NO176072B - Fremgangsmåte og materiale for bestemmelse av ioner i fluider, og blandinger for bestemmelse av kalium- og natriumioner - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse angår en fremgangsmåte og et materiale for bestemmelse av ioner, i det følgende også betegnet analytter, i biologiske og ikke-biologiske fluider. Oppfinnelsen angår også blandinger for bestemmelse av kalium- og natriumioner, og en fremgangsmåte for å måle konsentrasjonen av disse i samme kyvette.

Oppfinnelsen er basert på den evne mange analytter

har til å stimulere eller inhibere aktiviteten av et følsomt enzym. Analyttene kan være kationer eller anioner, metalliske eller ikke-metalliske, enkle eller sammensatte. I praksis viser det seg ofte at analytten er til stede i prøven i en konsentrasjon som ligger utenfor følsomhetsområdet for det relevante analytiske indikatorenzym, eller at forstyrrelser forårsakes av tilstedeværelse av andre ioner som enzymet også

er følsomt overfor. Med denne oppfinnelse løses disse problemer på forskjellige måter.

Innenfor klinisk biokjemi er måling av serumelektro-lytter de mest vanlige analytiske tester som utføres i hospitaler. Disse målinger kreves ikke bare ved rutineundersøkel-ser, men ofte i nødssituasjoner og livstruende situasjoner hvor det er nødvendig med hurtig analyse. Da en viktig kilde for forsinkelser i hospitaler er transporten av prøver fra pleieavdelingene til diagnoselaboratoriene, vil en metode som lett kan utføres så å si ved sengekanten være særlig verdifull i nødssituasjoner.

En vanlig metode til å analysere kalium og natrium i praktisk klinisk biokjemi er flammefotometri. Denne metode er basert på det prinsipp at visse atomer, når de energetiseres ved oppvarmning, eksiteres og emitterer lys av en karakteristisk bølgelengde når de vender tilbake til basistilstanden. Intensiteten av strålingsenergien av karakteristisk bølge-lengde som utvikles av atomene i flammen, er direkte proporsjonal med antallet atomer som eksiteres i flammen, hvilket igjen er direkte proporsjonalt med konsentrasjonen av den angjeldende substans i prøven. Utstyret som kreves, er kom-plekst og relativt kostbart og krever bruk av brennbare gasser.

En alternativ metode, spesielt beregnet for natrium, kalium og klorid, gjør bruk av ioneselektive elektroder. Ideelt vil hver elektrode oppvise en unik ioneselektiv egenskap som gjør at den bare gir respons på ett ion. I praksis er dette ikke tilfellet, og forstyrrende ioner finnes for samtlige ioneselektive elektroder. Dessuten er ionespesifikke elektroder ikke absolutt spesifikke, selv om det vanligvis er mulig å foreta korreksjoner. Elektrodene måler det utviklede potensiale i nærvær av det spesifikke ion. Instrumenteringen er relativt kostbar. Ingen av metodene kan utføres spektrofotometrisk, og det kliniske behov for ionemåling resulterer derfor i en vesentlig økning i kompleksiteten av kommersielt tilgjengelige kliniske analyseanordninger, av hvilke de fleste er konstruert først og fremst for spektrofotometriske under-søkelser. Begge metoder krever en betydelig grad av dyktighet og kunnskaper for å kunne utnyttes på en tilfredsstillende måte.

På tilsvarende måte krever rutinemessig bestemmelse av klorid ved hjelp av coulometriske metoder spesiell instru-mentering. Sluttpunktet for denne titreringsmetode påvises ved en økning i den elektriske fluks ved fullføring av dannelsen av uoppløselig sølvkloridprodukt. Alternativt kan det benyttes potentiometriske bestemmelser, som også er meget tidkrevende og involverer bruk av tilleggsutstyr.

For klorid finnes det dessuten flere fotometriske og titrimetriske metoder, som f.eks. innbefatter: titrimetrisk bestemmelse av frie Hg<2+->ioner via difenyl- carbazonkompleks,

kolorimetrisk bestemmelse av rhodanidkomplekset av jern,

som dannes etter dissosiering av kvikksølvkompleksene etter utfeining av HgCl2(Skeggs, Clin. Chem. 10, 1964,

918f.; Schmidt, Zentralblatt Pharm. 124 (9), 1985, 527f), kolorimetrisk bestemmelse av kloranilinsyre fra det re-spektive kvikksølvsalt (Reuschler, Klin. Wochenschrift 40,

1962, 489),

bestemmelse av det fargede Cu<2+->klompleks av diethyldithio-carbaminsyre fra det fargeløse kvikksølvsalt (tysk off.-skrift nr. 2 137 146),

den temmelig vanlige TPTZ-metode (tripyridyl-s-triazin)

(R. Fried, Zeitschr. Klin. Chem., Klin. Bioch. 10, 1972,

s. 280f; tysk off.skrift nr. DE 215 3387), som på tilsvarende måte er basert på dannelse av et farget metallkom-pleks etter dissosiering av et kvikksølvkompleks.

En vesentlig ulempe ved disse metoder består i at de krever anvendelse av oppløsninger som inneholder meget giftige substanser. Enkelte av metodene er kompliserte og upresise (f.eks. titreringsmetoden). Mange av reagensene er ustabile, og kalibreringskurvene er ikke-lineære (f.eks. rhodanid-metoden). Noen av disse metoder krever dessuten en forbehandling for å eliminere forstyrrelser som følge av prøvens protein-innhold.

En forbedret TPTZ-metode er beskrevet i WO 83/002670, men bruk av giftige kvikksølvforbindelser er fortsatt en ulempe. Den eneste kolorimetriske metode hvor det ikke benyttes kvikksølvioner, er bestemmelsen av hexaklorkomplekser av Fe(III) i en perklorsyreoppløsning (F. Hoppe, Ther. Ggw. 110(4), 1971, 554f.; H. Mahner, Zeitschr. Klin. Chem., Klin. Biochem. 11(11), 1973, 451f.; W.T. Law, Clin. Chem. 26 (13) 1980, 1974fw-US patentskrift nr. 4 278 440). En betydelig begrensning av denne metode ligger i bruken av sterkt sure reagenser som er korrosive og derfor ikke er forlikelige med mekaniske pipettesystemer. En ytterligere ulempe består deri at bilirubin i prøvene forårsaker forstyrrelser.

Kalsium er ytterligere et eksempel på en elektrolytt som bestemmes rutinemessig i kliniske laboratorier. Konsentrasjonen av dette metallion i kroppsvæsker reguleres innenfor et smalt område. Patologiske høye eller lave konsentrasjoner kan medføre livstruende forstyrrelser som f.eks. utilstrekkelig nyrefunksjon, pancreatitis, tetania og kongestiv hjertesvikt.

En av de tidligste metoder for bestemmelse av kalsium er den beskrevet av Tisdall (J. Biol. Chem. 63, 461-465, 1925), ved hvilken kalsium utfelles med oxalsyre, som i sin tur bestemmes kolorimetrisk. Metoden involverer et sentrifuge-ringstrinn og er derfor meget tidkrevende. Den er ikke spesi-fikk for kalsium og er avhengig av en omhyggelig behandling av prøver. Metoden er i mange laboratorier blitt erstattet med titrimetriske og direkte kolorimetriske utførelser. Først-nevnte er også beheftet med den ulempe at utførelsen er kom-plisert og omstendelig og krever store prøvevolumer. I den sistnevnte utførelse påvirker kalsium fargen av et fargestoff, f.eks. orthocresolfthaleinkompleksion, som kan måles i et fotometer. På grunn av metodens enkelhet er den egnet for automatisering i kliniske laboratorier. Metoden involverer imidlertid bruk av aggressive, sterkt alkaliske oppløsninger og giftige substanser. Den er særlig utsatt for forstyrrelser fra en rekke serumkomponenter, f.eks. lipider, proteiner, fosfat og bilirubin og vil derfor ikke gi god overensstemmelse med referansemetoder basert på atomabsorpsjon og flammefotometri. En ytterligere ulempe ved den kolorimetriske utførelse ligger deri at kalibreringskurvene er ikke-lineære, og at fargen er sterkt avhengig av temperaturen.

I W.H. Outlaw og O.H. Lowry, Analytical Biochemistry 92, 370-374 (1979) beskrives det en enzymbefordret test for måling av kaliumioner i vev. Ved metoden benyttes pyruvat-kinase fra kaninmuskler, som aktiveres av kaliumioner og natriumioner, idet de førstnevnte er omtrent førti ganger mer effektive. På grunn av denne mangel på spesifisitet kan metoden være egnet for plantemateriale, hvor kaliumioner er de kationer som forekommer i overveiende mengde, men den er uegnet for målinger i kroppsvæsker som f.eks. serum, som inneholder tredve ganger så mange natriumioner som kalium-ioner. Derfor gir natriumioner uakseptable forstyrrelser ved bruk av den enzymatiske fotometriske teknikk som beskrives av Lowry et al., for måling av kalium i plasma eller serum. Et ytterligere problem består i at ammoniumioner gir en tilsvarende aktivering som kaliumioner. I den ovennevnte publikasjon tar man ikke for seg eller løser disse vesentlige problemer med hensyn til analyse av kaliumioner i biologiske fluider som f.eks. serum, og det foreslås der ingen metode for bestemmelse av natriumioner.

Det er derfor et siktemål med den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte og et reagens ved hjelp av hvilke de ovennevnte problemer kan unngås. I henhold til oppfinnelsen løses problemene ved hjelp av en fremgangsmåte for bestemmelse av ioner (analytter) i fluider hvor innvirkningen av disse ioner på aktiviteten av et enzym måles.

Med foreliggende oppfinnelse tilveiebringes det således en fremgangsmåte for bestemmelse av ioner i fluider, kjennetegnet ved at innvirkningen av disse ioner på aktiviteten av et enzym måles og et bindemiddel tilsettes for å maskere interfererende ioner.

Det tilveiebrignes også et materiale for bestemmelse av ioner i fluider, kjennetegnet ved at det omfatter et enzym hvis aktivitet påvirkes av ionet, og et bindemiddel som er til stede for å maskere interfererende ioner.

Videre tilveiebringes det blandinger for bestemmelse av kaliumioner, anvendt fortrinnsvis ved 37°C, kjennetegnet ved at de omfatter de forbindelser i de konsentrasjoner som er angitt i patentkravene 37-40. Det tilveiebringes også en blanding for bestemmelse av natriumioner, fortrinnsvis målt ved 37°C, kjennetegnet ved at den omfatter de forbindelser i de konsentrasjoner som er angitt i patentkrav 41.

Endelig tilveiebringes det en fremgangsmåte for måling av kalium- og natriumionekonsentrasjonen i samme kyvette, kjennetegnet ved at natriumionekonsentrasjonen analyseres ved bestemmelse av reaksjonshastigheten, pH-verdien i inkubasjonsblandingen senkes, og deretter måles kaliumionekon-sentrasj onen.

Et hovedtrekk ved denne oppfinnelse er bruken av selektive bindemidler for å bringe den frie konsentrasjon av analytten innenfor det optimale område for det analytiske enzym, spesielt når det ikke er praktisk å fortynne fluidet. Et ytterligere trekk ved oppfinnelsen består i å benytte konkurrerende inhibitorer for det relevante analytiske enzym for å redusere dets følsomhet for analytten, hvorved det blir mulig å måle sistnevnte i en høyere konsentrasjon. Dette er særlig nyttig f.eks. når selektive bindemidler ikke er lett tilgjengelige eller er uakseptabelt kostbare.

Et annet trekk ved oppfinnelsen består deri at selektive bindemidler benyttes for å redusere de frie konsentrasjoner av forstyrrende ioner til nivåer hvor forstyrrelsen ikke lenger er vesentlig. Det gjøres også bruk av den kjennsgjerning at en konkurrerende inhibitor kan konkurrere mer effektivt med forstyrrende ioner enn med analytten og derved øke enzymets følsomhet for analytten i forhold til det forstyrrende ion.

Et viktig trekk er valget av optimale reaksjonsbetin- geiser, deriblant valget av et egnet isoenzym, slik at de stimulerende eller inhiberende virkninger av analytten blir vesentlig sterkere enn for de forstyrrende ioner. Dessuten må virkningen av analytten og de forstyrrende ioner på aktiviteten av det analytiske enzym være additiv, slik at dersom konsentrasjonen av forstyrrende ioner er kjent, kan konsentrasjonen av analytten lett bestemmes ved subtraksjon. Når et forstyrrende ion vites å forekomme i en relativt konstant konsentrasjon i fluidet som skal analyseres, kan det tas hensyn til dette ved at det innlemmes en passende konsentrasjon av det forstyrrende ion i standardoppløsninger (kalibreringsopp-løsninger). En annen metode til å teste slike analytter går ut på å anvende en konkurrerende bindetest hvor analytten fortrenger et annet ion fra et bindemiddel, og virkningene av det frigjorte ion på aktiviteten av et egnet enzym bestemmes.

Disse generelle prinsipper kan best illustreres ved i detalj å vise deres anvendelse ved bestemmelse av kalium-, natrium-, kalsium-, klorid- og bicarbonationer i plasma eller serum. De er imidlertid anvendelige på et bredt utvalg ioner, f.eks. på kationer som f.eks. magnesium, mangan, lithium, bly, sink, kobber, jern eller andre tungmetaller. Eksempler på ikke-metalliske ioner som kan bestemmes, er protoner og ammonium. Også forbindelser som gir dannelse av ammonium, f.eks. urea, kan bestemmes.

Enzymer som kan benyttes, er f.eks. (H.J. Evans et al., Ann. Rev. Plant Physiol. 17, 47, 1966): Transferaser som f.eks. fosforholdige gruppeoverførende transferaser. En slik transferase kan f.eks. være pyruvat-kinase. I stedet for pyruvat-kinase kan andre kinaser, som f.eks. adenylatkinase eller hexokinase, som er følsomme for magnesiumioner eller manganioner, benyttes. En annen transferase er acetatkinase (fra E. coli). Et annet eksempel er pyridoxalkinase fra hjerner, hvilken er følsom for sinkioner.

Hvdrolaser så som glycosidaser, f.eks. a- eller 8-D-galactosidase (fra Escherichia coli), carboxypeptidase A (fra bukspyttkjertelen fra kveg), collagenase (fra Clostridium hystolicum), amylase (fra spytt eller bukspyttkjertel) eller fosfoglycollatfosfatase.

Også peptidhydrolaser slik som cystein- eller thio-avhengige proteinaser, hvor spesifikke eksempler er calpain I og II (også betegnet kalsiumaktivert nøytral protease) beskrevet av Sasaki et al. i J. Biol. Chem. 259, 12489-12494,

(1984). De sistnevnte enzymer kan isoleres og renses fra en rekke forskjellige animalske vevmaterialer, som f.eks. rot-telever og -nyre, røde blodlegemer fra mennesker og svin, kveghjerner og skjelettmuskler fra kaniner, i henhold til fremgangsmåten beskrevet av A. Kitahara et al., J. Biochem. 95, 1759-1766 (1984). Et ytterligere eksempel er dipeptidylaminopeptidase I (E.C. 3.4.14.1, Cathepsin C), J. Ken McDonald, Bioch. Biophys. Res. Communication 24(5), 66, 771f. En annen kilde for enzymene er proteiner erholdt ved genrekom-binasj onsteknikker.

Oxidoreductaser som f.eks. glyceroldehydrogenase (fra Entero-bacter aerogenes), acetaldehydrogenase (fra gjær) eller tyrosinase (catecholoxidase).

Lyaser som f.eks. aldolase (fra gjær) eller carbonisk anhydrase (fra røde blodlegemer fra kveg).

Andre egnede enzymer er diverse enzymer fra halogenofile organismer. En annen kilde for enzymene ér proteiner erholdt ved genrekombinasjonsteknikker.

Selektive bindemidler: Et bredt utvalg av bindemidler er tilgjengelig for binding av analytter eller forstyrrende ioner. Slike binde- eller maskeringssubstanser er cryptander, coronander, kronethere, podander, sfærander, hemisfærander, calixarener og kombinasjoner derav, naturlig forekommende ionoforer, f.eks. antibiotika, sykliske peptider som f.eks. valinomycin, kompleksoner og chelateringsmidler, f.eks. imino-dieddiksyre, EDTA, nitrotrieddiksyre og derivater derav. Slike forbindelser er beskrevet i Kontakte (Merck), 1977, nr. 1, s.

11 ff og s. 29 ff; Kontakte (Merck), 1977, nr. 2, s. 16 ff; Kontakte (Merck), 1977, nr. 3, s. 36 ff; "Phase Transfer Catalysts, Properties and Applications" (Merck-Schuchards) 1987, "Thermodynamic and Kinetic Data for Cation-Macrocycle Interaction"; R.M. Izatt et al., Chemical Reviews 85, 271-339

(1985); "Data for Biochemical Research", 1986, R.M.C. Dawson et al., 3. utgave, 399-415, Clarendon press, Oxford; F. Vogtle et al., "Chem. Macrocycles", Springer Verlag, New York, 1985; G.W. Gokel et al., "Macrocyclic Polyether Synthesis", Springer Verlag, New York, 1982; M. Hiraoka, "Crown Compounds", Else-vier, Amsterdam, Oxford, New York, 1982; J.M. Lehn et al., J.Am. Chem. Soc. 97, 6700-6707 (1975); G. Schwarzenbach et al., Helv.Chim. Acta 28, 828 (1945); S.F.A. Kettle, "Koordi-nat ionsverbindungen, Taschentext 3", Verlag Chemie, Wein-heim/Bergstr. 1972; A.E. Martell et al., "Die Chemie der Metallchelatverbindungen", Verlag Chemie, Weinheim/Bergstr. 1958; M. Becke-Goehring et al., "Komplexchemie", Springer Verlag, 1970; F. Kober, "Grundlagen der Komplexchemie", Otto Salle Verlag, Frankfurt/Main 1979; G. Schwarzenbach et al., Helv.Chim.Acta 31, 1029 (1948); R.G. Pearson et al., Science 151, 172 (1966). Eksempler på chelateringsmidler som er i stand til å binde flerverdige ioner, spesielt toverdige kationer, er ethylenglycol-bis-(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraeddiksyre (betegnet EGTA) og (ethylendinitrilo)-tetraeddiksyre (EDTA). Skjønt det finnes mange bindemidler som kan binde flerverdige ioner, f.eks. EDTA og dets derivater, er midler som binder énverdige ioner, mindre vanlige. Tetrafenylbor binder kaliumioner. En gruppe forbindelser med større mulighe-ter er imidlertid cryptander, som er eksempler på reagenser som kan binde énverdige kationer selektivt i vandige oppløs-ninger. (R.M. Izatt et al., Chem. Reviews 85, 271-339). Spesielle eksempler på cryptander er "Kryptofix"-forbindelsene fra Merck-Schuchardt, f.eks.: 4, 7,13,16,21-pentaoxa-l,10-diazabicyclo-[8.8.5]-tricosan, "Kryptofix" 221, side 438, Merck-Schuchardt-katalogen for 1987/88, nr. 810646 (K 221).

4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabicyclo-[8.8.8]-hexacosan, "Kryptofix" 222, side 438, Merck-Schuchardt-katalogen for 1987/88, nr. 810647 (K 222).

Som maskeringsforbindelser for eliminering av for styrrende anioner kan de følgende klasser av substanser even-tuelt benyttes: anioncryptander, heterocyclofaner, catapinander og uorganiske metallkoarplekser eller uoppløselige salter. Spesielle eksempler på forbindelser som danner komplekser med anioner, er beskrevet i litteraturen, f.eks. azamono- eller azapolycykler, makrocykliske kvartære tetrahedronforbindelser, makrocykliske bis-metallkomplekser, makrocykler med kovalent innlemmende Lewis-syresentere, protonerte eller alkylerte kvartære cryptander eller catapinander (F.P. Schmidtchen, Nachrichten Chem. Techn. lab. 36(1), 1988, S. 8f; E. Graf, J. Amer. Chem. Soc. 98 (20), 1976, 6403f; C.H. Park, J. Amer. Chem. Soc. 90 (9), 1968, 2431f) samt f.eks. hexaklorkomplekset av Fe(III) eller sølvnitrat.

Bindemidlenes funksjon: Disse bindemidler anvendes for de følgende formål:

1. For selektiv binding av forstyrrende ioner.

2. For å redusere konsentrasjonen av analyttene til optimale konsentrasjoner for måling, dersom fortynning av prøven ikke kan foretas. 3. I en utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er bindemidlet til stede og danner et kompleks med 11 indikator "-ioner, hvorfra indikatorionene fortrenges støkiometrisk av analyttionene, og hvor innvirkningen av de fortrengte indikatorioner på aktiviteten av enzymet bestemmes, hvorved det fås et indirekte mål på konsentrasjonen av analyttioner. Ved denne fremgangsmåte er f.eks. enzymet pyruvat-kinase, mens indikatorionene er kalium, bindemidlet er "Kryptofix" 221 og ionet som skal bestemmes er natrium;

eller enzymet er en kinase, mens indikatorionet erMg<2+>, bindemidlet er et chelateringsmiddel, f.eks. EDTA, og ionet er et metall; eller enzymet er pyridoxalkinase, indikatorionet er Zn<2*>, bindemidlet er "Kryptofix" 221 og ionet er et tungmetall; eller enzymet er a-amylase, mens bindemidlet er Ag eller Hg

og ionet som skal bestemmes, er klorid; eller enzymet er collagenase, mens bindemidlet er et chelateringsmiddel som f.eks. EDTA, og ionet som skal bestemmes, er kalsium.

Fluider for analyse: De biologiske fluider i hvilke bestemmelsen av analytter foretas, er blod, serum, plasma, svette, transudater eller exudater eller f.eks. urin. Andre eksempler på fluider er vann fra vann-nettet eller ekstrakter av næring-smidler eller frukt eller gjærede væsker, som f.eks. vin.

Bestemmelse av kalium- og natriumioner.

De viktigste krav som stilles til en tilfredsstillende fremgangsmåte for bestemmelse av kaliumioner i serum eller plasma, på basis av følsomheten av pyruvat-kinase for kaliumioner, er kravene om å overvinne forstyrrelsene som forårsakes av natrium- og ammoniumioner. I henhold til de generelle prinsipper som oppfinnelsen er basert på, kan dette oppnås ved hjelp av én eller flere av de følgende utførelser: 1. Selektiv binding av natriumioner med et egnet bindemiddel, f.eks. "Kryptofix" 221. 2. Valg av Bacillus stearothermophilus istedenfor kaninmuskler som kilde for pyruvat-kinase, fordi det bakterielle enzym har en følsomhet for kaliumioner i forhold til natriumioner som er dobbelt så stor som for enzymet fra muskler. 3.Innlemmelse av ioner som er konkurrerende inhibitorer for det følsomme indikatorenzym i testen, f.eks. bruk av lithiumioner som konkurrerer med natriumioner og kaliumioner.

4. Enzymatisk fjerning av ammoniumioner.

Da lithiumioner er mindre effektive som konkurrent til kaliumioner, blir den netto virkning å øke den relative følsomhet av pyruvat-kinase overfor kaliumioner med ytterligere 50%, sammenlignet med natriumioner. I nærvær av lithiumioner blir dessuten virkningene av kalium- og natriumioner på aktiviteten av pyruvat-kinase additiv istedenfor kooperativ. Dette muliggjør måling av konsentrasjonen av enten kalium-eller natriumioner, forutsatt at konsentrasjonen av de andre ioner er kjent.

Ved bruk av utførelser 2 og 3 i fravær av bindemiddel er det mulig å oppnå en relativ følsomhet av pyruvat-kinase for kaliumioner, sammenlignet med natriumioner, av størrel-sesordenen 100:1. Dette innebærer at selv ved ekstremt unor-male natriumionekonsentrasjoner på enten 110 mmol/1 eller 170 mmol/1, vil feilen i den målte kaliumionekonsentrasjon ikke overskride 0,3 mmol/1, sammenlignet med en normal natrium-ionekonsentras j on i plasma på 140 mmol/1 (eksempel A). Dette anses ikke som tilstrekkelig nøyaktig for mange kliniske formål. Dersom imidlertid den virkelige konsentrasjon av natriumioner i plasmaet er kjent, er det mulig å foreta nøyak-tig måling av mengden av kaliumioner ned til ± 0,05 mmol/1 (eksempel B). Dersom utførelser 1-3 kombineres og det innlemmes et bindemiddel, f.eks. "Kryptofix" 221, kan den relative følsomhet av pyruvat-kinase for kaliumioner, sammenlignet med natriumioner, økes til >500:1. Under disse omstendigheter er det ikke nødvendig å kjenne natriumionekonsentrasjonen for å bestemme kaliumionekonsentrasjonen i plasmaet ned til 0,05 mmol/1 (eksempel C).

Disse fremgangsmåter for bestemmelse av konsentrasjonen av kaliumioner viser anvendeligheten av de generelle prinsipper som oppfinnelsen er basert på, med hensyn til å redusere forekomsten av forstyrrelser. På den annen side illustrerer måling av natriumioner i serum eller plasma best anvendelsen av disse prinsipper med hensyn til å regulere den effektive analyttkonsentrasjon. En måte å måle natriumioner på i henhold til oppfinnelsen er å benytte et enzym som er føl-somt for natriumioner. Et eksempel på et slikt enzym er 6-galactosidase (Kuby et al., J. Am. Chem. Soc. 75, 890, 1953). Imidlertid er området for natriumionekonsentrasjoner hvor dette enzym er mest følsomt, meget lavere enn det man hensiktsmessig kan oppnå i en plasmaprøve, uten at det foretas et fortynningstrinn•

I overensstemmelse med de prinsipper som oppfinnelsen er basert på, benyttes følgende utførelser for å redusere den effektive natriumionekonsentrasjon til optimale nivåer når fortynning av prøven ikke kan foretas. 1. Bruk av et bindemiddel for natriumioner, som f.eks. "Kryptofix" 221. 2. Bruk av lithiumioner som en konkurrerende inhibitor for B-galactosidase, hvorved enzymets følsomhet for natriumioner nedsettes. 3. En kombinasjon av utførelser 1 og 2 gjør det lett å bestemme mengden av natriumioner i plasma eller serum ved bruk av B-galactosidase, og mengden av bindemiddel kan manipuleres slik at signalet for natriumione-konsentras joner under 110 mmol/1 minimeres, mens

signalet i det vanlige analyseområde (110-170 mmol/1) forbedres (eksempel D).

Natriumioner kan også måles ved hjelp av pyruvatkinase, forutsatt at det velges betingelser hvorunder stimule-ringen av enzymaktiviteten ved hjelp av kaliumioner reduseres, og at et bindemiddel for kaliumioner, f.eks. "Kryptofix" 222, innlemmes i reaksjonsblandingen (eksempel E).

Ved en annen fremgangsmåte for bestemmelse av nat-riumionekonsentras j onen i plasma tillates natriumionene å fortrenge kaliumioner fra "Kryptofix" 221, idet de frigjorte kaliumioner stimulerer aktiviteten av pyruvat-kinase proporsjonalt med natriumionekonsentrasjonen i plasmaet (eksempel

F).

Andre aspekter av oppfinnelsen er materialer og blandinger for bestemmelse av ioner i biologiske og ikke-biologiske fluider.

Blandingen ifølge foreliggende oppfinnelse kan være

til stede i oppløst eller i tørr form. Den kan være til stede impregnert på en egnet bærer. Et diagnostisk middel i form av en teststrimmel kan fremstilles ved impregnering av et bærer-

materiale, fortrinnsvis filterpapir, celluloseull eller ull av syntetiske fibere, med oppløsninger av de nødvendige reagenser som det er konvensjonelt å benytte for fremstilling av test-strimler, i lettflyktige oppløsningsmidler, som f.eks. aceton. Dette kan utføres i ett eller flere impregneringstrinn. De ferdige testpapirer kan anvendes som sådanne eller festes på i og for seg kjent måte til håndtak eller fortrinnsvis festes mellom syntetiske harpikser og finmaskede duker.

Bestemmelse av kaliumioner.

Ved bestemmelsen av kaliumioner blir et fluid, f.eks. blodplasma, inkubert med en puffret blanding inneholdende adenosindifosfat (ADP), fosfoenolpyruvat (PEP), redusert nicotinamidadenin-dinucleotid (NADH), pyruvat-kinase (PK) og lactatdehydrogenase (LDH). Dannelsen av pyruvat, og deretter av lactat, i denne blanding, ved reaksjoner katalysert av PK og LDH, er fullt og helt avhengig av tilstedeværelsen av egnede kationer, i fravær av hvilke PK er praktisk talt inak-tiv. NADH absorberer sterkt ved 340 nm, mens NAD ikke gjør det.

Under de valgte analysebetingelser som innbefatter tilstedeværelse av manganioner, hvilke kreves av den bakterielle PK, er hastigheten av oxydasjon av NADH proporsjonal med konsentrasjonen av kaliumioner (se eksempler A-C).

Under disse betingelser finner følgende reaksjoner sted:

Hastigheten av reaksjon (1) bestemmes av konsentrasjonen av kaliumioner som er til stede i systemet, og denne begrenser i sin tur hastigheten av reaksjon (2). Hastighetene av disse reaksjoner kan måles på flere måter. En standard-metode er spektrofotometrisk måling av den hastighet NADH forsvinner med ved reaksj on (2). NADH absorberer sterkt ved 340 nm, mens NAD ikke gjør det. Følgelig gir reaksjonsblandin-gens fall i absorpsjonsevne ved 340 nm (eller en alternativ bølgelengde) et direkte mål på reaksjonshastigheten, og av dette kan konsentrasjonen av kaliumioner som er til stede i blandingen, avledes. Alternativt kan det trekkes fordel av den kjennsgjerning at både reaksjon (1) og reaksjon (2) forbruker H+, hvorved protonkonsentrasjonen i reaksjonsblandingen nedsettes. Hastigheten med hvilken protonkonsentrasjonen synker, kan måles med et pH-meter eller ved hjelp av titrering. I disse sistnevnte tilfeller vil den benyttede konsentrasjon av buffer være meget mindre enn ved den spektrofotometriske metode. Også annet utstyr, såsom fluorimetere eller luminometere, kan benyttes for å overvåke aktiviteten av pyruvat-kinase.

Det finnes flere andre metoder for å påvise akkumu-lering av pyruvat som er forbundet med PK-aktivitet. Disse innbefatter enhver metode for bestemmelse av det uorganiske fosfat eller oxygen som forbrukes, eller hydrogenperoxyd; acetylfosfat eller carbondioxyd dannet ved enzymatisk virkning av pyruvat-oxidase; dannelse av hydrazon med 2,4-dinitrofenyl-hydrazin; bestemmelse av reaktantene eller produktene ved enzymatisk virkning av pyruvat-carboxylase; pyruvat-decar-boxylase eller pyruvat-dehydrogenase; bruk av flavin-koblede systemer; og isotopiske metoder for bestemmelse av ørsmå konsentrasjoner av substrater (M.N. Berry et al., Analytical Biochem. 118, 344-352 (1981)).

I en undersøkelse av 200 serumprøver ble det oppnådd god overensstemmelse med andre metoder, såsom ved flammefoto-metriske målinger og ved målinger med ioneselektive elektroder. En betydelig forstyrrelse ved metoden skyldes ammoniumioner, som vanligvis er til stede i serum, eller som akkumule-res ved henstand. Muligheten for ammoniumioneforstyrrelse kan unngås fullstendig ved at a-ketoglutarat (KG) og glutamatde-hydrogenase (GDH) innlemmes i reaksjonsblandingen. Ammoniumioner fjernes i et preinkuberingstrinn i henhold til reaksjonen:

I oppløsninger som f.eks. urin, hvor ammoniumioneinn-holdet kan være høyt, kan det benyttes en koblet reaksjon:

Ved den koblede metode benyttes glucose-6-fosfat-dehydrogenase. Forutsatt at den tilsatte glucose-6-P og -KG anvendes i overskudd i forhold til mengden av tilstedeværende ammoniumioner, vil samtlige ammoniumioner bli fjernet, mens NADH bibeholdes i reagenset.

Typiske konsentrasjonsområder for hovedreagensene ved enzymatisk bestemmelse av kaliumioner ved 37°C under anvendelse av en 10 ul prøve av plasma eller serum er:

Et annet eksempel som er følsomt overfor kaliumioner, er glycerol-dehydrogenase (E.C.C. Lin et al., B 235, 1820, 1960). Typiske konsentrasjonsområder for hovedreagensene ved enzymatisk bestemmelse av kaliumioner ved 37°C under anvendelse av glycerol-dehydrogenase er:

Et annet eksempel som er følsomt overfor kaliumioner, er acetaldehyd-dehydrogenase (S. Black, Arch. Biochem. Bio phys. 34, 86, 1951). Typiske konsentrasjonsområder for hovedreagensene ved enzymatisk bestemmelse av kaliumioner ved 37°C under anvendelse av acetaldehyd-dehydrogenase er:

Acetaldehyd (fra 0,02 mmol/1 til 1 mmol/1) kan anvendes istedenfor glycolaldehyd.

Acetaldehyd-dehydrogenase oppviser også esterase-aktivitet, slik at kaliumionekonsentrasjonen kan bestemmes ved overvåking av frigjøringen av 4-nitrofenol fra 4-nitrofenyl-acetat. Typiske konsentrasjonsområder for hovedreagensene ved enzymatisk bestemmelse av kaliumioner ved 37"C på basis av esteraseaktiviteten av acetaldehyd-dehydrogenase er:

Bestemmelse av natriumioner

I prinsippet er bestemmelsen av natriumioner under anvendelse av PK likeartet med bestemmelsen av kaliumioner. Imidlertid gjør det seg gjeldene visse viktige ulikheter. For det første er PK omtrent 40-100 ganger mer følsom for kalium-ioner enn for natriumioner, avhengig av inkuberingsbetingel-sene, som ovenfor angitt. Selv om natriumioner forekommer i plasmaet i en konsentrasjon som er omtrent 30 ganger høyere enn konsentrasjonen av kaliumioner, kan derfor de sistnevnte forstyrre natriumionemålingen.

I henhold til de generelle prinsipper som utnyttes i henhold til oppfinnelsen, blir lithiumioner utelatt, mens PK fra kaninmuskler foretrekkes fremfor det bakterielle enzym, og magnesiumioner kan anvendes istedenfor mangan. I henhold til én fremgangsmåte bindes kaliumionene spesifikt til "Kryptofix" 222, og virkningene av natriumioner på PK-aktiviteten måles direkte (eksempel E).

Typiske konsentrasjonsområder for hovedreagensene ved enzymatisk bestemmelse av natriumioner ved 37°C under anvendelse av en pyruvat-kinase er:

I henhold til en annen fremgangsmåte tillates natriumionene å fortrenge kaliumioner fra "Kryptofix" 221, idet de frigjorte kaliumioner stimulerer aktiviteten av PK i en grad som er avhengig av natriumionekonsentrasjonen (eksempel

F).

Typiske konsentrasjonsområder for hovedreagensene ved enzymatisk bestemmelse av natriumioner ved 37 °C under anvendelse av pyruvat-kinase for måling av fortreningen av kalium-ioner fra "Kryptofix" 221 er:

I en mer nøyaktig og presis utførelse av bestemmelsen benyttes et natriumioneavhengig enzym som f.eks. B-galactosidase (eksempel D).

Blodplasma inkuberes med en puffret blanding inneholdende 2-nitrofenyl-B-D-galactopyranosid (NPG) og enzymet B-D-galactosidase. Den av B-D-galactosidase katalyserte reaksjon er avhengig av tilstedeværelse av natriumioner, og aktivitets-hastigheten er et mål på natriumionekonsentrasjonen. Et viktig trekk ved denne metode er bruken av en egnet mengde natrium-ioneselektivt bindemiddel (f.eks. "Kryptofix" 221) for målinger i serum eller andre biologiske fluider hvor natriumione-konsentras j onen kan overskride 100 mmol/1, for å redusere natriumioner, slik at enzymet blir mest mulig følsomt for små endringer i natriumionekonsentrasjonen i det vanlige analyseområde (110-170 mmol/1). Under de valgte analysebetingelser, som innbefatter tilstedeværelse av magnesium- og lithiumioner i moderate konsentrasjoner, er graden av dannelse av 2-nit<*>ro-fenol og galactose praktisk talt porporsjonal med konsentrasjonen av natriumioner som måles. Magnesiumioner er nødvendige for å oppnå optimal B-galactosidaseaktivitet. Lithiumioner konkurrerer med natriumioner og øker derfor enzymets K,,, for natriumioner.

Som substrat for B-D-galactosidase er også mange andre forbindelser egnede. Generelt blir den galactosidase-holdige prøve blandet med et egnet B-D-galactosidase-substrat, hvoretter substratet splittes av enzymet, og ett av fisjons-produktene deretter bestemmes på en passende måte. Man kan måle enten glycon som frigjøres ved innvirkningen av enzymet, eller aglycon. Som regel bestemmes det sistnevnte. Som substrat kan det naturlig forekommende substrat lactose benyttes, men det er særlig fordelaktig å benytte et kromogent galactosid. I Biochem. Z., 333, 209 (1960) beskrives således fenyl-6-D-galactosid samt visse andre derivater som er substituert på den aromatiske ring, f.eks. 2-nitrofenyl-B-D-galactosid (NPG) og 3-nitrofenyl-B-D-galactosid, som substrater for B-D-galactosidase. Fenolene som frigjøres ved hydrolyse, bestemmes fotometrisk i UV-området eller - hva nitrofenolene angår - i det kortbølgede, synlige bølgelengdeområde. En oxydativ kob-ling med aminoantipyrin kan også følge som en indikatorreak-sjon (se Analytical Biochem. 40, 281, 1971. Andre substrater er beskrevet i tysk off.skrift nr. 33 45 748 og tysk off.-skrift nr. 34 11 574.

Typiske konsentrasjonsområder for hovedreagensene ved enzymatisk bestemmelse av natriumioner ved 37°C under anvendelse av en 10 ul prøve av plasma eller serum er:

EGTA står for ethylen-bis-(oxyethylennitrilo)-tetra-eddiksyre. Det vil også være mulig å utføre analysen av natrium- og kaliumioner enzymatisk i den samme kyvette i form av en tvillingtest (se eksempel G).

Bestemmelse av kalsiumioner

For bestemmelse av kalsiumioner inkuberes en prøve av blodplasma (eller annet kroppsfluid) med en buffret blanding inneholdende peptidsubstratet succinyl-leucin-methionin-p- av Calpain I, er avhengig av tilstedeværelse av kalsiumioner, og graden av aktivitet er et mål på kalsiumionekonsentrasjonen. Et viktig trekk ved metoden er bruken av chelateringsmidler som er i stand til å binde kalsiumioner spesifikt for å nedsette deres konsentrasjon til et område hvor enzymet er mest følsomt. Under de valgte analysebetingelser, som innbefatter tilstedeværelse av L-cystein og 2-mercaptoethanol, er graden av dannelse av p-nitroanilin praktisk talt proporsjonal med den konsentrasjon av kalsium som måles.

Foretrukne peptidsubstrater kan beskrives ved den generelle formel:

hvor R betegner acetyl, benzoyl, carbobenzoxy, succinyl, tert-butoxycarbonyl eller 3-(2-furyl)-acryloyl; Pn- P2- P1betegner en peptidkjede med minst to rester, med preferanse for Tyr, Met, Lys eller Arg i Pj-stillingen og en Leu- eller Val-rest i P2-stillingen, og X betegner en chromogen eller fluorogen gruppe som frigjøres ved innvirkning av enzymet under dannelse av en påviselig fargeendring eller fluorescens. X kan være en nitrofenyl-, nafthyl- eller thiobenzylester og likeledes en nitroanilin-, nafthylamin- eller methylcumaringruppe, med eller uten ytterligere substituenter på den aromatiske ring. Noen egnede peptidderivater er også blitt beskrevet av T. Sasaki et al. i J. Biol. Chem. 259, 12489-12494. Eksempler på slike er succinyl-Leu-Met-MCA (MCA = 4-methylcumarin-7-amid), succinyl-Leu-Tyr- MCA, succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA og tert-butoxycarbonyl-Val-Leu-Lys-MCA. Andre syntetiske substrater er beskrevet i Bergmeyer, "Methods of Enzymatic Analysis", 3. utgave, Vol. 5, s. 84-85, 1984.

Konsentrasjonsområdene for forbindelsene for en slik bestemmelsesmetode og reagensene er:

Stjernen<*>betyr at enheten er definert som den mengde enzym som øker absorpsjonsevnen ved 750 nm med 1,0 etter 30 minutters inkubering ved 30°C med casein som substrat (N. Yoshimura et al., J. Biol. Chem. 258, 8883-8889, (1983).

En hvilken som helst buffer med en pK i det nødven-dige pH-område og med ubetydelig bindekapasitet for kalsium kan benyttes ved testen. Mange av buffrene av Good-typen (N.E. Good et al., Biochem. 5, 467-477 (1966)), som f.eks. Tris, HEPES, MOPSO, BES, TES og imidazol, oppfyller disse krav (se eksempel H). Collagenase kan anvendes i stedet for Calpain I og kan testes fluorometrisk ved pH 6,5-7,5 med L-isoleucyl-L-analylglycylethylester, 0,02 mmol/1-0,2 mmol/1.

Bestemmelse av kloridioner

For bestemmelse av klorid i blod blir plasma inkubert med en buffret blanding inneholdende 0,01 mol/l cysteamin,

4 mmol/1 Gly-Phe-p-nitroanilid og 0,02 U/ml Cathepsin C. Dannelsen av p-nitroanilin er helt avhengig av tilstedeværelse av kloridanioner. Selektive bindemidler kan tilsettes i tillegg for å eliminere forstyrrelser forårsaket av bromidioner eller for å nedsette aktiviteten av kloridioner, slik.at konsentrasjonen av disse innstilles på det optimale område for enzymet. Under de valgte analysebetingelser (se eksempel 5) er graden av dannelse av p-nitroanilin:

proporsjonal med konsentrasjonen av kloridioner i prøven. I dette eksempel bestemmes reaksjonshastigheten ved å måle

økningen i absorpsjonen ved 405 nm.

Konsentrasjonsområdene for forbindelsene ved en slik bestemmelsesmetode:

En hvilken som helst buffer som har en pK i det nødvendige pH-område og en ubetydelig kloridkonsentrasjon, kan benyttes ved testen. Eksempler på enzymer av alle de ovenfor angitte kategorier (transferaser, hydrolaser, oxidoreductaser og lyaser) er i litteraturen vist å være kloridavhengige, spesielt dersom disse enzymer stammer fra halogenofile organismer. Kloridavhengigheten av enzymer av peptidasetypen er blitt inngående beskrevet. Eksempler er dipeptidylpeptidase I (Cathepsin C), EC 3.4.14.1 (J. Ken Mc Donald, Bioch. Bioph. Res. Communication, 24 (5) 1966, 771f) og dipeptidylpeptidase III EC. 3.4.14.3 (J. Ken Mc Donald, Journal of Biol. Chem. 241 (7) 1966, 1494f), som begge katalyserer hydrolyse av oligopep-tidderivater fra aminoendegruppen. Et annet eksempel er det angiotensinomdannende enzym EC 3.4.15.1 som er en dipeptidyl-carboxypeptidase som katalyserer hydrolytisk frigjøring av dipeptider fra carboxylendegruppen i et bredt spektrum av oligopeptider (P. Bunning et al., Bioch. 26, 1987, 3374f; R. Shapiro et al., Bioch. 22, 1983, 3850f).

I stedet for Gly-Arg-p-nitroanilid kan forskjellige andre dipeptid- eller oligopeptidsubstrater benyttes. Foretrukne peptidsubstrater kan beskrives ved den generelle formel :

For dipeptidylpeptidaseenzymene er R hydrogen, mens Pn- Pxbetegner en peptidkjede med minst to rester. X betegner en chromogen eller fluorogen gruppe som frigjøres ved innvirkning av enzymet under dannelse av en påvisbar fargeendring eller fluorescens. X kan være en nitrofenyl-, nafthyl- eller thiobenzylester og likeledes en nitroanilin-, nafthylamin- eller methylcumaringruppe, med eller uten ytterligere substituenter på den aromatiske ring. For dipeptidylcarboxypeptidaseenzymer betegner X peptidkjedens aminoendegruppe, mens R er en chromogen eller fluorogen gruppe som frigjøres under innvirkning av enzymet. R kan være en N-2-furanacryloyl- eller benzoylgruppe, med eller uten ytterligere substituenter (se eksempel I).

Som et ytterligere eksempel på enzymatisk bestemmelse av kloridioner (eksempel J) inkuberes plasma med en puffret blanding inneholdende 4,6-0-benzyliden-a-4-nitrofenyl-a-a-D-maltoheptaoksid(4,6-ethyliden-G7PNP) (5 mmol/1), a-amylase (0,60 U/ml) og a-glucosidase (= 30 U/ml). Dannelsen av p-nitrofenol er fullstendig avhengig av tilstedeværelse av kloridanioner, og det benyttes også her enten forhåndsfortynning, små prøvevolumer eller selektive bindemidler for å innstille kloridionekonsentrasjonen innenfor det optimale område for enzymet. Testprinsippet er sammenfattet nedenfor, og graden av forekomst av reaksjonen bestemmes ved måling av økningen i absorpsjon ved 405 nm. 2 ethyliden-G5+ 2 G2PNP + 2 ethyliden-G4+ 2 G3PNP + ethyliden-G3+ G4PNP

Konsentrasjonsområdene for forbindelsene benyttet ved denne bestemmelse er:

De variasjoner av testen som det er redegjort ovenfor

i forbindelse med Cathepsin C (eksempel I), gjelder også for eksempel J.

Bestemmelse av tungmetallioner

Disse metaller binder seg sterkt til cryptander som f.eks. "Kryptofix" 221 og "Kryptofix" 222. De vil derfor fortrenge andre metaller som er løsere bundet. Et eksempel på

et metallion som lett fortrenges, er sink. Sinkioner er til stede i meget små konsentrasjoner i plasma. Det er derfor hensiktsmessig å tilsette sinkioner som er kompleksbundet til K 221, til en puffret serumblanding. Dersom et tungmetall er

til stede, vil sinkionene frigjøres, og deres tilstedeværelse kan påvises ved stimulering av pyridoxalkinase (fra saue-hjerner), et enzym som er sterkt følsomt for sinkioner. Også mange andre lignende, konkurrerende bindetester er anvendelige.

Bestemmelse av bicarbonationer

Bicarbonationer kan bestemmes under anvendelse av en variant av prinsippene som utnyttes i henhold til oppfinnelsen. Mange ligander, f.eks. cryptandene, er pH-følsomme, og denne egenskap kan utnyttes for å bestemme bicarbonat. I hovedsak trekkes det fordel av bicarbonationenes evne til å nøytralisere protoner. Det kan vises at pH-verdien for en meget svakt bufret serumprøve, til hvilken det er blitt til-satt saltsyre, vil variere som en funksjon av bicarbonatkon-sentrasjonen. Den endelige pH bestemmes ved mengden av frie natriumioner (påvist med B-galactosidase) som er til stede, i nærvær av et pH-følsomt ionebindemiddel som f.eks. "Kryptofix" 221, og denne er en funksjon av den opprinnelige bicarbonat-konsentrasjon. I hovedsak surgjøres serum til pH ca. 4,5 med et like stort volum HC1 (75 mmol/1) for å overføre alt bicarbonat til hydroxylioner, og deretter foretas omsetning med et testsystem ved pH 7,5-7,8 under anvendelse av en fortynnet Tris-buffer (5 mmol/1) som innfører et ioneselektivt enzym,

som f.eks. B-galactosidase, og et egnet pH-følsomt ionebindemiddel. Natriumionekonsentrasjonen i prøven må være kjent for at det skal kunne oppnås nøyaktige resultater, fordi en

korreksjon er nødvendig på grunnlag av mengden av natriumioner i prøven. Metoden er vesentlig mindre følsom enn utførelser hvor det benyttes chromogene indikatorer som pH-detektorer (eksempel K).

Typiske konsentrasjonsområder for hovedreagensene ved enzymatisk bestemmelse av bicarbonationer ved 37°C under anvendelse av en 10 ul prøve av plasma eller serum er:

Behovet for å korrigere for natriumionekonsentrasjonen kan unngås ved bruk av et enzym (f.eks. pyridoxalkinase) som er følsomt for spormetaller (f.eks. sinkioner) som normalt er til stede i plasma i mikromolar konsentrasjon. Forutsatt at bindingen av spormetallet til dets bindemiddel er pH-følsom og oppviser en tilsvarende affinitet som den natriumioner har for "Kryptofix" 221, kan bicarbonationer måles ved at sinkionene innlemmes i reaksjonsblandingen i konsentrasjoner i et tilstrekkelig stort overskudd i forhold til dem som kan påtreffes i plasma. Følgelig vil endogene sinkioner ikke virke forstyrrende.

Fremgangsmåtene som er beskrevet ovenfor, er enkle, meget hurtige, nøyaktige og presise og kan utføres med billig apparatur. Risikoen i laboratorier forbundet med antennbare gasser, kan unngås, og likeledes mange problemer forbundet med ioneselektive elektroder. Fremgangsmåten kan tilpasses for anvendelse av stort utstyr for utførelse av et stort antall analyser, men den kan også anvendes ved bruk av billigere instrumenter for nødbruk nær sengekanten. Det er enkelt å pakke inn utstyret som trenges for utførelse av fremgangsmåten, som et utstyrssett. Dessuten kan bestemmelsen av kalium- og natriumionekonsentrasjonene utføres etter hverandre i samme kyvette (eksempel G). Fremgangsmåten vil også være anvendelig på legekontor ved bruk av en tørrkjemikaliemaskin. Skjønt disse fremgangsmåter er utviklet under anvendelse av automatiske spektrometere, kan de lett tilpasses automatisert eller manuelt laboratorieutstyr, som f.eks. fluorimetere, luminometere og isotoptellere.

I de følgende eksempler blir et lite prøvevolum

(10 ul, med mindre annet er angitt, i de tilfeller hvor det dreier seg om serum eller plasma) blandet med et reagens 1, inneholdende puffret substrat og visse kofaktorer, og det foretas inkubering i en gitt tid, vanligvis i 0,1-5 min. Avlesning av absorpsjonsevnen foretas normalt med jevne mellomrom under denne inkuberingsperiode. Et reagens 2, inneholdende indikatorenzymet, tilsettes deretter, og reaksjonshastigheten overvåkes. I enkelte eksempler inneholder Reagens 1 indikatorenzymet, mens Reagens 2 inneholder det passende substrat. Eksemplene viser den ferdige reaksjonsblanding etter at prøven, Reagens 1 og Reagens 2 er blitt blandet sammen.

Eksempel A (Sammenligningseksempel)

Måling av kaliumionekonsentrasjonen ved bruk av pyruvat-kinase uten noe bindemiddel for natriumioner; ukjent natriumionekon-sentras jon

Den endelige inkuberingsblanding inneholder:

Kaliumionestandardoppløsninger (kalibreringsopp-løsninger) inneholder 140 mmol/1 natriumioner for å kompensere for den stimulerende virkning av natriumioner som er til stede

i plasma, på pyruvatkinase.

Eksempel B (Sammenligningseksempel)

Måling av kaliumionekonsentrasjonen ved bruk av pyruvatkinase, uten noe bindemiddel for natriumioner; kjent natriumionekon-sentras j on

Inkuberingsblandingen og kalibreringsoppløsningen er som for eksempel A.

Det kan foretas en korreksjon for natriumionekon-sentras j onen i blandingen ved at man tilsetter (eller subtra-herer) 0,1 mmol/1 kalium for hver 10 mmol/1 som natriumione-konsentras j onen ligger under (eller over) 140 mmol/1 natriumioner. Imidlertid bør denne korreksjon verifiseres ved analyse av vandige oppløsninger med kjente natrium- og kaliumkonsen-trasjoner.

Eksempel C

Måling av kaliumionekonsentrasjonen ved bruk av pyruvatkinase, i nærvær av et bindemiddel for natriumioner.

Utføres som eksempel B, men humanserumalbumin utelates, og mediet inneholder i tillegg 6 umol "Kryptofix" 221 pr. test. Det velges en pH på 7,8 for å minimere variasjonene i fortrengningen av natriumioner fra "Kryptofix" 221 som følge av ulikheter i kaliumioneinnholdet i de enkelte prøver.

Eksempel D

Måling av natriumionekonsentrasjonen ved bruk av B-D-galactosidase

Variant a: Den ferdige inkuberingsblanding inneholder:

Reaksjonen overvåkes ved bølgelengde 420 nm (eller ved en bølgelengde nær denne) for å bestemme graden av dannelse av fri 2-nitrofenol og følgelig konsentrasjonen av natriumioner i den opprinnelige prøve.

Variant b: En alternativ tilnærmelse sammenlignet med Variant a ville være å redusere prøvens konsentrasjon ti ganger ved forhåndsfortynning eller å benytte et lite prøvevolum, i hvilket tilfelle cryptanden ville kunne utelates.

Variant c: Måling i fluider med lavt natriumioneinnhold (f.eks. < 20 mmol/1), i hvilket tilfelle cryptanden vil kunne utelates.

Eksempel E

Måling av konsentrasjonen av natriumioner med pyruvatkinase (direkte stimulering av enzymaktiviteten med natriumioner under betingelser hvor følsomheten av kaliumioner nedsettes)

Inkuberingsblandingen inneholder for en 10 ul plas-maprøve:

^3

Natriumionekalibreringsoppløsninger inneholder 4 mmol/1 kalium for å kompensere for kaliumets aktiverende virkning åv serum-kalium-ioner på pyruvatkinase.

Eksempel F

Måling av konsentrasjonen av natriumioner med pyruvatkinase (konkurrerende bindetest). Kjent kaliumionekonsentrasjon

Den ferdige inkuberingsblandingen inneholder for en 10 ul plasmaprøve:

Kaliumklorid settes til dette reagens og fortrenges støkiometrisk fra "Kryptofix" 221 av natriumioner, hvorved natriumionekonsentrasjonen i prøven kan bestemmes kvantitativt.

Eksempel G

Måling av kalium- og natriumionekonsentrasjonen i den samme kyvette (tvillingtest)

Natriumionekonsentrasjonen bestemmes først på samme måte som i eksempel D, bortsett fra at blandingen også inneholder :

Etter bestemmelsen av natriumioner ved bestemmelse av reaksjonshastigheten, senkes inkubasjonsblandingens pH til 7,4 med en alikvot saltsyre.

Deretter tilsettes de følgende bestanddeler i slike mengder at de angitte sluttkonsentrasjoner oppnås:

Reaksjonshastigheten kan så overvåkes ved 340 nm, men den kan også måles ved en noe større bølgelengde for å minimere eventuell forstyrrelse forårsaket av den 2-nitrofenol som frigjøres under natriumioneindikatorreaksjonen.

Eksempel H

Måling av kalsiumionekonsentrasionen ved bruk av Calpain I

I denne utførelse sentrifugeres en liten blodprøve for å frembringe plasma. For bestemmelsen av kalsiumioner ble prøven inkubert ved 30"C med en blanding inneholdende 50 mmol/1 imidazol-HCl-buffer, pH 7,3, 5 mmol/1 L-cystein, 2,5 mmol/1 2-mercaptoethanol, 0,1 mmol/1 EGTA og 5 mmol/1 Suc-Leu-Met-p-nitroanilid. Økningen av absorberingen ved 405 nm ble overvåket med fem minutters mellomrom. Hastigheten er proporsjonal med kalsiumionekonsentrasjonen i prøven.

Eksempel I

Måling av kloridionekonsentrasjonen ved bruk av cathepsin C

I denne utførelse sentrifugeres en liten blodprøve for å frembringe plasma (5 pl). For måling av kloridionekonsentrasjonen inneholder inkuberingsblandingen 0,05 mol/l citratbuffer pH 5,0, 10 mmol/1 cysteamin og 4 mmol/1 gly-arg-p-nitroanilid og 0,01 U/ml cathepsin C. Sistnevnte er blitt dialysert mot 10 mmol/1 natriumfosfatbuffer (pH = 6,8) og 43 vol% glycerol for å fjerne kloridioner.

Eksempel J

Måling av kloridionekonsentrasjonen ved ruk av - amylase

Inhiberingsblandingen inneholder for en 5 ul plas-maprøve:

Reaksjonen overvåkes ved 405 nm (eller ved en bølge-lengde nær denne) for å bestemme graden av dannelse av fri 4-nitrofenol og følgelig konsentrasjonen av kloridioner i den opprinnelige prøve.

Eksempel K

Måling av bicarbonationekonsentrasjonen ved bruk av B-D-galactosidase

Variant a: Den ferdige inkuberingsblanding inneholder:

EGTA står for ethylen-bis-(oxyethylennitrilo)-tetraeddiksyre. Prøven forhåndsinkuberes med et ekvivalent volum HC1 (for plasma, 75 mmol/1) for å nedsette prøvens pH til 4,5. Reaksjonen overvåkes deretter ved 420 nm (eller ved en bølgelengde nær denne) for å bestemme graden av dannelse av fri 2-nitrofenol og følgelig konsentrasjonen av bicarbonationer i den opprinnelige prøve. Det foretas en korreksjon for natrium-ionekonsentras j onen i den opprinnelige prøve.

Variant b: Pyridoxalkinase, pyridoxal og sinkioner benyttes istedenfor B-galactosidase og NGP.

Claims (43)

1. Fremgangsmåte for bestemmelse av ioner i fluider,karakterisert vedat innvirkningen av disse ioner på aktiviteten av et enzym måles og et bindemiddel tilsettes for å maskere interfererende ioner.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat fluidet er et biologisk eller ikke-biologisk fluid.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2,karakterisert vedat det biologiske fluid er blod, serum, plasma, urin, svette, cerebrospinalt fluid, lymfe- eller tarmsekreter, eksudater eller transudater, og at det ikke-biologiske fluid er vann eller en vandig ekstrakt eller blanding.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1-3,karakterisert vedat enzymet er en transferase, en hydrolase, en oxidoreductase eller en lyase.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4,karakterisert vedat transferasen overfører fosforholdige grupper, og at hydrolasen er en glycosidase eller virker på peptidbindinger.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5,karakterisert vedat hydrolasen er a- eller B-D-galactosidase, carboxypeptidase A, collagenase, amylase, calpain I, calpain II, dipeptidylaminopeptidase I (cathepsin C) eller fosfoglycollatfosfatase.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 5,karakterisert vedat transferasen er pyruvatkinase, hexokinase, adenylatkinase, pyridoxalkinase eller acetatkinase og at hydrolasen er a- eller B-D-galactosidase eller carboxypeptidase A.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 4,karakterisert vedat oxidoreductasen virker på gruppen CH-OH i donormolekyler eller på donorers aldehyd-eller oxo-gruppe.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 4,karakterisert vedat oxidoreductasen er glyceroldehydrogenase, acetaldehyddehydrogenase eller tyrosinase (catecholoxidase).

10. Fremgangsmåte ifølge krav 4,karakterisert vedat lyasen er en carbon-carbon-lyase eller en carbon-oxygen-lyase.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 9,karakterisert vedat lyasen er aldolase eller carbonisk anhydrase.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 1-11,karakterisert vedat ionet er kalium, natrium, kalsium, magnesium, mangan, lithium, bly, sink, kobber, jern eller annet tungmetall eller et ikke-metallisk ion valgt blant protoner, bicarbonat, klorid, ammonium og substanser som fører til dannelse av ammonium.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 1-12,karakterisert vedat konsentrasjonen av ionet som skal bestemmes, reduseres til et optimalt nivå for måling ved hjelp av et bindemiddel, dersom fortynning av prø-ven ikke kan foretas og/eller dersom enzymets følsomhet for ionene som skal bestemmes, må reduseres.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 1-13,karakterisert vedat kaliumioner bestemmes ved bruk av pyruvatkinase, glyceroldehydrogenase eller acetaldehyddehydrogenase .

15. Fremgangsmåte ifølge krav 1-13,karakterisert vedat natriumioner bestemmes ved bruk av enzymet pyruvatkinase eller B-D-galactosidase.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 1 - 15,karakterisert vedat de forstyrrende ioner eller analytter bindes ved hjelp av cryptander, coronander, podander, kronethere, sfærander, hemisfærander, calixarener og kombinasjoner derav, naturlig forekommende ionoforer, sykliske peptider, kompleksoner og chelateringsmidler og derivater derav, og metaller av første og annen sidegruppe av det perio-diske system.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 1-16,karakterisert vedat man for bestemmelse av kaliumioner binder de forstyrrende natriumioner med 4,7,13,16,21-pentaoxa-l,10-diazabicyclo-[8.8.5]-tricosan ("Kryptofix" 221), og at man for. bestemmelse av natriumioner binder de forstyrrende kaliumioner med 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabicyclo-[8.8.8]-hexacosan("Kryptofix" 222).

18. Fremgangsmåte ifølge krav 13,karakterisert vedat man ved bestemmelse av natriumioner under anvendelse av B-galactosidase reduserer konsentrasjonen av frie natriumioner med et bindemiddel.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 13,karakterisert vedat bindemidlet er "Kryptofix" 221.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 13,karakterisert vedat bindemidlene ifølge krav 16 er tilstede og danner et kompleks med indikatorioner, fra hvilket indikatorionene fortrenges støkiometrisk av ionene som skal bestemmes, og ved at innvirkningen av de fortrengte indikatorioner på aktiviteten av enzymet måles, hvorved det fåes et indirekte mål på konsentrasjonen av analyttene.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 20,karakterisert vedat enzymet er pyruvat- kinase, at indikatorionene er kalium, at bindemidlet er "Kryptofix" 221, og at ionet som skal bestemmes, er natrium.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 20,karakterisert vedat enzymet er en kinase, at indikatorionet er Mg<2+>, at bindemidlet er et chelateringsmiddel, og at analyttionet er et metallion.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 20,karakterisert vedat enzymet er pyridoxalkinase, at indikatorionet er Zn<2+>, at bindemidlet er "Kryptofix" 221, og at analyttionet er et tungmetallion.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 20,karakterisert vedat ionene som skal bestemmes, avstedkommer en endring i pH-verdien som fortrenger indikatorionene fra et kompleks med et pH-følsomt bindemiddel.

25. Fremgangsmåte ifølge krav 24,karakterisert vedat enzymet er B-galactosidase, at det pH-følsomme bindemiddel er "Kryptofix" 221, at indikatorionene er natrium, og at ionet som skal bestemmes er bicarbonat.

26. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 13 - 16,karakterisert vedat enzymet er a-amylase eller cathepsin C, at bindemidlet er Ag eller Hg, og at ionet som skal bestemmes, er klorid.

27. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 13 - 16,karakterisert vedat enzymet er collagenase eller calpain I eller calpain II, at bindemidlet er et chelateringsmiddel, og at ionet som skal bestemmes, er kalsium.

28. Fremgangsmåte ifølge krav 1-27,karakterisert vedat ioner som er konkurrerende inhibitorer for det følsomme indikatorenzym, innlemmes i testen.

29. Fremgangsmåte ifølge krav 28,karakterisert vedat ionene som skal bestemmes, er natrium eller kalium, og at den konkurrerende inhibitor utgjøres av lithiumioner.

30. Materiale for bestemmelse av ioner i fluider,karakterisert vedat det omfatter et enzym hvis aktivitet påvirkes av ionet, og et bindemiddel som er til stede for å maskere interfererende ioner.

31. Materiale ifølge krav 30, for bestemmelse av kalium-ioner , karakterisert vedat det omfatter pyruvat-kinase og en cryptand.

32. Materiale ifølge krav 30,karakterisert vedat cryptanden er "Kryptofix" 221.

33. Materiale ifølge krav 30, for bestemmelse av natriumioner, karakterisert vedat det omfatter pyruvat-kinase og en cryptand.

34. Materiale ifølge krav 33,karakterisert vedat cryptanden er "Kryptofix" 222.

35. Materiale ifølge krav 30, for bestemmelse av natriumioner, karakterisert vedat det omfatter B-D-galactosidase og en cryptand.

36. Materiale ifølge krav 35,karakterisert vedat cryptanden er "Kryptofix" 221.

37. Blanding for bestemmelse av kaliumioner, anvendt fortrinnsvis ved 37°C, karakterisert vedat den omfatter:

38. Blanding for bestemmelse av kaliumioner, anvendt fortrinnsvis ved 37°C, karakterisert vedat den omfatter:

39. Blanding for bestemmelse av kaliumioner, anvendt fortrinnsvis ved 37°C, karakterisert vedat den omfatter:

40. Blanding for bestemmelse av kaliumioner, anvendt fortrinnsvis ved 37°C, karakterisert vedat den omfatter:

41. Blanding for bestemmelse av natriumioner, fortrinnsvis målt ved 37°C, karakterisert vedat den omfatter:

42. Fremgangsmåte for måling av kalium- og natriumione-konsentras j onen i samme kyvette, karakterisert vedat natriumionekonsentrasjonen analyseres ved bestemmelse av reaksjonshastigheten, pH-verdien i inkubasjonsblandingen senkes, og deretter måles kaliumionekonsentrasjonen.

43. Fremgangsmåte ifølge krav 42,karakterisert vedat analyseblandingen ved analyse av natriumionekonsentrasjonen inneholder Tris-HCl, pH 8,7 (37°C) Dithiotreitol Magnesiumsulfat Lithiumklorid EGTA (lithiumsalt) Humant serum-albumin p-galaktosidase NPG "Kryptofix" 221 ADP (fri syre) PEP (nøytralisert tris-salt) NADH KG GDH og at det etter at pH-verdien er senket tilsettes be- . standdelene LDH PK MnCl2 LiCl.