JPH01503596A - 体液中のカリウムイオンを測定する方法及びそのための組成物 - Google Patents

体液中のカリウムイオンを測定する方法及びそのための組成物

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JPH01503596A JP63503316A JP50331688A JPH01503596A JP H01503596 A JPH01503596 A JP H01503596A JP 63503316 A JP63503316 A JP 63503316A JP 50331688 A JP50331688 A JP 50331688A JP H01503596 A JPH01503596 A JP H01503596A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 液体中のイオ／の測定 本発明は、生物学的及び非生物学的液体中のイオン（以後これを分析質とも称す る）ｔ−測定する方法及び試薬に関する。
不発明は、多くの分析５ｉ　（Ａｎａｌｙｚｅ　）が感受性酵素の活性を促進又 は阻害する籠力に基づく。この分ＩＴＪは、カチオン、アニオン、金り又は非金 属の元素又は化合物であってよい。失透に、この分析質は、関連分析インジケー タ＃累の感受性の範囲の外の改良で、又は、＃素が敏感である他のイオンの存在 で干渉（ｚｎｚｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　）　が惹起ちれるｌｌ！＝［で試料中に存 在することが屡々認められている。不発明は、これらの間１ｍを、糧々の方法で 対応しかつ解決する。
臨床生化学の央際に２いて、血清！解質の測定は、病院で実施されている飯も一 般的な分析試飄である。
これらの測定は、通常の研死のためのみならず屡々、分析の速度がム要である緊 急及び救急処置のためにも必要である。病院での遅蝙の主要原因は、病型から診 断病ｒＡ隻１での検体の移送であり、病床近くで容易に５Ａ施しうる方法に、菓 急時には鴨に脣幼である。
臨床生化学の央際におけるカリクム訃よひナトリクムを分有する一般的方伝は、 炎九元度法である。この方法は、特定の原子に熱エネルギーを与えると、これが 励起され、基底状態に戻る際に特徴的な元を発する原理に基づく。炎内での原子 により生せしめられる放射エネルギーの特性波長の強度は、炎内で励起される原 子の数に正比例し、これは、試料中の当該物質の濃度に正比例する。必要な装置 は複雑であり、かなり高価であシ、可燃性ガスの使用を必要とする。
殊に、ナトリクム、カリクム及び塩素に関する択一的方法は、イオン選択性電極 を使用させる。理想的には、各電極は、１種のイオンに対してのみ感応する特異 的なイオン選択性を有すべきである。実際には、このような場合はなく、すべて のイオン選択性電極に対して干渉イオンが存在する。史に、イオン特ＪＩ性電極 は、一般に補正は可能であるが、絶対的に特異的ではない。電極は、Ｖｆ殊イオ ンの存在時に生せしめられる電圧１！−鉤定する。この１ｉＩｌｉにかなり高価 である。従って、分元元度法で実りすることもできず、イ万ン測定用の臨床的景 求も、市場で入手しうる臨床アナライザー（その大抵は、分元九匿分仇のために 設計されている）の複雑さを実質的に場丁。双方の方法は、その実施の成巧のた めにかなりの程度の熟練と知ｋｔ−菅ぶするＯ 同様に、熱放測定法によるクロリドの慣用６ＩＩｊ定も、特殊な襞ｋｔ６ｂ安と する。この滴定法の終点は、不俗の塩化＊Ｒ庄既物の形成の完結に基づく電気随 動率の増大により探知される。電圧測定法も使用でき、これは非常に時間もかか り、付加的な装置を包含する。
更に、クロリドに関しては、多くの光を法及び滴定法があり、例えばそれには次 のものが包含されるニージフェニルカルバゾン錯体を経る遊＊Ｈｇ”＋イオンの 滴定 一水＠錯体の解離後にＨｇＣｌ２の沈殿により形成される鉄のローダニド錯体の 比色測定（８ｋｅｇｇｓ、　Ｃ１１ｎ。
Ｃｈｅｆｌｌ、　１０１１９６４　ｅ　９１８　ｆ　；　８ｃｈｍｉｄｚ。
ｚｅｎｚｒａｌｂｌａｃｚ　ｐｈａｒｍ　１２４　（９）　ｅ　１９８５　。
５２７ｆ） 一相応する水銀塩からのクロラニル酸の比色測定（Ｒｅｎ５ｃｈｌｅｒ　） 一無色水録塩からのジエチルジチオカルバミン酸の着色ＣｕＩ餉体の測定（西ド イツ特許出願公開第２１３７１４６号） 一同様に、水＊錯体の解離による着色金ｊＩ錯体の形成に基づく、より一般的な ＴＦＴＺ−法（トリビリジルー８−トリアジン；　Ｒ，Ｆｒ１ｅｄ、　Ｚｅｉｃ ｓｃｈｒ、　Ｌｌｉｎ。
Ｃｈｅｍ、　Ｋ１１ｎ、　Ｂｉｏｃｈ、１０　ｅ　１９７２　、２８０　ｆ　ｐ 西ドイツ特許出願−公開第２１５３３８７号）。
これら方法の王嶽欠点は、高い律性の物ｒＸを含有する浩液の使用である。これ ら方法のいくつかは、煩雑であシ、かつ不正−である（例えに滴定法）。多くの 試薬は不安定であり、較正Ｂ蛛は非直調性である（例えばローダニド法）。更に 、これらの方法のいくつかは、試料の蛋白質含分による干渉を除くために、前処 ００２６７０号明細書中に記載されているが、毒性水銀化合物の使用がなお欠点 である。水銀イオンを使用しない比色法のみが、過塩素ａｉｉ＃＆液中のＦｓ　 （１）のへキサクロロ錯体含測定する（　Ｆ、　）ｌｏｐｐｅ、　Ｔｈｅｒ、　 Ｇｇｗ。
１１０　（４）　ｅ　１９７１　ｅ　５５４　ｆ　；　Ｈ，ＭａｈｎｅｒｅＺｅ ｉｃｓｃｈｒ、　Ｋ１１ｎ、　Ｃｈｅｍ、　Ｋ１１ｎ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１ｉ 　（１１）。
１９７３　、４５１　ｆ　；　Ｗ、　Ｔ、　Ｌａｗ、　Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｅｍ、 　２６（１３）、１９８０．１８７４　ｆ　；ＵＳ−４２７８４４０）。
この方法のかなシの限定は、腐蝕性であシ、機械的ピペット系とは許容し得ない 強飯性試薬の使用である。
もう１つの欠点は、試料中のビリルビンによる干渉である。
カルシウムは、臨床研究室で通例測定されるもう１つのカである。体液中のこの 金属イオンの良友は、狭い範囲で調節６れる。病理学的に高い又は低い改度は腎 不全、膵炎、テタニー及びうつ血性心不全等の扶患の長期間外ａｔ疾？ｉをもた らすことができる。
カルシウム測定の最も初期の方法の１つは、ティスダル（Ｔｉｓｄａｌｌ　；　 Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、６３　、４６１〜４６５．１９２５）によシ文献に記 載されてンリ、ここでは、カルシウムを蓚酸（それ自体は比色法で計伸される） で沈殿させている。この方法は、遠心分離工程を包含し、従って、非常に時ｒｉ １１′１を喪し、カルシウムに対して特異的ではなく、試料の注意深い取扱いに 依存する。この方法は、滴定による及び直接の比色法により多くの研究室で成巧 している。前者は、複雑かつ煩雑な方法の欠点をも有し、多大の試料量を必賛と する。後者の方法では、カルシウムは色素例えば光夏計中で測定できるオルトク レゾールフタレイン・コンゾレ中ンンの色に急影伽を及ぼす。この方法の簡単性 に基づき、これ自体、臨床研究室での自動化をもたらす。
しかしながら、この方法は、攻撃的な高アルカリ性浴液及び毒性物質の使用を包 含している。これは、特に多くの血清成分力えは脂質、蛋白質、燐酸塩及びビリ ルビンによシ干渉される傾向があシ、結果として原子吸収及び灸比色法とに良好 に通合しない。この比色法のもう１つの欠点に、較正曲縁が非直触性であり、色 がかなり温度に依存することである。
Ｗ、Ｈ，アクトロク（Ｏｕｔｌａｗ　）及びＯ，Ｉ（、ローリイ（Ｌｏｗｒ’？ 　）によるアナリテイカル・ピオケミストリイ（Ａｎａｌｙｃｉｃａｌ　Ｂｉｏ ｃｈｅｍｌｓｃｒｙ　）　９２　ｒ　３７０〜６７４（１９７９）には、組織甲 のカリクムイオンを沖ｊ足するための＃素介在検定が記載され℃いる。この方法 では、カリクムイオン及びナトリウムイオンによ１５性化される（前＠に４０倍 以上も有効）クサギ筋肉からのピルベートキナーゼを使用する。この非譜異注に 基づき、この方法は、カリウムが主費カチオンである植物物質には好適であるが 、３０倍過剰のナトリウムイオンを含有する血清のような体液中での測定には不 適当である。従って、ナトリウムイオンは、ローリイ（Ｌｏｗｒｙ　）等による ＃素的比色法を血漿又は血清中のカリウムを測定するために使用する際には、認 容できない干渉を起こさせる。もう１つの間組は、アンモニウムイオンがカリク ムイオンに類似の活性化を与えることである。前記文献は、生物学的液体例えは 血清中のカリクムイオンの分析に関連するこれらの臨床的問題を処理又は解決を せす、ナトリウムイオンの測定のための何の方法も提供しない。
従って、本発明のａ超は、前記の間趙をさける方法及び試薬を提供することであ る。不発明は、酵素の活性へのイオンの影Ｖ’ｔ　測定する方法による液体中の イオン（分子Ｔ實）の画定法によりこの間組を解決している。
この発明の主要態様は、袴に液体の稀釈が実施不能な場合に分析質の自由誂灰を 分子′ｒ＃累にとって至適の範囲にする選択的結合剤を使用することである。本 発明の付加的貴素は、分析ｔ＃紫の分析質に河する感度を低めて、高一度での分 析質の測定を許容するようにするために、当該分析酵素の双争釣阻害剤を使用す ることである。これは、選択的結合剤が容易に′８＃３できないか又は認容でき ない桂皮に１１ａ価である場合に殊に有用である。
不発明のもう１つの態様は、干渉イオンの自由濃度を、もはや干渉が問題でない 程度まで低下させるために、選択的結合剤を使用することである。競争的阻害剤 は、分析質とよりも干渉イオンとより有効に競争し、この際、干渉イオンに関連 して分析質への＃素の感度を増大する事実も使用される。
重要な要素は、過当な補＃素の選択を包含する至適条件を、分析質の促進性又は 阻害性作用が実質的に干渉イオンのそれより実質的に犬ぎいように畠ぶことであ る。更に、分析＃紫の活性への分析質及び干渉イオンの作用が付加的であり、従 って干渉イオンの成度が公知の場合には、分析質のｆ！Ｉｋ尻が差によって容易 に測定できる。干渉イオンが分析液体中に相対的に一定の娩度で生じる場合には 、標準（較正）液中の干渉イオンの適当な良度を包含することによシ、これは酌 量できる。このような分析賞金検定するための他の方法は、分析質が結合剤から の他のイオンを置換し過当な＃累の活性への放出イオンの作用が測定される所で の競争的結合剤の使用である。
これらの一般釣原理は、血漿又は血清中のカリウム、ナトリクム、カルシウム、 クロリド及びｌ戻酸イオンのＭｉｉ足への適用を示すことにより歳も良好に説明 することができる。しかしながら、これらは広いｍ６＋のイオン例えはカチオン 例えはマグネシワム、マンガン、リチウム、鉛、亜鉛、銅、鉄又は他の１金属に 適用可能である。測定可能な非金属イオン０ｆｌＪは、プロトン又はアンモニウ ムである。アンモニウムを生じさせる尿素等の物質も測定されうる。
好適な＃累 使用できる酵素は、例えば次のものであってよい（Ｈ，Ｊ＋Ｅｖａｎｓ　ｅｚ　 ａｌ、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｐｌａｎｃ　Ｐｈｙｓｌｏｌ。
１７．４７．１９６６）ニ トランスフェラーゼ、例えば燐含有基移送性トランスフェラーゼ。このようなト ランスフェラーゼは、ピルベートキナーゼであってよい。ピルベートキナーゼの 代りに、他のキナーゼ例えばマグネシクムイオ／又はマンガンイオンに対して敏 感であるアデニレートキナーゼ又はヘキソギナーゼを使用することができる。
他のトランスフェラーゼはアセテートキナーゼである（　Ｅ、コリーからの）。
他の例は、亜鉛イオンに対して敏感な脳からのピリドキサールキナーゼである。
又はβ−Ｄ−がラクトシダーゼ（Ｅ、コリーから）、カルボ中ジペプチダーゼＡ （牛膵臓から）、コラゲナーゼ（クロストリジクム・ヒストリクムから）、アミ ラーゼ＜ｍ液又はｓｇから）又はホスホグリコレートホスファターゼ。
ペプチドヒドロラーゼ、例えはシスティン又はチオール依存性ゾロテイナーゼ〔 その詳細な例は、カルパイン（Ｃａ１ｐａｉｎ　）　１及びｌ（即ち、カルシク ム活性化中性プロテアーゼと称される）である〕は、ササギ（５ａａａｋｉ　） 等による。Ｔ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｉｎ、　２５９　。
１２４８９〜１２４９４（１９８４）に記載されている。後者の酵素は、種々の 動物脂ｉｋカえはラッテの肝臓及び腎臓、ヒト及び豚の赤血球、牛の脳及びクサ ザの骨格筋から、人、キタハラ（Ｋｉｚａｈａｒａ　）等によるＪ、　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、　９５　ｓ　１７５９〜１７６６（１９８４）に記載の方法によシ単離 かつａｍすることができる。
他の例は、ジペグチジルアミノペゾチダーゼｌである（　Ｌ　Ｃ，３，４，１４ ，１、カテプシンＣ；　Ｊ、Ｋｅｎ　ＭｅＤｏｎａｌｄ、　Ｂｉｏｃｈ、　Ｂｉ ｏｐｈｙｓ、　Ｒａｇ、　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ　２４（５）　、　６６ 　、７７１　ｆ　）。この＃累の他の起源は、遺伝子組換え技術によシ得られる 。
ドロデナーゼ（エンテロバクタ−・アエロデネスから）アセタールデヒドロゲナ ーゼ（酵母から）又はテーシナーゼ（カテコール・オキシダーゼ）。
ルボ二ツク・アンヒドラーゼ（生き血球から）。
他の好遍な酵素は、好塩性組織からの槙々の酵素である。他の酵素源は、遺伝子 １ｉｌｌｉ換え技術で得られる。
渉イオンの結合のために利用できる。このような結合物質又はマスキング物５１ ［は久のものである：クリプタンド（Ｃｒｙｐｚａｎｄａ　）、＝ｒｏナンド（ Ｃｏｒｏｎａｎｌｇ　）、クラクンエーテｘ　（Ｃｒｏｗｎ　ｅｚｈｅｒ８）　 、ボダンド（Ｐｏｄａｎｄｓ　）、スフェランド（５ｐｈｅｒａｎｄｓ　）、ヘ ミスフェランド（ｈｅｍｉｇｐｈｅｒａｎａｓ　）　％カリー？　ｆ　Ｌ／　ン （ｃａｌｘｒａｒｅｎｓ　）　及びこれらの組合せ、天然産のイオノフオレ（１ ｏｎｏｐｈｏｒｅａ　）　例えば抗生物質、環状ペプチド例えばパリノマイシン （ｖａｌｉｎｏｍｙｃｉｎ　）　、コンブレクソン（Ｃｏｍｐｌｅｘｏｎｅｇ　 ）及びキレート化剤例えばイミノジ酢酸、ＥＤＴＡ、　＝　）口三ｒｎ酸及びこ れらの誘導体。このような化合物は、矢の文献に記載されている：Ｋｏｎｚａｋ ｚｅ　（Ｍｅｒｃｋ　）　１９７７５ｆｆｉ１　、１１頁以降及び２９頁以降； 　Ｋｏｎｚａｋｔｓ　（Ｍｅｒｃｋ　）　１９７７　ｓ　Ｎｎ２゜１６頁以降； 　Ｋｏｎｃａｋｚｅ　（Ｍｅｒｃｋ　）、１９７７、ｒｋ３゜３６頁以呻；　Ｐ ｈａｓｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｃａｃａｌｙｇｚｓ、　Ｐｒｏｐｅｒｃｉｅｓ＋ ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　（Ｖｅｒｃｋ−８ｃｈｕｃｈａｒｄｚ　） 　１９８７　ｅＴｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ　ａｎｄ　Ｋｉｎｅｃｌｃ　Ｄａｃ ａ　ｆｏｒ　Ｃａｚｉｏｎ−Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　 ；　Ｒ，Ｍ、　Ｉｚａｚｚ　ｅｘ　ａｌ。
Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒａｖｉｅｗａ　８５　＝　２７１〜３９９　（１９８５） ；　Ｄａｚａ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈｓ　１９８ ６　ｍＲ，ｌａ、　Ｃ，Ｄａｗａｏｎ　ｅｚ　ａｌ、　ｈ　３１版、３９９〜４ １５頁（Ｃ１ａｒｅｎｄｏｎ　Ｐｒｅｓｓ　）　０ｘｆｏｒｄ；　Ｆ、　Ｖ２； ｇｚｌｅ等によるＣｈｅｗ、　Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅａ＋　８ｐｒｉｎｇｅｒ　 Ｖｅｒｌａｇ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。
１９８５　ｍ　（）−Ｗ、Ｇｏｋｅｌ　’ｆｌｙによるＥｄａ、、　Ｍａｃｒｏ ｃｙｃｌｉｃＰｏｌｙｅｃｈｅｒ　５ｙｎｃｈｅｓｉｓ　Ｉ　Ｓｐｒｘｎｇｅｒ 　Ｖｅｒｌａｇ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋｌ　’９８２　ｐ　Ｊ、　Ｍ、　Ｌｅｈｎ 　％によるＪ、　ＡＪ！１．　Ｃｈｇｍ、　８ｏｃ。
９７．６７００〜６７０７（１９７５）；Ｇ、　Ｓｃｈｗａｒｒ、ｅｎｂａｃｈ 等によるＨｅ１ｖ、　Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ、　２８１８２８　（１９４５）　 ；　８．　Ｆ、　Ａ、　Ｋｓｚｚｌｅ。
ＫＯ０ｒｄｌＪｌｌａＳｉＯｎ＃ＶｅＰｋ）ｉｎｄｕｎｇ１９ｎ＊　Ｔａ５ｃｈ ｅｎｚｓｘｚ　３　ｚＶｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｉｅ、Ｗｅｉｎｈａｉｍ　／　Ｂ ｅｒｇｓｔｒ、１　９７２　ｍ　Ａ。
Ｅ、　Ｍａｒｔｅｌｌ等によるＤｉｅ　Ｃｈｅｍｉｅ　ｄｓｒ　Ｍｅｃａｌｌｃ ｈｅｌａｚ−Ｖｅｒｋ）Ｌｎｄｕｎｇｌ！ｎｓ　Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｉｅ、 Ｗｅｉｎｈｅｉｍ　／Ｂｅｒｇａｚｒ。
１９５８　；　Ｍ、　Ｂｅｃｋｅ−Ｇｏｅｈｒｉｎｇ等によるＫｏｍｐｌｅｘｃ ｈｅｍ　ｌｅ　＋Ｓｐｒ１ｎｇａｒ　Ｖｅｒｌａｇ＊　１　９７０　；　Ｆ、　 Ｋｏｂｅｒ、　Ｇｒｕｚ＋ｄｌａｇｅｎｄｅｒ　Ｋｏｍｐｌｅｘｃｈｅｍｉｅ、 ０ｃｚｏ　５ａｉｌｓ　Ｖｅｒｌａｇ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ／Ｍａｉｎ　１　９ ７９　；　Ｇ、Ｓｃｈｗａｒｚｅｎｂａｃｈ　ｅｚ　ａｌ、Ｈｏ１ｙ。
ｃｈｉａｔ、Ａｃｔａ　３１　、　１　０２９（１９４８）　ｓ　Ｒ，Ｇ。
ｐｅａｒａｏｎ等による５ｃｉｅｎｃｅ　１５１　、１７２　（１９６６）。
多価イオン殊に２価カチオンｔ−結合することのできる中レート化剤の例は、エ チレングリコール−ビス−（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’ −テトラ酢酸（ＥＧＴＡ　）及び（エチレンジニトリロ）テトラ酢ｉ！！！（Ｅ ＤＴＡ　）である。
多働イオンと結合することのできる多くの試薬、例えばＥＤＴＡ及びその誘導体 が存在するが、１伽イオンと結合するに桑は、あまり一般的でない。テトラフェ ニルポロンはカリワムイオンと結合する。しかしながら、広い可能性ｔ−有する 化合物ＩＲ−は、水酷淑中の１伽のカチオンと選択的に結合することのできる試 薬Ｏ例であるクリプタンドである（　Ｒ，Ｍ、　Ｉｚａｃｚ等によるＣｈｅｍ、 　Ｒｅｖｉｅｗａ　８５　＊　２７１〜３３９　）　ｏクリプタンドの詳細な例 は、メルク・シューハル）　（Ｍｅｒｃｋ−８ｃｈｕｃｈａｒｄｚ　）のクリシ トフィックス（１Ｋｒｙｐｚｏｆｉｘ’！’）化合物、例えばａ、７．１３，１ ６．２１−ペンタオ中す−１．１０−シアずビシクロ（８，８，１５３−トリコ サン（Ｋｒｙｐｃｏｆｉｘ［Ｆ］２２コ、Ｍｅｒｃｋ−８ｃｈｕｃｈａｒｄｚカ タログ（１９８９／８Ｂ　）４３８頁、隘８１０６４６（Ｋ２２１　））、４， ７．１３，１６．２１．２４−へ中サオキサー１，１０−シアずビシクロ［８， ８，５）−へキサコサン［Ｋｒｙｐｃｏｆｉｘ”２２２、Ｍｅｒｃｋ−８ｃｈｕ ｃｈａｒ＋ｉｃカタログ（１９８７／８８）ａ３８頁、隘８１０６４７（Ｋ２２ ２））である。
干渉アニオンを除去するためのマスキング剤として次の群の化合物も使用するこ とができる：アニオンクリプタンド（ａｎｉｏｎｃｒ７ｐＺａｎａａ　）、ヘテ ロサイクロファン（ｈｅ＋ｃｅｒｏｃｙｃｌｏｐｈａｎｅｓ）　、カタビナンド （ｃａＺａｐｉｎａｎｄａ　）及び無伽金Ｓ飴体又は不浴性塩。アニオン錯形成 性化合物の詳細な例は、文献中に記載されて＞ＤＳ　Ｍえはアザモノ−（ａｚａ １！１ｏｎｏ　−）　又はアずポリサイクル類（ａｚａｐｏｌｙｃｙｃｌｅｓ　 ）　、マクロサイクル性４４＆テトラヘドロン化合物、マクロサイクル性ビス− 金鵬−錯体、共有５会したルイス酸甲心を有するマクロサイクル類（ｍａｃｒｏ ｃｙｃｌｅｓ　）、プロトン化又はアル中ル化された４Ｉｌｊクリブタンメンド 知又はカタビナンド＊　（Ｆ、　Ｐ、　Ｓｃｈｍｉｄｚｃｈｅｎ　＃　Ｎａｃｈ ｒｉｃｈｃｅｎ　Ｃｈｅｍ。
Ｔｅｃｈ、　ｌａｂ、３６　（１）　、１　９８　Ｂ　、８．８　ｆ　ｐ　Ｅ− Ｇｒａｆ、Ｊ、／ｕｎｅｒ、Ｃｈｅｍ、Ｓａｃ、９８　（２０）、１　９７６　 。
６４０３　ｆ　；　Ｃ，Ｈ−Ｐａｒｋ　Ｊ、　Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ、Ｓａｃ、　 ９０（９）、１９６８．２４３１ｆ）並ひに例えばＦｅ　（１）のへキサクロロ 錯体又Ｆｉ硝酸銀である。
結合剤の＆能：これら結合剤は次の目的のために使用される： １　干渉イオンの選択的結合 ２、試料の稀釈が不可能な場合、分析質の良度をｉｌｋ過測定レベルまで低下さ せる。
３、本発明の態様は、結合剤が存在し、インジケータイオｙ　（１ｎｄｉｃａｚ ｏｒ　１ｏｎｓ　）　と錯体を形成しくこの錯体からインジケータイオンは化学 ｉｔ＃＠的に分析質イオンで洪見られる）、酵素活性へのこの換えられたインジ ケータイオンの影ｗを検定し、この際、分ｖ′ｒ貴イオンの濃度の直接測定法が 得られる。例えば、このような方法において、酵素はピルベートキナーゼであり 、インジケータイオンはカリウムであり、結合剤はクリノトフイクス（ｋｒｙｐ ｃｏｆｉｘ■）２２１であり、被（ｔｒｊ定イオンはナトリウムであるか又は＃ 素はキナーゼでありインジケータイオンにＭｇ２＋であり、結合剤にキレート化 沖Ｊ例えばＥＤＴＡであり、イオンは戴属であるρ）又は酵素にビリドギサルキ ナーゼであり、インジケータイオンにＺｎ２＋であり、結合剤にクリゾトフイク ス■２２１であり、イオンは１金属であるか又ｒｉｔ＃木にα−アミラーゼであ り、結合剤はＡｇ又はＨｇであシ、被測定イオンはクロリドであるか又は＃ＸＦ ｉコラデナーゼ、結合剤はキレート化剤例えばＥＤＴＡであり被測定イオンはカ ルシクムである。
分析用液体：分析質の測定が行なわれる生物学的液体の例は、血液、血清、血漿 、汗、滲出液又は浸出液又は尿である。他の液体の例に水道水又は食料品又は果 物の抽出物又は醗醇液例えはワインである。
カリウム及びナトリウムイオンの測定のための一般的原理の過用 カリ９ムイオンに対するピルベートキナーゼの敏感性に基づく血清又は血漿中の カリウムイオンの満足しうる測定を得るためのに喪要件は、ナトリウム及びアン モニウムイオンによる干渉の克服である。本発明に包含される一般的ｙＡ理によ れば、これに次の１以上の方法で達成される： ｔ　ナトリウムイオンと過当な結合斧ｊカえはクリプトフィックス■２２１との 選択的結合 λ　ピルベートキナーゼ原としての９サギ筋肉よりもバシルス・ステア０テルモ フイルス（Ｂａｃｌｌｌｕｇｓｚｅａｒｏｃｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕａ　）　ｋｈ 択する。それというのも、この細ａ！Ｉ酵素に、ナトリウムイオンとの関連でカ リウムイオンに対する敏感度がｙＩｈ肉鯵素よりも２倍大きいからである。
五　検定に２ける敏感なインジケータ靜素の脂争的阻害剤であるイオンの包含、 例えばリチウムイオンをナトリウムイオン及びカリウムイオンと競争するために 使用する。
４、　アンモニウムイオンの酵素的除去。
リチウムイオンは、カリウムイオンに対する競争体（ｃｏｍｐｅｚｉｃｏｒ　） 　として有効性が低いので、真の効果は、カリウムイオンに対するピルベートキ ナーゼの相対的敏感度がす）　ＩＪウムに比べて更に５０％増大することである 。良に、リチウムイオンの存在で、ピルベートキナーゼの作用へのカリウム及び ナトリウムイオンの作用効果は、共同性というよりも相加的になる。
他のイオンの良度が公知であることを前提として、カリウム又はナトリウムイオ ンの凌度測定が可能となる。
結合剤の不存在下での方法２及び３の使用により、ピルベートキナーゼのカリウ ムイオン対ナトリウムイオンの相対的敏感度１００：１を得ることができる。
このことは、極め”（＊常な１１０又は１７０ｍモル／１４０ｍモル／ｊ（ＨＡ ）に比べて０．６ｍモル／ｊ’に越えないことを意味する。これは、多くの臨床 目的のために光分な正確性であるとは見なされない。しかしながら、血漿中のナ トリワムイオ／の臭の良度が公知であるなら、±０．０５　ｍモル／ｌ”１での 正錐なカリウムイオンの測定は実りできる（例Ｂ）。万＠１〜３’（ｉ−一緒に し、結合剤例えはクリプトフィックス■２２１を包含する場合は、ナトリウムイ オンに対するカリウムイオンへのピルベートキナーゼの相対的敏感度は＞５００ 　：　１まで高めることができる。このような状況下では、０．０５　ｍモル／ ｌまでの血漿カリクムイオンｆ：測定するために、ナトリウムイオン濃度を知る 必要けない（例Ｃ）。
カリウムイオン測定のためのこれら方法は、干渉の低減を考慮して本発明に包含 される一般的原理の適用性を示している。他方、血清又は血漿中のナトリウムイ オンの測定は、有効な分析質濃度の調整へのこの原理の適用を最良に説明してい る。本発明に包含されるようなナトリウムイオン測定の１乎段は、ナトリウムイ オンに対して敏感である活性を有する＃素を使用することである。このような酵 素の例に、β−がラクトシダーゼである（　ｋｕｂ７等によるＪ、　Ａｍ、　Ｃ ｈｅｍ、　Ｓｏｃ。
７５．８９０．１９５３）。しＣ’　Ｌながら、この＃素が最も敏感であるナト リウムイオン＆［の範囲は、通例血漿試料中で、稀釈工程なしに得られるよりも 低い。
試料の稀釈が不可能な場合に、本発明に包含ちれる原理を保持して、次の方法を 有効なナトリワムイオ／襄度全最適レベルｌで低めるために使用する。
ｔ　ナトリウムイオン超合剤例えばクリットフィックス［Ｆ］２２１０使用 ２　β−がラクトシダーゼの耽争的阻害剤としてＯすチウムイオンの使用（この 際、ナトリワムイオンに対するこの酵素の敏感度は低下）。
方法１及び２の組み合せは、容易にｌ−がラクトシダーゼを用いる血漿又は血清 中のナトリクムイオンの測定を許容し、結合剤ｏ１は、１１０ｍモル／ｊを下ま わるナトリクムイオン＆夏に関する信号を最低にするために使用することができ 、他方通常の分析範囲（１１０〜１７０ｍモル／ｊ）の信号を高める（例Ｄ）。
カリウムイオンによる絆集活性の刺激が低下され、カリウムイオン結合剤例えば クリプトフイクス０２２２が反応混合物中に包含されるような条件を遡択するこ とを前提として、ピルベートキナーゼを用いてナトリクムイオンを測定すること もでさる（例Ｅ）。
血漿ナトリワムイオン負度を測定するもう１つの方法では、ナトリクムイオンを クリプトフイクス■２２１からのカリウムイオンに換えることができ、放出され るカリウムは、血漿ナトリクムイオン凍度に比例してピルベートキナーゼの活性 を刺激する（ｆｌＦ）。
本発明の他の態様は、生物学的及び非生物学的液体中のイオン測定用の組成物及 び賦薬である。
不発明による試薬は、ｂ解された形又は乾燥形で存在しうる。これは、過当な担 付材上に含浸されて存在してもよい。試験片の形の診断畑は、也待彷有利に１紙 、セルロース又は合Ｈ，蝋脆フリースに、易弾発性解剤力えはアセトン中の試験 片のｍ造に有利に使用するのに必要な溶液で含浸することにより製造することが できる。これは、１以上の含浸工程で行なうことができる。仕上げられｆｃ試験 紙は、そのもの自体として又は公知方法で把手に押込んで又は合成樹脂と微細メ ツシュとの間でシールして使用することができる。
次に、本発明の実施態様を詳細に記載するが、本発明は、記載の詳細の１つ又は 組合せに限定されるものではなく、特にこれら態様に記載のはかにも機械的又は 化学的変更法を使用することができる。
カリウムイオンの分析法の詳細な記載 ここでは、本発明に記載の原理を包含するカリウムイオン測定＠をよυ詳細ＩＣ 記載する。カリウムイオンの測定のために、液体例えは血ｉをアデノシンニ燐酸 （ＡＤＰ）、ホスホエノールビルベー）（ＰＥＰ）、適元ニコチ７アミドアデニ ンジヌクレオチド（ＮＡＤＥ）、ピルベートキナーゼ（ＰＫ　）及びラクテート デヒドロゲナーゼ（Ｉ、ＤＨ）を含有する後置されｆｃ混合物と共に恒温保持す る。反応時にこの混合物中のＰＫ及びＬＤＨにより触媒作用をうけるピルビベー ト及び８Ｉ続くラクテートの形成は、まったく、過当なカチオンの存在に依存し 、その不在時には、ＰＫはまったく不活性である。
ＮＡＤＨは、３４Ｑｎｍで強く吸収し、ＮＡＤは吸収しない。
細−ＰＫにより飲水されるマンガンイオンの存在を包含する分析のために遇にれ た条件下で、ＮＡＤＨ＆化の速度は、カリウムイオンの凝友に比例する（例Ａ〜 Ｃ参照）。
このような条件下では次の反応が起る：（１１ｐｇｐ　＋　ＡＤＰ　＋　Ｈ＋４ ビルベー）　＋　ＡＴＰ（２）　ピルベート十ＮＡＤＴ３＋Ｈ＋１以しラクテー ト十ＮＡＤ”反応（１１の速度は、系中Ｏカリウムイオン濃度により測定され、 これは反応（２）の速度も制限する。これらの反応の速度を測定することのでき る方法はいくつもある。標準的な方法は、反応（２）に２けるＮＡＤＢＩの消失 速度の分光光度測定である。ＮＡＤＨは５４０　ｎｍで強く吸収し、ＮＡＤは吸 収しない。従って、３４０ｎｍ（又は代りの波長）での反応混合物の吸収の低％ は、反応の速度の直接測定を提供し、これから混合物中に存在するカリウムイオ ンの濃度を引き出すことができる。双方の反応（１）及び（２）はＨ＋ヲ消費し 、従って、反応混合物のプロトン濃度を低下する事英も採用できる。ゾロトノ皺 度の低下速度はめメーターを用いて又は、滴定法を用いて測定することができる 。後者の場合に、使用後ｌ１ｉｌ液の磯匿は、分光光度法におけるよりも低い。
他の装ｒ１１例えば螢光光度計又は発光光度計も、ピルベートキナーゼの活性を 検査するために使用することができる。
ＰＫ＠性と関連しているピルベートの蓄積を鋤足する他の多くの方法が存在する 。これには、無−燐阪塩又は徊費δれた成木又は過酸化水素；ｇ４酸ア七チル又 はピルベートオ中シダーゼのｆ＃木作用によシ発生する二酸化炭素を測定する方 法、２．４−ジニトロ７エ二ルヒドラジンでのヒドラゾの形成：ビルベートカル ボキシラーゼ、ビルベートカルボキシラーゼ又はピルベートデヒドロデナーゼの 酵素作用の反応成分又は生成物の測定、フラビン結合系の使用及び基質の微小な 濃度を測定するためのアイソトープ的方法ｒ　Ｍ、　Ｎ。
Ｂｅｒｒｙ等によるＡｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１１Ｆ３　、３ ４４〜３５２（１９８１））が包含される。
他の方法例えは炎光光度測定又はイオン選択性電極１ｊ定法を用いても、血ｆ＃ 試料２００の検量で良好な一致が得られた。この方法での１大な干渉は、血清中 に一般に存在するか又は放置時に蓄積するアンモニウムイオンである。アンモニ ウムイオン干渉の可能性は、反応混合物中のα−ケトゲルタレ−）（ＫＧ）及び グルタメートデヒドロブナ−−１？（ＧＤＨ）の包含により先金にさけることが できる。アンモニウムイオンに、前イン中ユベーション（ｐｒｅｉｎｃｕｂａｚ ｉｏｎ　）で、次の反応式によシ除かれる： ＮＨ，”−１４０＋ＮＡＤＨ→グルタメート十Ｎ　ＡＤ　”渉液中、例えはアン モニウムイオン含分が高い尿中では、連結された反応を使用することができる： ＮＥｉ４　”　＋　ＫＧ　＋　ＮＡＤＰ→グルタメー）　＋ＮＡＤＰグルコース ー６−Ｐ＋ＮＡＤＰ−４ｐ６−ホスホグルコネート十ＮＡＤＰ）！この連結され た方法に、グルコース−６−ホスフニートデヒドロデナーゼを使用する。添加さ れたグルコ−スー６−Ｐ及び−ＫＧを、任意のアンモニウムイオンの過剰の中に 存在させると、すべてのアンモニウムイオンＦｉ除かれ、他方試薬中ｉｃ　ＮＡ ＤＥを保持する。
血漿又は血清試料１０μ杉を用いて、３７℃でカリウムイオンを＃集的に測定す る主試薬の典型的濃度範囲は、仄のとかりである： ＰＫ（Ｂ、ステアロテルモフィルス）　５０ｕＷ〜１００００　Ｕ／／ｐＥｐ　 （中和されたトリス塩）　０．３ｍモル／ｊ　〜３０　ｍモル／ｌクリプトフイ クスｏ２２１　０　ｍモル、７１〜３０　ｍモに／ＩＮＡＤＥ　Ｏ，０１Ｉｌｌ モ／Ｉ／／ｌ　〜Ｑ　、８　ｒｎモに／１緩賛剤−７〜８　５０　ｍ七ル／ｌ　 〜５００ｍ七ｋｉｔＭｎ２＋又はＭｇ”　ｉ　ｍモに／ｌ　〜１Ｑ　ｆＱ％Ｍ７ ！！、１（ＩＪ　２　ｍモル／ｊ　〜Ｉ　ＤＯｍモに／　ＩＡＪ）Ｐ　（遊ｋＦ １０　Ｑ、５ｍモル／ｌ　〜ｊＱ　ｍモｋｉｔＬＤＨ（２５℃で検定）　５００ ０　ｖ／ｌ〜１０００００　ｖ／を血清アルブミン　Ｑ　１７／ｌ〜５１／ＡＧ ＤＨ（２５℃で検定）　２５００９ｕ／ｊ　〜２００００　ＵｙｔＫＧ　（遊ｍ 酸”）　１ｍモＪＶ！４〜１Ｑ　ｍモｈ４カリクムイオンに対して！感な他の偽 は、グリセロールデヒドロデナーゼ（Ｅ、Ｃ，Ｃ，Ｌｉｎ等によるＢ。
２６５．１８２０．１９６０）である。グリセロールデヒドロゲナーゼを用いる ３７℃でのカリウムイオンの１＃紫的艶定のための主試薬の典金的磯匿範すに仄 のとおりである： グリセロールデヒドログナーゼ　５０　ＴＪ／ｌ〜１０００　ｖ／ｌグリセロー ル　０．３モル／！〜３モル／ｊクリデトフイクスｏ２２１　０　ｒｎモル／ｌ 　−３Ｑ　Ｉｎモｈ／ＩＮＡＤ　０．１　ｍモル／ｊ　〜５．０　ｍモル／ｊ緩 １し削、ｐ）１９　２０　ｒｎモルｙｌ　〜５００　ｍモル／ｊ血清アルブミン 　Ｑ　ｆｉｌｌ〜５９７ｔＧＤＨ（２５℃で検定）　２５００　ｖｙｔ〜２００ ００　ＵｙｔＫＧ　（遊離酸）　１　ｍモｙｂ７１〜１０　ｍモｔｂ／１カリワ ムイオンに対して敏感な他Ｏ酵巣にアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼである（ 　Ｓ、Ｂｌａｃｋ、　Ａｒｃｈ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　３４　ｅ　８６　＊　１９５１　）　ｏ アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼを用いて３７℃でカリ２ムイオン１に酵素的 ＶＣ測定するための主試薬の典型的な濃度範囲は次のとおりである： アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ ５Ｑ　Ｕ／Ｊ〜１００００　ｕｙｔ クリコールアルデ七ド　０．３　ｍモル／ｌ〜３０　ｍモル／！クリノトフィク ス［Ｆ］２２１　０　ｍモル／１．〜３０　ｍモル／１ＮＡＤ　０．０５ｍモル ／ｌ　〜２．Ｑｍモル／ｊ稜ｔＩｉｌｉ剤、ｐ）１７〜８　５０℃モに／ｌ　〜 ５００　ｆｆｉモル／ｌゾチオスレイトール　ｏ、ｉ　ｍモル／ｊ　〜２ｍモル フを血清アルブミン　ＯＶネル５　ｊｌ／１ＧＤＨ（２５℃で検定）　２５００ 　Ｕ／ｌ〜２００００　Ｕ／ＪＫＧ　（遊’１ｍ）　１ｍモルフ１〜１０　ｒｎ モル／ｌアセトアルデヒＹ　（０，０２ｍモル／ｌ〜１ｍモル／ｌ）ｋグリコー ルアルデヒドに快えることもできる。
アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、エステラーゼ活性をも示し、従ってカリ クムイオンｆＩｋ度は、酢酸４−ニトロフェニルからの４−二トロフェノールの 放出をモニターすることにより測定できる。アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ のエステラーゼ活性に基づく６７℃でのカリウムイオンの酵素的測定のための主 試薬の典型的濃度範囲は次のとおりである：アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ ５Ｑ　Ｕ／ｌ〜１００００　Ｕ／１ ４−ニトロフェニルアセテ−）　０．１　ｒｎモル／ｌ〜２ｍモル／ｊクリゾト フイクスｏ２２１　Ｄ　ｍモル／ｌ　〜３Ｑ　！ｌ１ｌｆ：ｈ／ＩＮＡＤＨ０， ００１ｍ七ルｉｔ〜０．１ｍモｙｂ／１ｆｆ＆剤、ｐ）１７〜８　５０ｍ七ｈａ １〜５ＱＱ　ｍモル／１（）Ｄ！（（２５℃で検定）　２５００　Ｕ／ｌ〜２０ ０００　Ｕ／ｊＫＧ　（遊離ｅ＆）　１　ｆｆ１モル／ｌ　〜１０　ｍモル／ｊ ナトリクムイオンの測定 原理的に、ＰＫを用いるナトリウムイオンの測定に、カリウムイオンのそれと同 じであるが、特定のＸｉな差異が存在する。第１に、　ＰＫに、前記のようなイ ンキュベーション条汗に応じて、ナトリウムイオンに対するよりもカリウムイオ ンに均して４０〜１００倍もｒｅ、感である。ナトリウムイオンは、血漿中でカ リウムイオンの濃度の約６０倍の良度で主じるが、後８社、ナトリウムイオン測 定と干渉することができる。
本発明で採用されている一般的な原理によれば、リチクムイオンは無視され、ウ サイ筋肉からのＰＫが細菌酵素よりも優れておシ、マグネシクムイオンは、マン が７の代りになりうる。１方法では、カリウムイオンを殊にクリグトフイクスｏ ２２２と結合させＰＫ活活性へのナトリウムイオンの効果を直接測定する　（例 Ｅ）。
ピルベートキナーゼ、を用いる３７℃でのナトリウムイオンの酵素的測定のため の主試薬の典型的な一度範囲は次のとおりである： ＰＫ　（ワサイ筋肉）　５０　Ｕ／ｌ〜１００００　Ｕ／ＩＰＥＰ　（中和され 六トリス塩）０．３ｍモル／ｌ　−３０ｍモル／ｌクリプトフィラス”２２２　 ０．４　ｍモル／ｌ−４ｍモル／１ＮＡＤＨ０，０１ｍ七ル／ｌ〜０．８！Ｏモ ル／を緩衝ｊ＋ｉｊｓ　ｐ）１７〜９　５０　ｍモｘ／ｌ　〜５００　ｍモル７ １Ｍｇ”　１　ｍモル／ｌ−ｉＱｍモル／ＩＡＤＰ　（遊離酸）　０．５ｍモル ／ｌ　〜１Ｑｍ１Ｑ／１ＬＤＨ（２５℃で検定）　５０００　ｕ／ｌ〜１０００ ００　ｕ／を血清アルブミン　Ｑ　／ｌｉｔ〜５　ｊｌ／１（）ＤＢ（２５℃で 検定）　２５００　ｕ／ｌ〜２００００　ｖ／ｌＫＧ　（遊隘ＩＦり　１ｍｍモ ル／１〜ＩＱ　Ｉｎモル／ｊもう１つの方法では、ナトリウムイオンはクリグト フイクス［Ｆ］２２１からのカリウムイオンで侠見られ、放出力リクムイオンは 、ＰＫ＋２）活性を、ナトリウムイオン画度に依存する程度に刺波する（例Ｆ） 。
クリプト２イクスｏ２２１からのカリクムイオンの交換を測定するための、ピル ベート中ナーゼを用いる３７℃でのナトリウムイオンの酵素的測定のための主試 薬の典型的な濃度範囲は次のとおシである：ＰＫ　（９？’Ｑ５肉）　５０　Ｔ Ｊ／ｌ　〜１００００　Ｕ／ｊＰＥＰ　（中和されたトリス塩）０．３ｍモル／ ｊ　〜３０　ｍ七ル／ｊクリゾトフイクス＠２２１　ｉｎ七ル／ｊ〜１０ｍモル ／ｊＮＡＤ）Ｉ　Ｏ，０１ｍ七ル／ｊ〜０．８ｍモル／！緩衝剤、Ｐ）ｉ９〜１ ０　ｓｏｎモル／ｌ　〜５００　ｒｎモル／！Ｍｇ”　１　ｍモル／ｌ　〜１０ 　ｒｎモル／ＩＡＤＰ　（遊離酸）　０．５　ｍモル／ｌ　〜ｉＱ　ａａモル／ ｊＬＤＨ（２５℃で測定）５００ｏＵ／ｊ〜１０ｏＯｏｏＵ／ｊＫ（Ｊ　２　ｍ モｈ／ｌ　〜１０　ｒｎモル／１血清アルブミン　０９７）〜５Ｉ／！ ＧＤＨ（２Ｓ℃テ検定）２５００Ｕ／ｊ〜２ｏｏｏｏＵ／ｊＫＧ　（遊離酸）　 ｉｎモル／ｊ　〜ｉＱ　ｍモル／ｌ測定の九めのさらに正確で精密な態様は、ナ ）　ＩＪクムイオン依存性＃ｒＥ例えはβ−がラクトシダーゼの使用である（例 Ｄ）。
血漿を、２−二トロフェニルー／−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＮＰＧ）と酵素β −り一がラクトシダーゼを含有する嶺＠混合物と共にインキュベートする。β− Ｄ−がラクトシダーゼによりて触媒作＃Ｉを受ける反応は、ナトリウムイオンの 存在に依存し、活性率は、ナトリウムイオン濃度の尺度である。この方法の主費 特徴は、ナトリウムイオン濃度が１００ｍ七ル／ｌｔ−越える血清または他の生 物学的液体中の測定のために、ナトリウムイオン濃度を減少させ、＃累は通常の 分析範囲（１１０〜１７０ｍモル／りにあるナトリウムイオン濃度での小さい変 化に対して最も敏感になるように適当量のナトリウムイオン選択性結合剤（例え ばクリプト２イクス［Ｆ］２２１）を使用することである。過度に高い１１１度 のマグネシウムおよびリチクムイオンの存在を包含する分析のために選択された 条件下で、２−二トロフェノールおよびがラクトースの形成率は、実質的に測定 されるナトリウムイオンのｍ度に比例する。最適β−がラクトシダーゼ活性′５ ！：得るためにマグネシウムイオンが要求される。リチクムイオンは、ナβ−Ｄ −がラクトシダーゼに対する基質としては、多くの他の化合物が好適である。全 く一般には、ガラクトシダーゼ含有に科Ｙｒ２ｉ１１当なβ−Ｄ−ガラクトシダ ーゼ基質と混合し、この基ＩＸを＃累によって切断し、次いで分裂主成物のびと つｔ−過当な方法で検出する。
＃素の作用により遊離されたグリコンまたはアグリコンは鉤足可能である。大畑 、扱者ｔ−鉤定する。基質として、火熱の基質ラクトース全使用ｖｖできるが、 色原性がラクトシトの使用が特に有利である。このように、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　 ２．、　３３３　＊　２０９　（１９６０）にはフェニル−／−Ｄ−がラクトシ ト、同様に、芳香環上で置換されたさらに別の誘導体、例えｉｆ／−Ｄ−ガラク トシダーゼの基質としての２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＮＰＧ ）および３−二）０７エ二ルーβ−Ｄ−がラクトシトが記載されている。加水分 解によって遊離されるフェノールを、Ｕｖ範囲で、ま良はニトロフェノールの場 合には短波可視波長範囲で測光法で測定する。アミノアンチ２リンとの酸化的結 合も、指示反応として続けることができる（　Ａｎａｌｙｚｉｃａｌ　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、　４０　、２８１　（１９７１）　参照）。他の基質は、西ドイツ特許 出り公開第３３４５７５８号明細書及び同第３４１１５７４号明細書に記載され ている。
血漿または血清の試料１０μｌを使用し、３７℃におけるナトリウムイオンを酵 素的に＃１定する丸めの主試薬の典型的な濃度範囲は次のとンシである二β−Ｄ −ガラクトシダーゼ　２５　Ｕ／Ｊ〜７５００　ＵｉａＮＰｅ　Ｏ，２５ｍモル ／ｊ　〜５　ｍ七ル／ｌクリプトフイクス■２２１　Ｑｍモル／ｌ〜１０ｍモル ／ｊ＊Ｉｋｌｔ、ｒ７〜９．５　２００ｍモル／ｊ　〜５ＱＱｍモル／ｊＭｇ” 　０．０１　ｍモル／ｊ　〜ｉ　Ｑ　ｍモル／１ＥＧＴＡ　（リチウム塩）　Ｑ ｍモル／ｌ　〜２０　ｍ七に／１血清アルブミン　０＆／ｊ〜５　ｐｉｌｌＥＧ ＴＡ　ｕ　、エチレンビス（オ中ジエチレンニトリロ）−四酢酸を意味する。従 って、ナ°トリウムとカリウムイオｙの分析を、酵素的に同じ−ＩＦ二ベット中 で対試験（諌ｉｎ　ｚｅｓｃ　）の形で実施することも可能である（例０参照） 。
カルシウムイオンの沖ｊ定のために、血漿試料（または他の体８［）を、ペグテ ド基質スクシニルーロイシン−メチオニン−ｐ−ニトロアニリドおよび＃素カル パインｌを含有する緩衝混合物と共にインキュベートする。カルバインｌによっ て触媒作用を受ける反応は、カルシウムイオンの存在に左右され、活性度は、カ ルシウムイオン＠にの尺度である。この方法の主要％徴は、カルシウムイオンの ＃に度を＃累が最も敏感である範ｔ！１ＩＩＩまで低下させるためにＷｋ的にカ ルシウムイオンと結合することのできるキレート化剤の使用である。
Ｌ−シスナインと２−メルカットエタノールの存在を包ち゛する分析のために選 択６れた条件下で、ｐ−＝）ロアニリン形！！Ｌ単は、実質的に測定されるカル シウムの濃度に比例する。
有利なペプチド基質は、一般式： ％式％ Ｃ式１’Ｐ、Ｒはアセチル、ベンゾイル、カルボベンゾキシ、スクシニル、−一 プトキシカルボニル１九Ｆｉ３−（２−フリル）アクリロイルに＆わし、Ｐｎ− Ｐ２−Ｐｌ　は有利にｈｐｘ位のＴｙｒ　、　Ｍｅｔ　、　Ｌｙｓ　また１１Ａ ｒｇおよび２２位のＬｅｕまたはＶａｌ残基を有する少なくとも２＠の残基のペ ゾテド鎖を弄わし、ｘＦｉ酵素の作用で遊離されて、色及び螢光の検出可能な変 化を生じる色原性まｆｃＦｉ螢光原性の基を弄わす〕によって記載できる。
ｘｔｔニトロフェニル、ナフチルまｆｃはチオベンジルエステル、同様に芳香族 環上にさらに置洪基を有するかま７’Ｃは有さないニトロアニリン、ナフチルア ミンまたはメチルクマリン基であってよい。数種の好適なペプチド誘導体は、Ｔ 、ササキ（Ｔ、５ａｓａｋｉ　）等によって、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、第 ２５９巷、１２４８９−１２４９４頁に記載されてｓ？９、その例はスクシニル −Ｌｅｕ　−Ｍｅｔ　−ＭＣＡ　（ＭＣＡ　＝　４−メチルクマリン−７−アミ ド）、スクシニル−Ｌｅｕ　−Ｔｙｒ　−ＭＣＡ　、スクシニル−Ｌｅｕ　−Ｌ ｅｕ　−Ｖａｌ　−Ｔｒｙ　−ＭＣＡ　＆よひも一ブト牛ジカルボニルーＶａｌ 　−Ｌｅｕ　−Ｌｙｓ　−ＭＣＡである。さらに合成基質は、ベルブマイヤーＨ １ｌ　（Ｅｄ）メンード・オプ・エンディマチインク・アナリシス（Ｂｓｒｇｍ ｅｙｅｒ　ＨＵ（Ｅｄ）Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚ）＋ｍａｚｉｃ　Ａｎａ ｌｙｓｉｓ　）　第３版、案５％。
８４〜８５頁（１９８４）に記載されている。
このような測定法および試薬のための化合物の一度範１は仄のとンりである： カルパイン　Ｉ　１００ｕＵ／ｊ〜４００００Ｕ／ｂ＊Ｂｕｃ−Ｌｅｕ−１＜ｅ ｃ−ｐ−ニトロアニリド１　ｍモルＢ　〜２０　ｍモＡ、／ｌ キレート化ＭＩＪ　Ｏ，０１ｍモＡ−／ｌ　〜１ｒｎモル／ＩＬ−システィン　 １　ｍモＬ／ｌ　〜１０　ｍモル／！２−メルカフトエタノール　１ｍモル／ｌ 〜１０ｍモル／！緩函斧」イミダゾール−ＨＵ　１０ｍモル／ｌ〜１００ｍ七ル ／１Ｐ）１　６〜８（有利な範Ｆ！！Ｊ７〜７．５）星印率は、この単位が基質 としてのカゼインと共に３０℃で６０分間インキュベートした後、７５０ｎｍで のｇ＆元度を１．０だけ上昇させる＃素意として定義されていることを意味する （　Ｎ、　Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ　ｅｃ　ａｌ、、　Ｊ。
Ｂｉｏｌ、　ｃｈｅｍ、　２５８　、８８８３〜８８８９　、　（１９８３）参 照）。
カルシ９ムに対する無視しうる結合能力を有する、要求δれる一範囲にｐｋを有 する数株の＃Ｃ膏剤を検定に用いることができる。多くのダツドータイｆｋ衝液 （Ｎ、　Ｅ、　（）ｏｏｄ　ｅｃ　ａｌ、、　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５　ｖ　４ ６７〜４７７（１９６６））？ｌ＋えばトリス（Ｔｒｔｓ）、ヘペス（Ｈｘｐｇ ｓ　）、モプン（ＭＯＰＳＯ）、ベス（ＢＥＳ　）、テス（ＴＥ８　）ンよびイ ミダゾールがこれらの懺求を満たす（例Ｈａｉｌ）。カルパインｌの代わりにコ ラーデナーゼを使用することができ、ｐｉ−１６，５〜７．５でＬ−インロイシ ル−Ｌ−７ナリルグリシルエチルエステル０．０２ｍモルフ１〜０．２ｍモル／ ｌを用いて螢尤度鋤定で検定することができる。
ミツ０．０１モル／　ｌ　、　Ｇｌｙ　−Ｐｈｅ　−＝　）　Ｃ”アニリド４ｍ モル／ｌおよびカテプシンＣ０，０２Ｕ／ＩＬｔを含有する緩衝混合物と共にイ ンキュベートする。ｐ−ニトロアニリンの形成は、完全にクロリドアニオンの存 在に依存する。さらに、プロミドイオンによる干渉を除去するために、またはｔ ＃巣の最通範囲にクロリドイオンの濃度を合わせるようにクロリドイオンの活性 を低下させるために、選択的結合剤を添加することができる。
分析のために選択された条件下（例５参照）で、ｐ−二トロアニリンの形成率： は、試料中のクロリドイオンの濃度に比例する。この例では、反応率を４０５ｎ ｍＫおけるＩ＆元夏の増加の測定によって画定する。
このような測定法の化合物の幽度範囲は次のとンりである： クエンｌ！１ｉｉＶＬ函斧ｊ　０．０１〜０．２モル／ｊｐｉ−１４〜７（有利 に５．０〜５．５）システアミン　１〜２０　ｍモル／ｌ Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−二？ｏアニリド　１〜２０　ｍ七ル／ｌカテグシンＣ２〜 １００　ｒｎＴＪｙａＬ所望−一範囲内にｐｋを有し、無視しうるクロリドｍ度 ？有する任意の＠ＴｋＪ剤ｔこの検定に使用することができる。前記記載の全カ テゴリーからの酵素の例（トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、オキシドレダク ターゼおよびリアーゼ）は、特にこれらの酵素源が好塩性生物からである場合、 クロリド依存性を有する仁とが文献中に示されている。ペプチドタイプの＃素の クロリド依存性は、広く記載されている。例えばジペプチジルペプチダーゼＩ（ カテゾシンＣ）、ＥＣ３゜４、１４．１　（Ｊ、　Ｋｅｎ　Ｍｃ　Ｄｏｎａｌｄ 、　Ｂｉｏｃｈ、　Ｂｉｏｐｈ、　Ｒｅｓ。
ＣｏＩ！Ｉ！ｏｕｎｉｃａｚｉｏｎ、２４　（５）　１９６６　、７７１　ｆ　 ）またはジペプチジルペプチダーゼｌ　ＥＣ，３，４，１４，３（Ｊ、　Ｋｅｎ 　Ｍｃ　Ｄｏｎａｌｄ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２ ４１（７ン１９６６．１４９４ｆ）Ｆｉ、双方とも、アミノ末端位からのオリゴ ペプチド誘導体の加水分解に触媒作用をする。もう一つの例は、アンイオテンシ ンを変換させる酵素ＥＣ３，４，１５，１であり、これは広範囲のオリゴペプチ ドのカルボキシル末端からジペプチドの加水分解的放出に触媒作用をする（　Ｐ 、　Ｂｕｎｎｉｎｇ　ｅ％ａ１．＋　Ｂｉｏｃｈ、　２６　ｍ　１９８７　＋　 ３３７４　ｔ　；Ｒ，５ｈａｐｉｒｏ　ｅｃ　ａｌ−＋　Ｂｉｏｃｈ、　２２　 ＃　１９８３　＊　３８５０ｆ）。
Ｇｌｙ　−Ａｒｇ　−ｐ−ニトロアニリドの代わシに、異なる他のジペプチド− ま７’Ｃはオリゴペグチド基負を使用することができる。−Ｆｉ　ｉＪなペプチ ド基質は、一般式：％式％ 〔式中、ジペプチジルペプチダーゼ９％にはＲ＝Ｅ。
およびＰｎ−Ｐｌは少なくとも２個の残基のペプチドｆａを表わす〕で記載され る。χは色原性または螢光原性の基を表わし、これは色素まｆｃは螢光色素での 検出可能な変化をもたらすようにＷ＃素の作用によって遊ＰＩ！される。ＸＦｉ ニトロフェニル−、ナフチル−またはテオベｙ　９　／ｌ／　ｚステル、同様に 芳香族環上にさらに＃を洪基を有するかまたは有さないニトロアニリン、ナフチ ルアミンまたはメチルクｉりン基であってよい。ジペチジルカルざキシペゾテダ ーゼ＃累の場合、Ｘはアミノ来電を表わし、ペプチド鎖の場合はＲは色原性また は螢ｙｔ原性の基であシ、これは＃素の作用によって遊離される。Ｒは、さらに 別の置換基を有するかまたＦｉ鳴さないＮ−２−フランアクリロイル−ま−ｆｃ はベンゾイル−基であってよい（例１参照）。
クロリドイオンの＃集的測定のもう１つの例（例Ｊ）として、血漿を４，６−エ チリデン（Ｇ？）　−ｐ−二トロフェニル（Ｇ１）−１Ｄ　−−ｒシトヘプタオ シド（４，６−エチＶデンーＧ？ＰＮＰ）（５ｍ％ｘ／ｊ）、Ｑ−７ミ５−ゼ（ ０，６０Ｕ　／μ）ｓＰよびα−グルコシダーゼ（＝３０Ｕ／鮭）を含有する後 衡混合物と共にイン中ユベートする。ｐ−ニトロフェノールの形層は、完全にク ロリドアニオンの存在に依存し、再び前稀釈、少麓の試料まｆｃはｌＩ集の殿通 範１１でクロリドイオン線度をＩＩＩ贅するためＯａ択的結合剤を使用する。こ のＫｋ４原理を次に１とめ、反応率は、４０５ｎｍＫｓ？仕る吸光度の上昇の測 定によって測定する。
Ｇ、　＋　２０２ＰＮＰ　＋２エチリデン−０４＋　２　（）３ＰＮＰ十二チリ デン−０３＋０４ＰＮＰ α−グルコシダーゼ ２０２ＰＮＰ　＋　０３ＰＮＰ　＋　１０　Ｈ２Ｏ４ＰＮＰ＋１０Ｇ （ＰＮＰ　＝　ｐ−ニトロフェノール：Ｇ＝ニブルコース。
このような測定のために使用される化合物の８１度範囲Ｆ１次のとｐりである。
ヘペスまたはクロリド不含緩ＹＪｆＪ剤　０．０１〜０．５　ｍモルフｔｐｉ（ ６，５〜７．５ α−アミラーゼ　６０〜６０００　ｖ／ｌα−グルコシダーゼ　３０００〜３０ ００００　ｕ／ｊ４．６−ニチリデンー０７ＰＮＰ　０．５〜１０　ｍモル／１ カテプシンＣＫ誦する罰に記載の検定変法（ガ１）を？ＩＩＪにも過用する。
これらｏ＊ｉｓは、クリプタント例えにクリシト２イクスｏ２２１ｓ？よひクリ プトフイクス＠２２２に強く結合する。従ってこれらは、より物くＭ会６れてい る他の金属と置換する。容易にｆＩＬ供される戴属イオンの一例は亜鉛である。
亜鉛イオンに血漿中に非常に低い＠度で存在する。従って％　ｘ２２１に錯結合 した亜鉛イオンをａ衝血清混合物に添加することは可能である。もし重金属が存 在するならば、亜鉛イオンは遊離され、それらの存在は、亜鉛イオンに対して高 い感受性の酵素ピリドキサールキナーゼ（年の脳から）の刺激によって検出でき る。多くの他の同様な競争的な結合検定も可能であり、これらｆ：５！施例に記 載するが、これらのみに限定されるものではない。
１炭酸イオンの測定 １炭酸イオンは、本発明に包含される原理の変法を用いて測定することができる 。多くの配位子、例えばクリプタンドはＰｌ′１感受性で、この特性は、１炭ｒ Ｒ塩を測定するのに利用できる。本質的な利点としてプロトンを中和する１炭酸 塩の能力が挙けられる。塩＠を添加され、非常に−く緩衝された血清試料のめは 、１炭酸塩′ｆＩ＆度の駒数として変化することが認められる。最終ｐｔ’を値 は、−一感受性イオン結合剤、例えはクリシト２イクス■２２１の存在下に存在 遊離ナトリワムイオン（β−がラクトシダーゼで検出されるものとして）の倉で 検出され、これは本来の１炭酸塩徴度の関数である。不買的に、全１炭酸塩をヒ ドロ千シルイオンに変換するために等しい量のｍｃｚ　（７５ｍモル／ｊ）で血 清を約ｐｌｉ４．５ｔ″′Ｃ酸性にし、仄いでイオン逃択性醇累例えはβ−ガラ クトシダーゼおよび過当な一一感受性イオンに合剤を加えた希トリス皺衡液を細 いて、−７，５〜７．８で検定系と反応させる。試料中のナトリクムイオンの量 に応じて補正が必要であるので、正確な結果を得るために試料のナトリクムイオ ン濃度を知るべきである。この方法は、−検出薬としてＯ色原体指示薬を用いる 方法よりも実質的にさらに敏感である（例Ｋ）。
血漿または血清の試料１０μｔを用いる、６７℃における重炭酸塩の酵素的＃ｊ 定のための主７試薬の典型的ｉｌ！１度範囲は次のとお９である：β−Ｄ−がラ クトシダーゼ　２５０　Ｕ／ｌ〜７５００　ｖ／１ＮＰＧ　Ｏ，２５ｍモル／ｊ 　〜５　ｍモル／βクリゾトフイクスｏ２２１　０．２ｍモル７ノ〜５ｍ七ル／ ！緩衝剤、ｐ）１７．５〜７．８　１　ｍモル／ｌ　〜１０　ｍモル／１Ｍｇ” 　０．０１　ｍモル／ｌ　〜ｉＱｍモル／ｊＥＧＴＡ　（ＬｉＱ）　０．１　ｍ モル／ノー５Ｈ１モル／を血清アルブミン　０ｇ７１〜５９／４ ナトリ９ムイオン論度を補正する必要性は、血漿中にマイクロモル徴度で通常存 在する微量金Ｓ＜例えば亜鉛イオ／）に対して敏感な＊累＜ｆｔｌえはビリドキ ／サールキナーゼ）の使用によって避けることができる。
微１金属の結合剤への結合が一感受性で、クリプトフイクス■２２１に対するナ トリクムイオンと同様の親和性を有する吻合、′に炭酸イオンは、皿ａ甲に見い 出されえる裏皮より十分に過剰で反応混合物中に亜鉛イオンを包含することによ り施定できる。従って内在性亜鉛イオンは干渉しない。
前記記載の方法は、簡単、非常に迅速、正確かつ精と関係する多くの問題も避け ることができる。この方法は多角的分析を実施する大きい装置を使用するように 適合させることができるが、なお病床近くでの緊急用の、高伽でない単独装置と 共に使用することもできる。キットの形にこの方法をおさめることは簡単である 。さらに、カリウム２よひナトリウムイオン画度の測定を引き伏ぎ同一キュベツ ト内で実施することができる（例Ｇ）。この方法が乾燥化学薬品を使用する機械 を備えた医院にとって有用であることも予期される。
これらの方法は自動分光計音用いて開発されたが、これらは自に！Ｉま７′ｃは 手動の夾験呈装置、例えば螢九光匿計、ルミノメータ−１同位元素カクンター等 に容易に過合しうる。
〔実施ガ〕
次いで、本発明を、血清または血漿試料１０μｔを基礎とする仄の例によりざら に詳述する。これらの例は説明のために空けられているのであり、不発明にこれ らのみに限定６れるものではない。
久の例で、少量の試料（血清筐たは血漿の動台、袴に記載のない限シ１０μｊ） を凌賞された基質および特定の共因子を含有する試薬１と混合し、一般に０．１ 〜５分間インキュベートする。奴光度の絖２喉りは、通常、このインキュベーシ ョンの期間中−足の間隔で行なう。次いで、インジケータ酵素を含有する試薬２ を飾部し、反応を監視する。いくつかのガでは、試薬１がインジケータ＃素を含 有し、試薬２が適当な基質を含有する。例は、＃ｔ、科、試薬１ｓ？よひ試薬２ を混合した後の最終反応混合物を示している。
ン裏皮未知） 最終インキュベーション混合物は次のものを含有するニ ドリス−ＨＣＪ　緩徽ｆｌ＋４、ｐ）１７．４　１７５ｍモル／ｌＬｉ”　［Ｌ ｉ０Ｅ　ｉ　７　ｒｎモル／１％ＬｉＣｊ　３ｍ七ル／ｌ〕２０　ｍモル／ｊ ＭｎＣｊ、２　３−Ｏｍモル／Ｅ 却Ｐ（遊離酸）　２．６ｍモル／１ ＰＥＰ　（中和されたトリス塩）　２．９ｍモル／１ＮＡＤＨ０，４ｍモル／Ｉ ＬＤＨ（２５°Ｃで検定）　１７Ｃｊ００Ｕ／ｚバチルス・ステアロサーモフィ ルスからのＰＫ　８９０　Ｕ／ＩＫＧ　４．０ｍモル／ｊ ＧＤＨ（グリセリフｒ：Ｐ：２５℃で検定）　ｂｂＤＯｖ／ｌヒト皿溝アルブミ ン　１４（Ｊ〜／ｅ するナトリウムイオンのピルベートキナーゼ上への刺激的作用を１［するために 、ナトリウムイオン１４０ｍ七ル／ｌを含有する。
同じである。
ナトリウムイオンが１４０ｍモル／　Ｉ　ｋＴ１わる（又は上筒わる）場合には 、ナトリクムイオン濃度１０ｃ１モル／ｌにつきカリウム０．１コモル／！を添 加（または減する）することによって混合物のナトリウムイオンに関して禍正す ることができる。しかしながら、との補正ｒｉ既知のナトリウムおよびカルシク ム濃度を含有する水浴液を分析することによって変えられるべきである。
例Ｃ ナトリウムイオン結合剤の存在下にピルベートキナーゼを用いるカリクムイオン 衾度の艶定例Ｂと同様であるが、ヒト血清アルブミンを除き、媒体は、付加的に １回の検定当りクリグトフィクス［Ｆ］２２１６μモルを含有する。個々の試料 のカリヮムイオン含有倉の違いによるクリグトフィクス［Ｆ］２２１からのナト リウムイオンのｆｆ１１洪の変動を最小限にするために７．８の−１−選択する 。
含有するニ トリスＨｃｔ、ｐｌｉ８．７　（３７℃）　３００　ｒｎモル／ｊゾチオスレイ トール　４１１１１モル／７！硫酸マグネンクム　７．５ｍモル／を 塩化リチウム　１６ｍ七ル／ｊ Ｋ（）ＴＡ　（リチウム塩）　０．４４ｍ七ル／ｌヒト血清アルブミン　４６０ １ｎ９／１β−ガラクトンダーゼ　７６０Ｕ／Ｊ 反応を成長４２０ｎｍ（またはその付近）で監視し遊離２−ニトロフェノールの 形成率訃よひ当初試料中のナトリウムイオンの漉度を測定する。
変法す二ｆ法ａと比軟したもう１つの方法は、前稀釈によって試料瞭度を１０倍 低下させるか、または少量の試料を用い、この場合はクリプタント′に除去する こ／ｂ）（この動台にはクリプタンドｔ−［除できる）の液体での測定。
例Ｅ ピルベートキナーゼを用いるナトリウムイオンの測定（カリクムイオン感受性を 低下させる条件下で、ナトリウムイオンによる酵素活性の直接刺激）変法ａ：血 漿試料１０ｓ！に対し、イン１１？工ベーシヨン混合物は次のものを含有するニ トリスＢ（Ｊ、ｐ）１８．７（３７℃）　３００　ｍモル／１ＭｇＣｊ２　５　 ｍモｈ／Ｉ ＮＡＤＨ０，３４ｍモル／１ ＬＤＨ（２５℃で検定）　１７０００　ｖ／ｂＰＫ　（クサイの筋肉から、３７ ℃で検定）　２０００　ｖ／ａＫＧ　４　ｆｉ１モル／ｊ グリセリン中のｏＤｎ（２５℃で検定）　８６００　Ｕ／＃クリグト２イクス■ ２２２　１．２５μ七ル／検定ナトリワムイオン較正浴＊は、血清カリクムイオ ンのピルベートキナーゼへのカリクム活性化作ｐＦ１を補償するために、カリツ ム４ｍモル／ｊを含有する。
例Ｆ ピルベートキナーゼ１１３いるナトリウムイオンの枠１足（ｆＩｌ争的結合恒定 ）−カリクムイオン耽知血ＩＲ臥科１０μ婆に対し、最終イン寄エベーション混 合ｙｍは次のものを含有するニ ゲリシン−９，８３００ｍ七ル／ｊ ＭｇＣＪ２　５　ｍモル／！ ＡＤＰ　（遊離酸）　２．６ｍ七ル／ｊＰＥＰ　（中和されたト、リス塩）　２ ．９ｍｍモル／１ＬＤＨ０，３４ｍ七ル／ｊ ＬＤＨ（２５℃で検定）　１７０００　ｕ／ｌクサギの筋肉からのＰＫ（３７℃ で検定）　ａ９ｏＵ／ｊＫ０　４　ｍモル／１ ＧＤＨ（２５℃で検定）　８５００　ｖ／を塩化カリワムｔこの試薬に添加し、 クリグトフイクスｏ２２１から化学量論的にナトリウムイオンによってｗＬ！ｌ Ｉ！シ、こうして、Ｋ科のナトリウムイオン濃度を、定量されるようにする。
オン濃度の−ｊ定（対試１１４） ｉ夏１「ｉ；資ｉｔｖする以外、１丁、ナトリウムイオン一度を例りと同様に検 定する：ＡＩ）Ｐ　（遊１１ｉｉ１）　２−６ｍ七ル／ＩｐＥｐ　（中和された トリス塩）　２．９ｍｍモル／１ＬＤＨＯ，４ａｔモル／ｌ ＫＧ　４．Ｏｍｍモル／ １ＬＤＨ８６ＱＯＵ　／　＃ 反応率の測定によるナトリウムイオンの測定に引続き、インキュベーション混合 物のＰＨを少量の塩酸で−７，４に低下させる。
仄いで、指示最終濃度を達成するために次の成分を添加する： ＬＤＥＩ　１７０００　Ｕ／１ バチルス・ステアロサーモフィルスからのＰＫ　８９０　ｔ）／ｊＭｎ（Ｊ２　 ３．Ｏｍモｘ／Ｉ Ｌ１ｃｉ　２０．Ｏｍ七ル／！ その後、反応″４を３４０　ｎｍで！ｆ視することができるが、ナトリウムイオ ン指示反応で遊離δれる２−二トロフェノールによる可能な干渉を最小にするた めに少し高い波長で測定することもできる。
分能する。カルシクムイオンの画定のために、医科をイミダゾール−Ｈ（Ｊ　覆 衝剤（ｐｌｉ７．３）５０ｍモル／１、Ｌ−システィン５ｍ七ル／ｊ１２−メル カグトエタノール２．５ｍモル／！、ＥＧＴＡ　Ｏ，１ｍ七ル／ｊ、８ｕｃ−Ｌ ｅｕ　−Ｍｅｔ　−ｐ−ニトロアニリド５ｍモル／ｊｋｔ＊する混合物と共に３ ０℃でインｄＦ：Ｌベートする。４０５ｎｍでの奴光度の増加ｔ、５分間隔で監 視し交。この率は試料のカルシウムイオン改良に比例する。
この実験では、血漿（５ｔｓｌ　）　を得るために少量の血液試料を遠心分離す る。クロリドイオンの測定のために、インキュベーション混合物はクエンｍ＊衝 液（ｐ１１５．０）０．０５モル／ｌ、システアミン１０ｍモル／ｌ、　Ｇｌｙ −Ａｒｇ　−ｐ−二）　ｌ：Ｉアニリド４ｍモル／　１ンよひカテゾシンＣ０， ＯＩＵ／鮎を含有する。後者はクロリドイオンを除去するために、リン酸ナトリ クムｍｓ剤Ｃｔｋ１６．８　）　１０　ｍモル／ｌおよび４３　％　（ｖ／ｖ） のグリセリンに対して透析されている。この方法で得られた典戯的な較正曲りを 第１図に示す。
血漿試料５μｔに対して阻害混合物は仄のものを富有する： ヘペスまたは択一的クロリド不含酸衡叡　１００ｍモル／４−７．１ α−アミラーゼ　６００　ｕ／ｌ α−グルコシダーゼ　３００００　Ｕ／感４．６−エチリデン−〇、ＰＮＰ　５ 　ｍ七ル／！反応ｔ−波長４０５ｎｍ（１ｆｃｒｉその付近）で監視し、遊Ｍ４ −二トロフェノールの形成率ｐよひこれに伴う当初試料中のクロリドイオン機成 ｋ　ｍ＋定する。
度の測定 含有するニ トリスＨ（Ｊ、　ＰＩ（７，８（３７°Ｃ）　５ｍモル／！シデオスレイトール 　４Ｉ！１モル／！億ａｔ−グネシクム　７．５ｍモル／を塩化リチワム　ｉ６ ｍモル／１ ＥＧＴＡ　（リチクム塩）　０．４４ｍモル／ｌヒト血清アルブミン　４６０■ ／ｊ β−ガラクトシダーゼ　１５００Ｕ／ＩＮＰＧ　１．５ｍモル／！ クリプトフイクス■２２１　２．０μモル／検定ＥＧＴＡ　Ｈエチレンビス（オ キシエチレンニトリロ）四酢酸を意味する。試料を、その−４ｍを４．５に低下 するために当量のＨＣｊ　（血漿に対し７５ｍモル／ｌ）と共に予めイン中ユベ ートする。その彼、反応ｔｔｃ＊４２０　ｎｍ　（まｆｃはその付近）で監視し 、遊離２−ニトロフェノールの形成率、およびそれに伴う当初試料中の１炭酸イ オン濃度を測定する。当初試料中のナトリワムイオン亀度に胸して補正を行なっ た。
変法ｂ：ビリドキサールキナーゼ、ピリドキサールおよび亜鉛イオンをβ−がラ クトシダーゼ２よひＮＧＰにＪｔ！ｌｌ！える。
国際調査報告 ｍｍ−＾・−ｍ−〇”　ＰｃＴ／ＥＰ　８８１００２７５１ｍ−ψ１ｌｓｓｌ　 ａｓｓｖｔａｂ針−・ｐＣτ／ＥＰ　８８１００２７５

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．液体中のイオンを測定するために、酵素活性へのこれらイオンの影響を測定 することを特徴とする、体液中のイオンの測定法。 ２．液体は、生物学的又は非生物学的液体である、請求の範囲第１項記載の方法 。 ３．生物学的液体は血液、血清、血漿、尿、汗、脳髄液、リンパ又は腸分泌液、 滲出液又は浸出液であり、非生物学的液体は水又は水性抽出液又は混合物である 請求の範囲第２項に記載の方法。 ４．酵素はトランスフエラーゼ、ヒドロラーゼ、オキシドレダクターゼ又はリア ーゼである、請求の範囲第１項から第３項までのいずれか１項に記載の方法。 ５．トランスフエラーゼは、移送性燐含有群であり、ヒドロラーゼはグリコッダ ーゼであるか又はペプチド結合への作用物である、請求の範囲第４項記載の方法 。 ６．ヒドロラーゼはα−又はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、カルボキシペプチダー ゼＡ、コラゲナーゼ、アミラーゼ、カルパインＩ、カルパインＩＩ、ジペプチジ ルアミノペプチダーゼＩ（カテプシンＣ）又はホスホグリコレートホスフアター ゼである、請求の範囲第５項記載の方法。 ７．トランスフエラーゼはビルべートキナーゼ、ヘキソキナーゼ、アデニレート キナーゼ、ピリドキサールキナーゼ又はアセテートキナーゼであり、ヒドロラー ゼはα−又はβ−Ｄ−ガラクトシダーぜ又はカルボキシペプチダーゼＡである、 請求の範囲第５項に記載の方法。 ８．オキシドレダクターゼは、ドナー分子のＣＨ−ＯＨ基又はドナーのアルデヒ ド又はオキソ基への作用物である、請求の範囲第７項に記載の方法。 ９．オキシドレダクターゼはグリセロールデヒドロゲナーゼ、アセトアルデヒド デヒドロゲナーゼ又はチロシナーゼ（カテコールオキシダーゼ）である、請求の 範囲第７項に記載の方法。 １０．リアーゼは炭素−炭素リアーゼ又は炭素−酸素リアーゼである、請求の範 囲第４項に記載の方法。 １１．リアーゼは、アルドラーゼ又はカルボニックアンヒドラーゼである、請求 の範囲第９項に記載の方法。 １２．イオンは、カリウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシワム、マンガン 、リチウム、鉛、亜鉛、銅、鉄又は他の重金属イオン又は陽子、重炭酸、クロリ ド、アンモニウム又はアンモニウムになりうる物質よりなる非金属イオンである 、請求の範囲第１項から第１１項までのいずれか１項記載の方法。 １３．干渉イオンを結合剤でマスキングする、請求の範囲第１項から第１１項の いずれか１項に記載の方法。 １４．試料の稀釈が可能でない場合には、被測定イオンを結合剤を用いて測定に 最適のレベルまで濃度を低下させる、請求の範囲第１項から第１２項までのいず れか１項記載の方法。 １５．ピルべートキナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ又はアセトアルデヒ ドデヒドロゲナーゼを用いてカリウムイオンを測定する、請求の範囲第１項から 第１４項までのいずれか１項記載の方法。 １６．酵素ピルべートキナーゼ又はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いて、ナトリ ウムイオンを測定する、請求の範囲第１項から第１４項までのいずれか１項記載 の方法。 １７．干渉イオン又は分析質をクリプタンド、コロナンド、ボタンド、クラウン エーテル、スフエランド、ヘミスフエランド、カリキサレンおよびこれらの組合 せ物、天然産イオノフオレ、環状ペプチド、コンプレクソンおよびキレート化剤 およびそれらの誘導体、周期律表第１ｂ族および第２ｂ族の金属と結合させる、 請求の範囲第１３項又は第１４項に記載の方法。 １８．カリウムイオンの測定の際には干渉ナトリウムイオンをクリプトフイクス ■２２１と結合させ、ナトリウムイオンの測定の際には、干渉カリウムイオンを クリプトフイクス■２２２と結合させる、請求の範囲第１１項から第１７項まで のいずれか１項記載の方法。 １９．β−ガラクトシダーゼを角いるナトリウムイオンの測定時に、遊離ナトリ ウムイオンの濃度を結合剤を用いて低下させる、請求の範囲第１４項記載の方法 。 ２０．結合剤はクリプトフイクス■２２１である、請求の範囲第１４項記載の方 法。 ２１．インジケータイオンと錯体を形成し、これからインジケータイオンが被測 定分析質であるイオンにより化学量論的に換えられる請求項１７による結合剤を 存在させ、酵素活性に対する換えられたインジケータイオンの影響を検定し、こ の際、分析質の濃度を間接的に測定する、請求の範囲第１４項記載の方法。 ２２．酵素ピルべートキナーゼであり、インジケータイオンはカリウムであり、 結合剤はクリプトフイクス■２２１であり、被測定イオンはナトリウムである、 請求の範囲第２１項記載の方法。 ２３．酵素はキナーゼであり、インジケータイオンはＭｇ２＋であり、結合剤は キレート化剤であり、イオンは金属である、請求の範囲第２１項記載の方法。 ２４．酵素はピリドキサールキナーゼであり、インジケータイオンはＺ２＋であ り、結合剤はクリプトフイクス■２２１であり、イオンは重金属である、請求の 範囲第２３項記載の方法。 ２５．被測定イオンが、ｐＨ値で変化を起こし、これが錯体からのインジケータ イオンをｐＨ−感受性結合剤で換える、請求の範囲第２１項記載の方法。 ２６．酵素はβ−ガラクトシダーゼであり、ｐＨ−感受性結合剤はクリプトフイ クス■２２１であり、インジケータイオンはナトリウムであり、被測定イオンは 重炭酸イオンである、請求の範囲第２５項記載の方法。 ２７．酵素はα−アミラーゼ又はカテプシンＣであり結合剤はＡｇ又はＨｇであ り、被測定イオンはクロリドである、請求の範囲第１４項及び第１７項のいずれ か１項記載の方法。 ２８．酵素はコラゲナーゼ又はカルパインＩ又はカルパインＩＩであり、結合剤 はキレート化剤であり、被測定イオンはカルシウムである、請求の範囲第１４項 及び第１７項のいずれか１項記載の方法。 ２９．感受性インジケータ酵素の競争的阻害剤であるイオンを検定に包含する、 請求の範囲第１項から第１３項までのいずれか１項記載の方法。 ３０．被測定イオンはナトリウム又はカリウムであり競争的阻害剤はリチウムイ オンである、請求の範囲第２９項記載の方法。 ３１．活性がイオンによつて影響される酵素よりなる液体中のイオンを測定する ための組成物。 ３２．活性がイオンにより影響される酵素、液体中の干渉イオンを結合するか又 は、分析質イオンの濃度を測定に最適のレベルまで低める結合剤より成る、請求 の範囲第３１項記載の液体中のイオンを測定するための組成物。 ３３．ピルべートキナーゼ及びクリプタンドより放るカリウムイオンを測定する ための、請求の範囲第３２項記載の組成物。 ３４．クリプタンドはクリプトフイクス■２２１である、請求の範囲第３３項記 載の組成物。 ３５．ピルべートキナーゼ及ひクリプタンドよりなるナトリウムイオン測定のた めの、請求の範囲第３２項記載の組成物。 ３６．クリプタンドはクリプトフイクス■２２２である、請求の範囲第３５項記 載の組成物。 ３７．β−Ｄ−ガラクトシダーゼ及ひクリプタンドよりなる、ナトリウムイオン 測定のための、請求の範囲第３２項記載の組成物。 ３８．クリプタンドはクリプトフイクス■２２１である、請求の範囲第３７項記 載の組成物。 ３９． ＰＫ（Ｂ．ステアロテルモフイルス） 　　　　　　　　　　　　　　　５０Ｕ／ｌ〜１００００Ｕ／ｌＰＥＰ（中和さ れたトリス塩）　０．３ｍモル／ｌ〜３０ｍモル／ｌクリプトフイクス■２２１ 　　　０ｍモル／ｌ〜３０ｍモル／ｌＮＡＤＨ　　　　　　　　　　　０．０１ ｍモル／ｌ〜０．８ｍモル／ｌ緩衝剤、ｐＨ７−８　　　　　　５０ｍモル／ｌ 〜５００ｍモル／ｌＭｎ２＋又はＭｇ２＋　　　　　１ｍモル／ｌ〜１０ｍモル ／ｌＬｉＣｌ　　　　　　　　　　　２ｍモル／ｌ〜１００ｍモル／ｌＡＤＰ（ 遊離酸）　　　　　　　０．５ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌＬＤＨ（２５℃で検 定）　　　　５０００Ｕ／ｌ〜１０００００Ｕ／ｌ血清アルブミン　　　　　　 　　０ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌＧＤＨ（２５℃で検定）　　　　２５００Ｕ／ｌ〜２０ ０００Ｕ／ｌＫＧ（遊離酸）　１ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌより成る、請求の 範囲第３１項記載の組成物。 ４０． グリセロールデヒドロゲナーゼ 　　　　　　　　　　　　　　　５０Ｕ／ｌ〜１０００Ｕ／ｌグリセロール　　 　　　　　　　０．３ｍモル／ｌ〜３ｍモル／ｌクリプトフイクス■２２１　　 　０ｍモル／ｌ〜３０ｍモル／ｌＮＡＤ　　　　　　　　　　　　０．１ｍモル ／ｌ〜５．０ｍモル／ｌ緩衝剤、ｐＨ９　　　　　　　　２０ｍモル／ｌ〜５０ ０ｍモル／ｌ血清アルブミン　 ０ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌＧＤＨ（２５ ℃で検定）　　　　２５００Ｕ／ｌ〜２００００Ｕ／ｌＫＧ（遊離酸）　　　　 　　　　１ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌより成る、請求の範囲第３１項記載の組 成物。 ４１． アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ 　　　　　　　　　　　　　　　５０Ｕ／ｌ〜１００００Ｕ／ｌグリコールアル デヒド　　　　　０．３ｍモル／ｌ〜３０ｍモル／ｌクリプトフイクス■２２１ 　　　０ｍモル／ｌ〜３０ｍモル／ｌＮＡＤ　　　　　　　　　　　　０．０５ ｍモル／ｌ〜２．０ｍモル／ｌ緩衝剤、ｐＨ７−８　　　　　　５０ｍモル／ｌ 〜５００ｍモル／ｌジチオスレイトール　　　　　　０．１ｍモル／ｌ〜２ｍモ ル／ｌ血清アルブミン　　　　　　　　０ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌＧＤＨ（２５℃で検 定）　　　　２５００Ｕ／ｌ〜２００００Ｕ／ｌＫＧ（遊離酸）　　　　　　　 　１ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌより成る、請承の範囲第３１項記載の組成物。 ４２． アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ 　　　　　　　　　　　　　　　５０Ｕ／ｌ〜１００００Ｕ／ｌ４−ニトロフエ ニルアセテート 　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｍモル／ｌ〜２ｍモル／ｌクリプトフイ クス■２２１　　　０ｍモル／ｌ〜３０ｍモル／ｌＮＡＤＨ　　　　　　　　　 　　　　　　０．００１ｍモル／ｌ〜０．１ｍモル／ｌ緩衝剤、ｐＨ７−８　　 　　　　５０ｍモル／ｌ〜５００ｍモル／ｌジチオスレイトール　　　　　　０ ．１ｍモル／ｌ〜２．０ｍモル／ｌ血清アルブミン　　　　　　　　０ｇ／ｌ〜 ５ｇ／ｌＧＤＨ（２５℃で検定）　　　　２５００Ｕ／ｌ〜２００００Ｕ／ｌＫ Ｇ（遊離酸）　　　　　　　　１ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌより成る、請求の 範囲第３１項記載の組成物。 ４３． β−Ｄ−ガラクトシダーゼ　　　２５Ｕ／ｌ〜７５００Ｕ／ｌＮＰＧ　　　　　 　　　　　　　０．２５ｍモル／ｌ〜５ｍモル／ｌクリプトフイクス■２２１　 　　０ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ緩衝剤、ｐＨ７−９．５　　　　２００ｍモ ル／ｌ〜５００ｍモル／ｌＭｇ２＋　　　　　　　　　　　０．０１ｍモル／ｌ 〜１０ｍモル／ｌＥＧＴＡ（リチウム塩）　　　　０ｍモル／ｌ〜２０ｍモル／ ｌ血清アルブミン　　　　　　　　０ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌより成る、請求の範囲第 ３１項記載の組成物。 ４４． ＰＫ（ウサギ筋肉）　　　　　　５０Ｕ／ｌ〜１００００Ｕ／ｌＰＥＰ（中和さ れたトリス塩）　０．３ｍモル／ｌ〜３０ｍモル／ｌクリプトフイクス■２２１ 　　　１ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌＮＡＤＨ　　　　　　　　　　　０．０１ ｍモル／ｌ〜０．８ｍモル／ｌ緩衝剤、ｐＨ９−１０　　　　　５０ｍモル／ｌ 〜５００ｍモル／ｌＭ８２＋　　　　　　　　　　　１ｍモル／ｌ〜１０ｍモル ／ｌＡＤＰ（遊離酸）　　　　　　　０．５ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌＬＤＨ （２５℃で検定）　　　　５０００ｍモル／ｌ〜１０００００Ｕ／ｌＫＣｌ　　 　　　　　　　　　　２ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ血清アルブミン　　　　　 　 　０ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌＧＤＨ（２５℃で検定）　　　　２５００Ｕ／ｌ〜２ ００００Ｕ／ｌＫＧ（遊離酸）　　　　　　　　１ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ より成る、請求の範囲第３１項記載の組原物。 ４５． カルパインＩ　　　　　　　　　１０００Ｕ／ｌ〜４００００Ｕ／ｌＳｕｃ−Ｌ ｅｕ−Ｍｅｔ−ｐ−ニトロアニリド　　　　　　　　　　　　　　　１ｍモル／ ｌ〜２０ｍモル／ｌキレート化剤　　　　　　　　　０．０１ｍモル／ｌ〜１ｍ モル／ｌＬ−システイン　　　　　　　　１ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ２−メ ルカプトエタノール　　　１ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌ緩衝剤、イミダゾール −ＨＣｌ　１０ｍモル／ｌ〜１００ｍモル／ｌｐＨ　　　　　　　　　　　　　 ６−８（有利な範囲７−７．５）より成る、請求の範囲第３１項記載の組成物。 ４６． へペス又はクロリド不含の緩衝剤 ０．０１ｍモル／ｌ〜０．５ｍモル／ｌｐＨ　　　　　　　　　　　　　　６． ５〜７．５α−アミラーゼ　　　　　　　　　６０Ｕ／１〜６０００Ｕ／ｌα− グルコシダーゼ　　　　　　　３０００Ｕ／１〜３０００００Ｕ／ｌ４，６−エ チリデン−Ｇ７ＰＮＰ　０．５ｍモル／１〜１０ｍモル／ｌより成る、請求の範 囲第３１項記載の組成物。 ４７． クエン酸塩緩衝剤　　　　　　　　　　０．０１ｍモル／１〜０．２ｍモル／ｌ ｐＨ　　　　　　　　　　　　　　　　４−７（有利に：５．０−５．５）シス テアミン　　　　　　　　　　　　１ｍモル／ｌ〜２０ｍモル／ｌｇｌｙ−ａｒ ｇ−ｐ−ニトロアニリド　１ｍモル／ｌ〜２０ｍモル／ｌカテプシンＣ　　　　 　　　　　　　　２ｍＵ／ｍｌ〜１００ｍＵ／ｍｌより成る、請求の範囲第３１ 項記載の組成物。 ４８． β−Ｄ−ガラクトシダーゼ　　　　　　２５０Ｕ／ｌ〜７５００Ｕ／ｌＮＰＧ　 　　　　　　　　　　　　　　０．２５ｍモル／ｌ〜５ｍモル／ｌクリプトフイ クス■２２１　　　　　　０．２ｍモル／ｌ〜５ｍモル／ｌ緩衝剤、ｐＨ７．５ −７．８　　　　　１ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌＭｇ２＋　　　　　　　　　 　　　　　０．０１ｍモル／ｌ〜１０ｍモル／ｌＥＧＴＡ（Ｌｉ塩）　　　　　 　　　　０．１ｍモル／ｌ〜５ｍモル／ｌ血清アルブミン　　　　　　　　　　 　０ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌより成る、請求の範囲第３１項記載の組成物。
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