JP5631480B2 - カルシウムイオンの測定のための方法 - Google Patents
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Description
カルシウムイオンに関する基準範囲は2.20〜2.25mmol/Lと非常に狭く、これらのレベルより上または下へのわずかな逸脱は、いくつかの生理障害の症状を示す。高カルシウム血症(高い血清カルシウム)と関係する2つの最も一般的な疾患は、副甲状腺機能亢進症および悪性腫瘍であり、特に悪性腫瘍が骨に転移して骨吸収(すなわち転移巣の部位からのカルシウムの放出を伴う骨の局所的な破壊)を引き起こした場合である。減少した血清カルシウムレベル(低カルシウム血症)は一般に副甲状腺機能低下症と関係している。新生児の約1%は、即時の医療介入を必要とする被刺激性、攣縮および痙攣のような症状を伴う重大な低カルシウム血症(血清カルシウム<1.75mmol/L)を有する。
発明の概要
本発明は、カルシウムイオンの測定において非常に有用であり、数あるプラスの面の中でも、優れた貯蔵安定性を有し、ヒ素による環境汚染の問題がなく、マグネシウムまたはガドリニウムによる干渉を示さず、広い濃度範囲にわたる迅速かつ正確なカルシウムの決定を可能にする試薬を提供する。
さらに、本発明は、pH8.5からpH11.5の範囲のpHを有し、モノ−ニトロ−BAPTA型キレート剤を含有する、カルシウムの測定のための試薬組成物を含むキットに向けられている。
好ましい態様において、本発明は試料中のカルシウムイオンの濃度を決定するための方法に関し、その方法は、その試料をモノ−ニトロ−BAPTA型キレート剤を含む溶液と混合し、それによりカルシウムイオンをそのモノ−ニトロ−BAPTA型キレート剤に結合させ、そのモノ−ニトロ−BAPTA型キレート剤からカルシウムイオンを放出させることを含み、ここで前記の放出がそのモノ−ニトロ−BAPTA型キレート剤の吸光度の変化を引き起こし、その吸光度の変化を測定し、そしてその測定された吸光度の変化をカルシウムイオンの濃度を決定するために用いる工程を含む。
の化合物を含む溶液と混合し、それによりカルシウムイオンをその化合物に結合させ、b)カルシウムイオンをその化合物から放出させ、ここで前記の放出がその化合物の吸光度の変化を引き起こし、c)その吸光度の変化を測定し、そしてd)(c)において測定された吸光度の変化をカルシウムイオンの濃度を決定するために用いる工程を含む。
1つの好ましい態様において、その置換基R1および/またはR2、および/またはR3はカルボキシである。
R2、R3、および/またはR6に関して言及されたアルコキシは、好ましくはメトキシまたはエトキシである。
対イオンX+は好ましくはNa+、K+、Li+およびCs+からなるグループから選択される。また、好ましいX+はK+またはNa+である。
冠詞“a”および“an”は、本明細書において、その冠詞の文法上の目的語の1個を、または1個より多くを(すなわち少なくとも1個を)指して用いられる。例として、“マーカー(a marker)”は1個のマーカーまたは1個より多くのマーカーを意味する。用語“少なくとも”は、場合により1個以上のさらなる対象が存在していてよいことを示すために用いられる。
式Iに従う化合物は、カルシウムイオンに結合することができる。カルシウムの結合の際または放出の際に、そのスペクトル特性において変化が起こる。このスペクトル特性における変化は容易に測定することができ、試料中に存在するカルシウムイオンの濃度に直接相関している。
好ましい態様において、本発明に従う方法は、R2が水素、ハロゲン、カルボキシ、モルホリノまたはアルキルである式Iに従う化合物を用いて実施される。
1態様において、本発明で開示されるような方法における使用のための式Iに従う化合物は、好ましくは9.0以下のlog kの結合定数でカルシウムイオンに結合するべきである。一方で、log kとして記述したカルシウムイオンに対する結合定数は少なくとも4.0以上であるべきである。好ましくは、log kで与えられたカルシウムイオンに対する結合定数は4.5〜8.5であるべきであり、5.0〜8.0のlog kも好ましいであろう。
式Iに従う化合物からカルシウムイオンを放出させるために用いられるキレート剤の選択は、式Iの化合物に結合したカルシウムイオンがそのようなキレート剤の添加後に放出されるのであれば、重要ではない。最終反応混合物中のそのキレート剤の濃度は、好ましくは少なくとも等モル濃度であるがこの混合物中の式Iに従う化合物の濃度の100倍よりは高くないであろう。例えばピペット操作における微量の誤差を埋め合わせることにより、十分に余裕を持つため、過剰量のキレート剤を用いてよい。1態様において、本明細書で開示するような方法を実施する際、最終反応混合物中のそのキレート剤の濃度は式Iの化合物に関する終濃度よりも例えば1.5倍〜50倍高く、または2倍〜10倍高いのも好ましい。
8.5および/またはより高いpHの溶液を緩衝するのに適した緩衝系は、当業者には周知である。好ましくは、そのような緩衝系はAMPD(=2−アミノ−2−メチル−1.3−プロパンジオール)、CHES(=2−(N−シクロヘキシルアミノ)−エタンスルホン酸)、AMPSO(=3−[ジメチル(ヒドロキシルメチル)−メチルアミノ]−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸)、CAPSO(=3−シクロヘキシルアミノ)−2−ヒドロキシ−1−プロパンスルホン酸)、CAPS(=3−シクロヘキシルアミノ)−2−プロパンスルホン酸)、グリシン緩衝系、または炭酸緩衝系から選択されるであろう。本発明に従うカルシウムイオンの測定のための試薬がCAPSまたはCAPSOから選択される緩衝系を含むのも好ましいであろう。
当業者が理解しているであろうように、測定する試料を含むそのアッセイ混合物中の式Iの化合物の終濃度は、その試料中のカルシウムイオンの濃度と釣り合っていなければならない。1態様において、式Iに従う化合物の濃度は0.10mmol/L〜2mmol/Lの範囲であろう。代わりの態様において、式Iに従う化合物の濃度は0.1、0.125、0.15、または0.2から2.0、1.5または1mmol/Lの範囲であろう。この試薬は、さらなる希釈なしで用いられる測定する試料と混合することができる。
さらなる好ましい態様において、本発明で開示するようなカルシウムの測定のための試薬は式Iに従う化合物を含み、ここでR2は水素、ハロゲン、カルボキシ、モルホリノまたはアルキルである。
MN−BAPTAの合成
MN−BAPTAの合成を図1において図式的に示す。
2−ニトロ−フェノール(168,7g)およびトルエン−4−スルホン酸2−クロロエチルエステル(100g)を500mlのDMF中で溶解させ、199gの炭酸カリウムを注意深く添加した後110〜120℃で1時間攪拌した。その反応混合物を砕いた氷および水の混合物(8 l)中に注ぎ、それを強く攪拌した。残留物を濾過して分離し、水で数回洗浄し、乾燥させた。
b)4−メチル−1−ニトロ−2−(2−(2−ニトロ−フェノキシ)−エトキシ)−ベンゼン
1−(2−クロロ−エトキシ)−2−ニトロ−ベンゼン(116g)および5−メチル−2−ニトロ−フェノール(88g)を500mlのDMF中で溶解させ、160gの炭酸カリウムを注意深く添加した後90〜110℃で4時間攪拌した。その反応混合物を砕いた氷および水の混合物(8 l)中に注ぎ、それを強く攪拌した。残留物を濾過して分離し、水で数回洗浄し、乾燥させた。その粗生成物をメタノール中で懸濁し、淡黄色の残留物を再度濾過して分離し、メタノールで洗浄し、乾燥させた。
c)2−(2−(2−アミノ−フェノキシ)−エトキシ)−4−メチル−フェニルアミン
100gの4−メチル−1−ニトロ−2−(2−(2−ニトロ−フェノキシ)−エトキシ)−ベンゼンおよび10gの木炭上パラジウムを3,5 lのジオキサン中で懸濁し、室温で5,5barの水素圧の下で水素化した。窒素で3回フラッシュした後、窒素雰囲気下で触媒を濾過して除き、残った溶液を蒸発させ、生成物を真空下で乾燥させた。
d)((2−(2−(2−(ビス−メトキシカルボニルメチル−アミノ)−フェノキシ)−エトキシ)−4−メチル−フェニル)−メトキシカルボニルメチル−アミノ)−酢酸メチルエステル
2−(2−(2−アミノ−フェノキシ)−エトキシ)−4−メチル−フェニルアミン(80g)を2,5 lのDMF中で溶解させ、285mlのブロモ酢酸メチルエステル、429gの炭酸カリウム、および36,8gのヨウ化ナトリウムを添加した。その反応混合物を80℃まで2時間加熱した。蒸発後、残ったブロモ酢酸メチルエステルをヘキサンを用いて生成物から除去した。その粗生成物をメタノール中での結晶化によりさらに精製した。
e)((2−(2−(2−(ビス−メトキシカルボニルメチル−アミノ)−5−ニトロ−フェノキシ)−エトキシ)−4−メチル−フェニル)−メトキシカルボニルメチル−アミノ)−酢酸メチルエステル
50gの((2−(2−(2−(ビス−メトキシカルボニルメチル−アミノ)−フェノキシ)−エトキシ)−4−メチル−フェニル)−メトキシカルボニルメチル−アミノ)−酢酸メチルエステルを600mlの氷酢酸中で溶解させた。強い攪拌の下で91,5mlの氷酢酸中1モル濃度の硝酸を添加し、第2工程において28mlの濃硫酸を添加した。温度を30℃まで上昇させた。その反応混合物を10 lの氷/水混合物の中に直接注いだ。その残留物を濾過して分離し、水で水回洗浄し、真空下で乾燥させた。その粗生成物をさらに、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより、まずヘキサン/酢酸エチルエステル(1:1)を溶離液として用いて、2回目にトルエン/アセトニトリル(1:1)を溶離液として用いて精製した。その生成物を最後にプロパン−2−オールから結晶化した。
f)NM−BAPTA;((2−(2−(2−(ビス−カルボキシメチル−アミノ)−5−ニトロ−フェノキシ)−エトキシ)−4−メチル−フェニル)−カルボキシメチル−アミノ)−酢酸のカリウム塩
9,5gの((2−(2−(2−(ビス−メトキシカルボニルメチル−アミノ)−5−ニトロ−フェノキシ)−エトキシ)−4−メチル−フェニル)−メトキシカルボニルメチル−アミノ)−酢酸メチルエステルを、水/メタノールの混合物(それぞれ230ml)中で溶解させ、160mlの1モル濃度の水酸化カリウム溶液を添加した。その反応混合物を1時間還流させた。冷却して室温まで下げて250mlの水を添加した後、その溶液のpHをpH3に調節し、メタノールを蒸発させた。その生成物を、酸性酸エチルエステルを用いた溶媒抽出により単離した。蒸発後、その生成物を真空下で乾燥させた。
実施例2
NM−BAPTAを用いるカルシウムイオンの測定に関する一般的な手順
式Iに従うモノ−ニトロ−BAPTA型化合物を用いるカルシウムイオンの測定を、逆滴定法で実施した。
表Iにおいて、Roche Diagnostics(ドイツ)の5種類の異なる自動分析器上でのカルシウムイオンの測定に推奨される適用に関する概観を示す。Modular PおよびModular D分析器に関する推奨される適用は同じである。
NM−BAPTAを用いるカルシウム測定の線形性
本発明で開示するカルシウムイオンの測定のための方法は技術的に優れており、例えばそれは非常に高い精度を示す。これは例えば理論的に予想された値および実際に測定された値を比較した場合に明らかになる。
2種類の異なる分析器であるModular Pおよびcobas c501(共にRoche Diagnosticsにより供給されている)上でそれぞれ測定した値による2つのみの代表的な実施例を、図2および3として示す。これらの2つの図は、その測定の顕著な技術的質/精度を実証している。図2および3から明らかであるように、実際に測定された全ての値は対応する予想された理論値の95〜105%の範囲内にあり、それは調べた全濃度範囲にわたるカルシウムイオンの相当に正確な測定へと変換される。
NM−BAPTAの最小濃度の決定
循環中のカルシウムイオンの濃度はごく稀に4mmol/Lを超える。5mmol/Lまでのカルシウムを信頼できる方法で測定することができる試薬は、循環中のカルシウムイオンを決定するのに最も適しているはずである。
NM−BAPTAのpHに依存する安定性
カルシウムの測定のための試薬は、輸送条件下および分析器のボードの上の両方で可能な限り安定であるべきである。
表4:
35℃における50mmol/L TRIS pH8.0中でのNM−BAPTAの安定性
表4から明らかであるように、NM−BAPTAを含有する試薬は、pH8.0においてきわどいがまだ許容可能な安定性を有する。カルシウムイオンの回収率は大部分が80%〜90%の範囲内である。
NM−BAPTAを用いるカルシウムの測定にはマグネシウムによる干渉がない
カルシウムイオンを2.53mmol/Lの生理的濃度で含む試料に、0〜15mmol/Lのマグネシウムイオンを加えた(spiked)。その加えた試料を、Roche/Hitachi 917分析器上で、実施例2においてModular Pに関して示したような適用で測定した。3回の決定の結果の中央値を下記の表8において示す。
実施例7
NM−BAPTAを用いるカルシウムの測定にはガドリニウムによる干渉がない
カルシウムイオンを約2,35mmol/Lの生理的濃度で含む1つの試料および約3.40mmol/Lの高いレベルのカルシウムイオンを含む1つの試料に、異なるレベルのOmniscan(登録商標)を加えた(C1:14μLを986μLに添加、C2:2,8を997μLに添加)。Omniscan(登録商標)は頻繁に用いられるガドリニウムを含む造影剤である。その加えた試料を、Hitachi 917分析器上で、実施例2においてModular Pに関して示したような適用で測定した。3回の決定の結果の中央値を下記の表9において示す。
NF−BAPTAの合成
NF−BAPTAの合成を図6において図式的に示す。
実施例1参照
b)4−フルオロ−1−ニトロ−2−(2−(2−ニトロ−フェノキシ)−エトキシ)−ベンゼン
1−(2−クロロ−エトキシ)−2−ニトロ−ベンゼン(10g)および5−フルオロ−2−ニトロ−フェノール(7,86g)を50mlのDMF中で溶解させ、13,82gの炭酸カリウムを注意深く添加した後90〜110℃で19時間攪拌した。その反応混合物を砕いた氷および水の混合物(500ml)中に注ぎ、それを強く攪拌した。残留物を濾過して分離し、水で数回洗浄し、乾燥させた。その粗生成物をメタノール中で懸濁し、淡黄色の残留物を再度濾過して分離し、メタノールで洗浄し、乾燥させた。
c)2−(2−(2−アミノ−フェノキシ)−エトキシ)−4−フルオロ−フェニルアミン
9,48gの4−フルオロ−1−ニトロ−2−(2−(2−ニトロ−フェノキシ)−エトキシ)−ベンゼンおよび1,5gの木炭上パラジウムを500mlのジオキサンおよび60mlの氷酢酸中で懸濁し、室温で水素化した。窒素で3回フラッシュした後、窒素雰囲気下で触媒を濾過して除き、残った溶液を蒸発させ、生成物を真空下で乾燥させた。
d)((2−(2−(2−(ビス−メトキシカルボニルメチル−アミノ)−フェノキシ)−エトキシ)−4−フルオロ−フェニル)−メトキシカルボニルメチル−アミノ)−酢酸メチルエステル
2−(2−(2−アミノ−フェノキシ)−エトキシ)−4−フルオロ−フェニルアミン(7,52g)を250mlのDMF中で溶解させ、38,4mlのブロモ酢酸メチルエステル、56gの炭酸カリウム、および2,13gのヨウ化ナトリウムを添加した。その反応混合物を80℃まで21時間加熱した。蒸発後、残ったブロモ酢酸メチルエステルをヘキサンを用いて生成物から除去した。その粗生成物をメタノール中での結晶化によりさらに精製した。
e)((2−(2−(2−(ビス−メトキシカルボニルメチル−アミノ)−5−ニトロ−フェノキシ)−エトキシ)−4−フルオロ−フェニル)−メトキシカルボニルメチル−アミノ)−酢酸メチルエステル
2,5gの((2−(2−(2−(ビス−メトキシカルボニルメチル−アミノ)−フェノキシ)−エトキシ)−4−フルオロ−フェニル)−メトキシカルボニルメチル−アミノ)−酢酸メチルエステルを、30mlの氷酢酸中で溶解させた。強い攪拌の下で4,54mlの氷酢酸中1モル濃度の硝酸を添加し、第2工程において11,35mlの濃硫酸を添加した。温度を30℃まで上昇させた。その反応混合物を250mlの氷/水混合物の中に直接注いだ。その残留物を濾過して分離し、水で水回洗浄し、真空下で乾燥させた。その粗生成物をさらに、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより、まずヘキサン/酢酸エチルエステル(1:1)を溶離液として用いて、2回目にトルエン/アセトニトリル(1:1)を溶離液として用いて精製した。収量:0,82g
f)NM−BAPTA;((2−(2−(2−(ビス−カルボキシメチル−アミノ)−5−ニトロ−フェノキシ)−エトキシ)−4−フルオロ−フェニル)−カルボキシメチル−アミノ)−酢酸のカリウム塩
0,82gの((2−(2−(2−(ビス−メトキシカルボニルメチル−アミノ)−5−ニトロ−フェノキシ)−エトキシ)−4−mフルオロ−フェニル)−メトキシカルボニルメチル−アミノ)−酢酸メチルエステル(((2-(2-(2-(Bis-methoxycarbonylmethyl-amino)-5-nitro-phenoxy)-ethoxy)-4-mfluoro-phenyl)-methoxycabonylmethyl-amino)-acetic acid methyl ester)を、水/メタノールの混合物(それぞれ20ml)中で溶解させ、13,77mlの1モル濃度の水酸化カリウム溶液を添加した。その反応混合物を1時間還流させた。冷却して室温まで下げて250mlの水を添加した後、その溶液のpHをpH3に調節し、メタノールを蒸発させた。その生成物を、酸性酸エチルエステルを用いた溶媒抽出により単離した。蒸発後、その生成物を真空下で乾燥させた。
実施例9
カルシウムイオンのNF−BAPTAへの結合
カルシウムイオンの存在下および非存在下でのNF−BAPTAの吸光度特性を、Uvikon 930光度計を用いて分析した。吸収スペクトルを、0.15mmol/LのMN−BAPTAまたはNF−BAPTAそれぞれに関して、50mmol/L CAPSO(pH 7における)、0.9% NaClおよび0.01% Brij−35中で、それぞれ0.09mmol/L Ca2+の非存在下または存在下のどちらかで得た。
Claims (15)
- 試料中のカルシウムイオンの濃度を決定するための方法であって、以下:
a)その試料を式I
の化合物を含む溶液と混合し、それによりカルシウムイオンをその化合物に結合させ;
b)カルシウムイオンをその化合物から放出させ、ここで前記の放出がその化合物の吸光度の変化を引き起こし;
c)その吸光度の変化を測定し;
d)(c)において測定された吸光度の変化をカルシウムイオンの濃度を決定するために用いる;
の工程を含む、前記方法。 - 式Iの化合物を含む溶液がpH8.5からpH11.5の範囲のpHを有する、請求項1に記載の方法。
- 式Iの化合物を含む溶液がpH9.0からpH10.5の範囲のpHを有する、請求項1または2に記載の方法。
- 式IのR1が水素またはハロゲンのどちらかである、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 式IのR2が水素、ハロゲンまたはアルキルである、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 式IのR3が水素、ハロゲン、カルボキシまたはアルコキシである、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 請求項1の工程(b)におけるカルシウムイオンの放出が、20℃において7.0以上のlog kのカルシウムイオンに対する結合定数を有するカルシウムキレート剤により誘発される、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 請求項1の工程(b)におけるカルシウムイオンの放出が、EDTA、DTPA、EGTA、DTPMPおよび/またはEDPMPにより誘発される、請求項7に記載の方法。
- pH8.5からpH11.5の範囲のpHを有し、請求項1に定義された式Iの化合物を含有する、カルシウムの測定のための試薬。
- 0.10mMから50mMの範囲の濃度の式Iの化合物を含む、請求項9に記載の試薬。
- 緩衝系を含み、その緩衝系がAMPD(=2−アミノ−2−メチル−1.3−プロパンジオール)、CHES(=2−(N−シクロヘキシルアミノ)−エタンスルホン酸)、AMPSO(=3−[ジメチル(ヒドロキシルメチル)−メチルアミノ]−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸)、CAPSO(=3−シクロヘキシルアミノ)−2−ヒドロキシ−1−プロパンスルホン酸)、CAPS(=3−シクロヘキシルアミノ)−2−プロパンスルホン酸)、グリシン緩衝系、または炭酸緩衝系から選択される、請求項9に記載の試薬。
- 式IのR1が水素またはハロゲンのどちらかである、請求項9〜11のいずれかに記載の試薬。
- 式IのR2が水素、ハロゲンまたはアルキルである、請求項9〜11のいずれかに記載の試薬。
- 式IのR3が水素、ハロゲン、カルボキシまたはアルコキシである、請求項9〜11のいずれかに記載の試薬。
- カルシウムの測定のための検査キットであって、請求項9〜14のいずれかに記載の試薬を含む検査キット。
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