration Ist unbekannt. Die fertige Inkubationsmischung enthält:
175mmol/l Tris-HCI-Puffer, pH 7,4 20 mmol/l Li+ (17 mmol/l LiOH, 3mmol/l LiCI) 3,0 mmol/l MnCI2 2,6 mmol/l ADP (säurefrei) 2,9 mmol/l PEP (neutralisiertes Tris-Salz) 0,4 mmol/l NADH 17 000 E/l LDH (Bestimmt bei 25°C)
890 E/l PK von Bacillus stearothermophilus
4,0 mmol/l KG
8 600 E/l GDH (in Glycerol; bestimmt bei 250C) 140 mg/l menschlich s·« Serumalbumin
Kaliumionen-Standards (Kalibierlösungen) enthalten 140 mrnol/l Natriumionen, um den Stimulationseffekt der im Plasma vorhandenen Natriumionen auf die Pyruvatkinase zu kompensieren.
Beispiel B Messung der Kaliumionen-Konzentration unter Verwendung von Pyruvatkinase ohne ein Natriumionen-Bindemittel, die Natriumionen-Konzentration Ist bekannt Die Inkubationsmischung und die Kalibrierlösung sind die gleichen wie beim Beispiel A. Es wird eine Korrektur für die Natriumionen-Konzentration der Mischung vorgenommen, indem 0,1 mmol/l Kalium für jeweils
10 mmol/l Natriumionen-Konz sntration unter (oder über) 140 mmol/l Natriumionen zuaddiert (oder abgezogen) werden. Diese
Korrektur muß jedoch durch die Analyse von wäßrigen Lösungen, die bekannte Natrium- und Kalium-Konzentrationen enthalten,
nachgeprüft werden.
Beispiel C Messung ds,- Ksüumlonen-Kunzentraiion unter Verwendung von Pyruvatkinase bei Anwesenheit eines Natrlumlonen- Bindemlttels Wie beim Beispiel B, jedoch wird das menschliche Serumalbumin weggelassen, und das Medium erhält zusätzlich 6μπιοΙ Kryptofix"" 221 pro Assay. Es wird der pH-Wert 7,8 gewählt, um die Variationen durch die Verdrängung der Natriumionen aus
dem Kryptofix"" 221 zu minimieren, was auf den unterschiedlichen Kaüumionen-uehalt der einzelnen Proben zurückzuführen ist.
Beispiel D Messung der Natriumionen-Konzentration unter Verwendung von ß-D-Glaactosidase Variation a: Die fertige Inkubationsmischung enthält:
300 mmol/l Tris HCI, pH 8,7 (bei 370C)
4 mmof/l Dithiothreitol
7,5 mmol/l Magnesiumsulfat 16 mmol/l Lithiumchlorid
0,44 mmol/l EGTA (Lithiumsalz)
jk 460 mg/l menschliches Serumalbumin
" 760 E/l ß-Galactosidase
1,b mmol/l NPG 1,25 pmol/Assay Kryptofix""
Die Reaktion wird bei 420 nrn (oder bei einer in dar Nähe befindlichen Wellenlänge) beobachtet, um die Bildungsrate an freiem 2-Nitrophenol und folglich die Konzentration der Natriumionen in der Originalprobe zu bestimmen.
Variation b: Eine alternative Vorgehensweise im Vergleich zur Variation a wäre die, die Probenkonzentration um das Zehnfache durch Vorverdünnung oder Verwendung eines kleinen Probenvolumtns herabzusetzen, so daß in dem Falle der Cryptand entfallen könnt 9.
Variation c: Die Messung in Dulden mit niedrigem Natriumionen-Gehalt (z. B. kleiner 20mmol/l), wobei in dem Falle der Cryptand weggelassen werden könnte.
Beispiel E Messung der Natriumionen mit Pyruvatkinnse (direkte Stimulierung der Enzymaktivität durch Natriumionen unter Bedingungen, wo die Empfindlichkeit von Kaliumionen herabgesetzt wird)
Variation a: Die Inkubationsmischung enthält bei ein ιΜΟμΙ Plasmaprobe:
300 mmol/l Tris HCI, pH 8,7 (bei 37 0C) 5 mmol/l MgCI2 2,6 mmol/l ADP (säurefrei) 2,9 mmol/l PEP (neutralisiertes Tris-Salz) 0,34 mmol/l NADH 17 000 E/l LDH (bestimmt bei 25 "C) 2 000 E/l PK (aus Kaninchenmuskeln, bestimmt bei 37 0C)
4 mmol/l KG
8 600 E/l GDH in Glycerol (bestimmt bei 25 0C) 1,25 pmol/'Assay Kryptofix""
Die Natriumionen-Kalibierlösungen enthalten 4mmol/l Kalium, um don Kaliumaktivierungseffekt beim Serum, der durch Kaliumionen bei der Pyruvatkinase hervorgerufen wird, zu kompensieren.
Beispiel F
Messung der Natriumionen mit Pyruvatkinase (konkurrierendet Blndeassay) — die Kaliumionen-Konzentration ist bekannt Die fertige Inkubationsmischung enthält für eine 10-pl-Plasmaprobe:
300 mmol/l Glycin, pH 9,8
5 mmol/l MgCI2
2,6 mmol/l ADP (säurefrei) 2,9 mmol/l PEP (neutralisiertes Tris-Salz) 0,34 mmol/l NADH 17 000 E/l LDH (bestimmt bei 25 0C) 890 E/l PK aus Kaninchenmuskeln (bestimmt bei 37 0C)
4 mmol/l KG
8 500 E/l GDH (bestimmt bei 250C)
5 mmol/l KCI
2,5 Mmol/Assay Kryprofixirt/
Es wird diesem Reagenz Kaliumchlorid zugesetzt, und stöchiomotrisch verdrängt es von Kryptofix"" 221 die Natriumionen, folglich ist es möglich, die Natriumionen-Konzentration der Probe zu quantifizisren.
Beispiel G Messung von der Kalium- und Natriumionen-Konzentration in der gleichen Küvette (Doppeltest)
Die Natriumionen-Konzentration wird zunächst wie Uv Beispiel D bestimmt, wobei das Assay auch en?häii.
2.6 mmo!/! ADP (säurefrei) 2,3 mmoS/l PEP (neutralisiertes Tris-Salz) 0,4 mmol/l NaPH 4,0 mmol/l KG 8 600 E/l GDH
Nach der Messung der Natriumionen mit Hilfe der Ermittlung der Reaktionsrate wird der pH-Wert der Inkubationsmischung auf 7,4 mit einer aliquoten Salzsäuremenge herabgesetzt.
Danach werden die folgenden Bestandteile zugegeben, um die angegebenen Endkonzentrationen zu erreichen:
17 000 mmol/l LDH
890 E/l PK von Bacillus stearothermophilus 3,0 mmol/l MnCI2 20,0 mmol/l LiCI
Die Reaktionsrate läßt sich bei 340 nm verfolgen, sie kann aber auch bei einer geringfügig höheren Wellenlänge gemessen werden, um eine mögliche Störung durch das 2-Nitrophenol zu minimieren, was bei der Natriumionen-Indikatorreaktion freigesetzt wurde.
Beispiel H Messung der Kalzlumlonen-Konzentratlon unter Verwendung von Calpaln I
Bei dieser Ausführungsform wird eine kleine Menge Blut für den Erhalt von Plasma zentrifugiert. Zur Messung der Calciumionen in der Probe wird diese mit einer Mischung inkubiert, die 50mmol/l Imidazol-HCI-Puffer, pH7,3,5mmol/l L-Cystein, 2,5mmol/l 2-Mercaptoethanol, 0,1 mmol/l EGTA und 5mmol/l Suc-Leu-Met-p-nitroanilid enthält, wobei di 3 Inkubationstemperatur 30°C beträgt. Die Zunahme der Absorbanz bei 405ηm wird über einen Zeitraum von 5 Minuten verfc Igt. Die Geschwindigkeit ist der Calciumionen-Konzentration der Probe proportional.
Beispiel I Messung der Chloridionen-Konzentration unter Verwendung von Cathepsin C
Bei dieser Ausführungsform wird eine kleine Menge Blut zentrifugiert, um Plasma (5 μΙ) zu erhalten. Zur Messung des Chloridions enthält die Inkubationsmischung 0,05mmol/l Citratpuffer. pH5,0,10mmol/l Cysteamin und 4 mmol/l Gly-Arg-p-nitroanilid sowie 0,01 E/Iml Cathepsin C. Letzteres wurde gegen 10mmol/l Natriumphosphat-Puffei (pH6,8) und 43% (v/v) Glycerol dyalisiert, um Chloridionen zu entfernen. Eine typische Kalibrierkurve, die auf diese Weise erhalten wurde, wird in der Abbildung 1 gezeigt.
Beispiel J Messung der Chloridionen-Konzentration unter Verwendung von a-Amylase
Die Inhibitionsmischung enthält für eine 5μΙ Plasmaprobe:
HEPES oder ein anderer, chloridfreier Puffer 100 mmol/l
pH 7,1
a-Amylase 600 E/l
a-Glucosidase 30 000 E/l
4,6-^hVHdBn-G7PNP 5 mmol/l
Die Reaktion wird bei 405 nm (oder eine nahegelegenen Wellenlänge) verfolgt, um die Bildungsrate an freiem 4-Nitrophenol und folglich die Konzentration der in der ursprünglichen Probe vorhandenen Chloridionen zu bestimmen.
Beispiel K Messung der Hydrogencarbonationen-Konzentratlon unter Verwendung von ß-D-Galactosldase
Variation a: Die fertige Inkubationsmischung enthält:
5 mmol/l Tris-HCI, pH 7,8 (bei 370C) 4 mmol/l Dithiothreitol 7,5 mmol/l Magnesiumsulfat 16 mmol/l Lithiumchloi id 0,44 mmol/l EGTA (Lithiumsalz) 460 mg/l menschliches Serumaloumin 1 500 E/l ß-Galactosidase 1,5 mmol/l NPG 2,0 μητιοΙ/Assay Kryptofix"" 221
EGTA heißt Ethylenbis-(oxyethylennitrilo)-tetraessigsäure. Die Probe wird mit einem äquivalenten Volumen an HCI (beim Plasma mit 75mmol/l) vorinkubiert, um den pH-Wert der Probe auf 4,5 herabzusetzen. Die Reaktion wird dann bei 420nm (odor einer benachbarten Wellenlänge) verfolgt, um die Bildungsrate an freiem 2-Nitrophenol und folglich die Konzentration der Hydrogencarbonationen in der ursprünglichen Probe zu bestimmen. Eine Korrektur wird für die in der Originalprobe vorhandene Natriumionen-Konzentration vorgenommen
Variation b: Anstelle von ß-Galactosidase unc' NGP werden Pyridoxalkinaso, Pyridoxal- und Zinkionen verwendet.

Claims (44)

1. Verfahren zur Bestimmung von Ionen in Fluiden, gekennzeichnet dadurch, daß der Einfluß von diesen Ionen auf die Aktivität eines Enzyms ermittelt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Fluid sowohl ein biologisches als auch ein nicht biologisches Fluid sein kann.
3. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß das biologische Fluid Blut, Serum, Plasma, Urin, Schweiß, Hirn-Rückenmark-Flüssigkeit, Lumph- und Darmsekretionen, Exudate oder Transsudate sein kann und es sich bei dem nichtbiologischen Fluid um Wasser oder einen wäßrigen Extrakt oder um eine Mischung handelt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, gekennzeichnet dadurch, daß das Enzym eine Transferase, eine Hydrolase, eine Oxidoreduktase oder eine Lyase ist.
5. Verfahren naoh Anspruch 4, gekennzeichnet daduich, daß die Transferase in der Lage ist, phosphorhaltige Gruppen zu übertragen, und es sich bei der Hydrolase um eine Glycosidase handelt bzw. diese auf Pept'dbindungon einwirkt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei der Hydrolase um α- oder ß-D-Galactosidase, Carboxypeptidase A, Collagenase, Amylase, Calpain I, Caipain II, Dipeptidylaminopeptidase I (Cathepsin C) oder Phosphoglycollat-phosphaiase handelt.
7. Verfahren nach Anspruch 5, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei der Transferase um Pyruvatkinase, Hexokinase, Adenylatkinase, Pyridoxylkinase oder Acetatkinase und bei der Hydrolase um α- oder ß-D-Galactosidase oder Carboxypeptidase A handelt.
8. Verfahren nach Anspruch 4, gekennzeichnet dadurch, daß die Oxidoreductase auf die CH-OH-Gruppe von Denormolekühlen oder auf die Aldehyd- oder Oxo-Gruppe von Donoren einwirkt.
9. Verfahren nach Anspruch 7, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei der Oxidoreduktase um Glyceroldehydrogenase, Acetaldehyd-dehydrogenase oder um Tyrosinase (Catechloxidase) handelt.
10. Verfahren nach Anspruch 4, gekennzeichnet dadurch, daß bei der Lyase eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Lyase oder eine Kohlenstoff-Sauerstoff-Lyase vorliegt.
11. Verfahren nach Anspruch 9, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei der Lyase um eine Aldolase oder eine Carbonhydrase handelt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-11, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem lon um Kalium, Natrium, Calcium, Magnesium, Mangan, Lithium, Blei, Zink, Kupfer, Eisen und andere Schwermetalle oder Nichtmetallionen wie Protonen, Hydrogencarbonat, Chlorid, Ammonium bzw. Substanzen, die einen Anstieg von Ammonium bewirken, handelt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-11, gekennzeichnet dadurch, daß Störionen mit einem Bindemittel maskiert werden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-12, gekennzeichnet dadurch, daß das zu bestimmende lon auf den für die Messung optimalen Konzentrationsbereich unter Zuhilfenahme eines Bindemittels erniedrigt wird, wenn eine Verdünnung der Probe nicht möglich ist.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-14, gekennzeichnet dadurch, daß Kaliumionen unter Verwendung von Pyruvatkinase, Glycerolhydrogenase oder Acetaldehyd-dehydrogenase bestimmt wird.
16. Verfahren nach den Ansprüchen 1-14, gekennzeichnet dadurch, daß Natriumionen unter Verwendung des Enzyms Pyruvatkinase oder ß-D-Galactosidase bestimmt wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 und 14, gekennzeichnet dadurch, daß die Störionen oder die zu bestimmenden Komponenten durch Kryptanden, Coronanden, Podanden, Kronenether, Spheranden, Hemispheranden, Calixarene und Kombinationen davon, durch natürlich vorkommende lonophore, cyclische Peptide, Komplexone und Chelatbildner sowie Derivate davon, Metalle der 1. und 2. Nebengruppe des Periodensystems der Elemente gebunden werden.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 11-Ί7, gekennzeichnet dadurch, daß bei der Bestimmung der Kaliumionen die störenden Natriumionen von Kryptofix(RI 221 gebunden werden und daß bei der Bestimmung von Natriumionen die störenden Kaliumionen von Kryptofix(R) 222 gebunden werden.
19. Verfahren nach Anspruch 14, gekennzeichnet dadurch, daß bei der Bestimmung von Natriumionen unter Verwendung von ß-Calactosidase die Konzentration an freien Natriumionen mit einem Bindemittel herabgesetzt wird.
20. Verfahren nach Anspruch 14, gekennzeichnet dadurch, daß das Bindemittel Kryptofix(R) 221 ist.
21. Verfahren nach Anspruch 14, gekennzeichnet dadurch, daß die Bindemittel, die gemäß Anspruch 17 vorhanden sind, einen Komplex mit den Indikatorionen eingehen und von denen die Indikatorionen stöchiometrisch von den Ionen verdrängt werden, die die zu bes»:mmenden Komponenten darstellen, wobei der Einfluß der zu verdrängenden Indikatorionen auf die Aktivität des Enzyms ermittelt wird und sich dadurch ein indirektes Maß für die Konzentration der zu bestimmenden Komponenten ergibt.
22. Verfahren nach Anspruch 21, gekennzeichnet dadurch, daß das Enzym Pyruvatkinase die Indikatorionen Kalium und das Bindemittel Kryptofix(R) 221 sowie das zu bestimmende lon Natrium sind.
23. Verfahren nach Anspruch 21, gekennzeichnet dadurch, daß das Enzym eine Kinase, das Indikatorion Mg2+, das Bindemittel ein Chelatbildner und das lon ein Metall sind.
24. Verfahren nach Anspruch 23, gekennzeichnet dadurch, daß das Enzym Pyridoxalkinase, das Indikatorion Zn2+, das Bindemittel Kryptofix(R) 221 und das lon ein Schwermetall sind.
25. Verfahren nach Anspruch 21, gekennzeichnet dadurch, daß die zu bestimmenden Ionen eine Veränderung beim pH-Wert herverrufen, was die Indikatorionen aus dem Komplex mit einem pH-Wert hervorrufen, was die Indikatorionen aus dem Komplex mit einem pH-sensitiven Bindemittel verdrängt.
26. Verfahren nach Anspruch 25, gekennzeichnet dadurch, daß das Enzym ß-Galactosidase, das pH-sensitive Bindemittel Kryptofix(R) 221, die Indikatorionen Natrium und das zu bestimmende lon Hydrogenkarbonat sind.
27. Verfahren nach Anspruch 14 und 17, gekennzeichnet dadurch, daß das Enzym a-Amylase oder Cathepsin C, das Bindemittel Ag und Hg und das zu bestimmende lon Chlorid sind.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 und 17, gekennzeichnet dadurch, daß das Enzym Collagenase oder Calpain I oder Calpain II, das Bildemittel ein Chelatbildner und das zu bestimmende lon Calcium ist.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-13, gekennzeichnet dadurch, daß bei dem Assay konkurrierende Inhibitoren für das sensitive Indikatorenzym einbezogen werden.
30. Verfahren nach Anspruch 29, gekennzeichnet dadurch, daß die zu bestimmenden Ionen Natrium oder Kalium sind und der konkurrierende Inhibitor das Lithiumion ist.
31. Zusammensetzung für die Bestimmung von Ionen in Fluiden, gekennzeichnet dadurch, daß sie ein Enzym, dessen Aktivität durch das lon beeinflußt wird, umfaßt.
32. Zusammensetzung für die Bestimmung von Ionen in Fluiden nach Anspruch 31, gekennzeichnet dadurch, daß sie umfaßt ein Enzym, dessen Aktivität durch das lon beeinflußt wird, und ein Bindemittel, das die Störionen in dem Fluid bindet oder die Konzentration der zu bestimmenden Ionen auf für die Messung optimale Gehalte erniedrigt.
33. Zusammensetzung nach Anspruch 32 zur Bestimmung von Kaüumionen, gekennzeichnet dadurch, daß sie umfaßt Pyruvatkinase und einen Cryptanden.
34. Zusammensetzung nach Anspruch 33, gekennzeichnet dadurch, daß der CryptandKryptofixIR) 221 ist.
35. Zusammensetzung nach Anspruch 32 für die Bestimmung der Natriumionen, gekennzeichnet dadurch, daß sie umfaßt Pyruvatkinase und einen Cryptanden.
36. Zusammensetzung nach Anspruch 35, gekennzeichnet dadurch, daß der Cryptand Kryptofix(R> 222 ist.
37. Zusammensetzung nach Anspruch 32 für die Bestimmung von Natriumionen, gekennzeichnet dadurch, daß sie umfaßt ß-D-Galactosidase und einen Cryptanden.
38. Zusammensetzung nach Anspruch 37,gekennzeichnetdadurch,daßaerCryptandKryptofix(R)221 ist.
39. Zusammensetzung nach Anspruch 31, gekennzeichnet dadurch, daß sie umfaßt:
PK(B.stearothermophilus) 50E/I bis10000E/l
PEP (neutralisiertesTris-Salz) 0,3 mmol/l bis 30 mmol/l
Kryptofix(R) 221 0 mmol/l bis 30 mmol/l
NADH 0,01 mmol/lbis 0,8 mmol/l
Puffer, pH 7-8 50 mmol/l bis 500 mmol/l Mn2+oderMg2+ 1 mmol/l bisiOmmol/l
LiCI 2 mmol/l bis 100 mmol/l
ADP(säurefrei) 0,5mmol/l bisiOmmol/l
LDH (bestimmt bei 250C) 5 OOO E/l bis 100 000 E/l
Serumalbmin O g/l bis 5 g/l
GDH (bestimmt bei 25°C) 2 500 E/l bis 20 000 E/l
KG (säurefrei) 1 mmol/l bis10mmol/l
40. Zusammensetzung nach Anspruch 31, gekennzeichnet dadurch, daß sie umfaßt:
Glyceroldehydrogenase 50 E/l bis 1000 E/l
Glycerol 0,3 rnol/l bis3mol/l
Kryptcfix|R) 221 0 mmol/l bis 30 mmol/l
NAD 0,1 mmol/l bis 5,0 mmol/l
Puffer, pH 9 20 mmol/l bis 500 mmol/l
Serumalbumin Og/I bis 5 g/l
GDH (bestimmt bei 250C) 2 500 E/l bis 20 000 E/l
KG (säurefrei) 1 mmoL'l bis 10 mmol/l
41. Zusammensetzung nach Anspruch 31, gekennzeichnet dadurch, daß sie umfaßt:
Acetaldehyd-dehydrogenase 50 E/l bis 10 000 E/l
Glycolaldehyd 0,3 mmol/l bis 30 mmol/l
Kryptofix(R) 221 0 mmol/l bis 30 mmol/l
NAD 0,05 mmol/l bis 2,0 mmol/l
Puffer, pH 7-8 50 mmol/l bis 500 mmol/l
Dithiothreitol 0,1 mmol/l bis 2 mmol/l
Serumalbumin Og/I bis 5 g/l
GDH (bestimmt bei 250C 2 500 E/i bis 20 000 E/l
KG (säurefrei) 1 mmol/l bis 10 mmol/l
42. Zusammensetzung nach Anspruch 31, gekennzeichnet dadurch, daß sie umfaßt:
Acetalehyd-dehydrogenase 50 E/l bis 10 000 E/l
4-Nitrophenylacetat 0,1 mmol/l bis 2 mmol/l
Kryptofix(R) 221 0mmol/l bis30mmol/l
NADH 0,001 mmo!/|bis(>,1 mmol/l
Puffer, pH 7-8 50 mmol/l bis 500 mmol/l
Dithiothreitol 0,1 mmol/l bis 2,0 mmol/l
Serumalbumin Og/I bis 5 g/l
GDH (bestimmt bei 25°C) 2 500 E/l bis 20 000 E/l
KG (säurefrei) 1 mmol/l bis10mmol/l
43. Zusammensetzung nach Anspruch 31, gekennzeichnet dadurch, daß sie umfaßt:
ß-D-Galactosidase 25 E/l bis 7 500 E/l
NPG 0,25 mmol/! bis5 mmol/l
Kryptofix(R) 221 0 mmol/l bis 10 mmol/l
Puffer, pH 7-9,5 200 mmol/l bis 500 mmol/l
Mg2+ 0,01 mmol/l bis 10 mmol/l
EGTA (Lithiumsalz) 0mmol/l bis20mmoi/l
Serumalbumin Og/i bis 5 g/l
44. Zusammensetzung nach Anspruch 31, gekennzeichnet dadurch, daß sie umfaß';:
PK (Kaninchenmuskeln) 50 E/l bis 10000 E/l
PEP (neutralisiertesTris-Salz) 0,3 mmol/l bis 30 mmol/l
Kryptofix|R| 221 1 mmol/l bis10mmol/l
NADH 0,01 mmol/l bis0,8 mmol/l
Puffer, pH 9-10 2
ADP (säurefrei) LDH (bestimmt bei 25°C) KCI
Serumalbumin GDH (bestimmt bei 250C) KG (säurefrei)
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