BR112012020015B1

BR112012020015B1 - método para determinar a concentração de íons de cálcio, reagente para medição da concentração de íons de cálcio e kit de teste

Info

Publication number: BR112012020015B1
Application number: BR112012020015-1A
Authority: BR
Inventors: Hans-Peter Josel; Hans-Joachim Kytzia; Matthias Muecke
Original assignee: F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date: 2010-03-30
Filing date: 2011-03-28
Publication date: 2021-05-25
Also published as: AU2011234646A1; BR112012020015A2; MX2012010759A; KR101495970B1; EP2553469B1; US8962338B2; CA2794386C; CN102834721A; CN102834721B; JP2013524187A; JP5631480B2; AU2011234646B2; US20130023055A1; ES2532991T3; WO2011120913A1; SG183826A1; CA2794386A1; EP2553469A1; KR20120135291A; HK1175241A1

Abstract

MÉTODO PARA DETERMINAR A CONCENTRAÇÃO DE ÍONS DE CÁLCIO, REAGENTE PARA MEDIÇÃO DE CÁLCIO E KIT DE TESTE A presente invenção refere-se a um reagente para a determinação de cálcio e um método de determinação com o uso deste reagente. Mais particularmente, refere-se a um reagente para a determinação de cálcio que compreende um quelante do tipo BAPTA mono-nitro substituído (BAPTA = ácido 1,2-bis(2-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'- tetraacético). Um método de determinação que permite a determinação precisa de cálcio em uma mostra, tal como uma amostra de sangue (por exemplo, sangue total, plasma ou soro) ou qualquer outra amostra de líquido aquoso (por exemplo, fluido cerebrospinal, linfa, saliva ou urina) e, deste modo, é especialmente útil para diagnósticos clínicos conforme ora descrito.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a um reagente para a determinação de cálcio e a um método de determinação que utiliza este reagente. Mais particularmente, se refere a um reagente para a determinação de cálcio que compreende um quelante do tipo BAPTA mono-nitro substituído (BAPTA = ácido 1,2-bis(2-aminofenoxi)etano-N,N,N’,N’-tetraacético). Um método de determinação que permite a determinação precisa de cálcio em uma amostra, tal como uma amostra de sangue (por exemplo, sangue total, plasma ou soro) ou qualquer outra amostra de líquido aquoso (por exemplo, fluido cerebrospinal, linfa, saliva ou urina) e, deste modo, é especialmente útil para diagnósticos clínicos, conforme descrito.

[002] Os níveis de cálcio do sangue ou soro, respectivamente, são de valor diagnostico significante e podem ter implicações de tratamento importantes.

[003] A faixa de referência para íons de cálcio é muito limitada, 2,20 a 2,55 mmol/L, e leves desvios acima ou abaixo destes níveis consistem no diagnóstico de vários distúrbios fisiológicos. As duas doenças mais comuns associadas à hipercalcemia (cálcio de soro elevado) consistem em hiperparatiroidismo e patologias malignas, especialmente quando as patologias malignas têm se metastaseado para o esqueleto e causado reabsorção do osso (isto é, a destruição local do osso acompanhada pela liberação de cálcio a partir do local da lesão de metastásica). Os níveis de cálcio sérico diminuídos (hipocalcemia) estão comumente associados ao hipoparatiroidismo. Cerca de 1% dos recém-nascidos têm hipocalcemia significante (cálcio sérico <1,75 mmol/L) com sintomas como irritabilidade, espasmo e convulsões, os quais exigem intervenção médica imediata

[004] O magnésio, semelhante ao cálcio, é um dos principais elementos encontrados no sangue. As deficiências no nível de magnésio também conduzem a sintomas clínicos, dos quais alguns são muito similares àqueles encontrados com os níveis deficientes de cálcio. Dados os sintomas clínicos quase idênticos de cálcio sérico baixo e magnésio sérico baixo, é fundamental descrever qual elemento está causando os sintomas clínicos. Muitas vezes, tanto as medições de cálcio como magnésio sérico são necessárias para determinar qual elemento ou, conforme o caso, pode ser se ambos os elementos estão fora da faixa normal e é indispensável que o magnésio não interfira na quantificação de cálcio.

[005] O método de referência para a medição de cálcio e magnésio, respectivamente, consiste em absorção atômica. Para as medições de rotina, a absorção atômica é um tanto inconveniente, exige instrumentação dispendiosa e um operador especialmente versado para executar os ensaios a fim de alcançar reprodutividade e precisão suficiente.

[006] A atividade catalítica de determinadas enzimas depende fortemente da presença de íons de cálcio, tornando, assim, possível quantificar o cálcio através de uma medição de atividade enzimática dependente de cálcio. Os métodos para medição de íons de cálcio com base em procedimentos enzimáticos têm sido descritos, por exemplo, no documento sob o no. US 6,068.971.

[007] Os presentes métodos frequentemente usados na rotina de laboratórios clínicos para a medição de cálcio têm por base os procedimentos que empregam quelação, agentes de produção de cor como orto-cresolftaleina complexona (o-CPC), arsenazo III, fosfonazo ou clorofosfonazo. Embora ao menos um destes métodos seja muitas vezes usado na rotina clínica de um laboratório, cada um tem desvantagens.

[008] A sensibilidade dos métodos de o-CPC é muito dependente de pH. Para sensibilidade máxima, a reação é realizada em um pH de cerca de 10,7. Nestes valores de pH alcalino, no entanto, o reagente absorve prontamente o dióxido de carbono ambiente. A absorção de dióxido de carbono que combina com água para formar ácido carbônico reduz gradualmente o pH do reagente e eventualmente torna o reagente não funcional para medições de cálcio. A mudança gradual em pH também exige procedimentos de calibragem mais frequentes, a fim de assegurar uma medição correta. Além disso, o o-CPC é, de preferência, não seletivo e se liga ao magnésio e outros metais, como gadolínio. Para eliminar a interferência do magnésio nos níveis normalmente encontrados em soro, a 8-hidroxiquinolina é adicionada para quelar o magnésio.

[009] Os métodos para a detecção de cálcio com base em Arsenazo III não sofrem dos problemas de pH alto e interferência de magnésio (dependendo do pH da medição) inerentes nos métodos de o-CPC. O arsenazo III se liga ao cálcio sob condições fracamente ácidas, por exemplo, pH 5 a 6, e se a medição de cálcio for feita em um pH menor do que 7, a ligação de magnésio é desprezível. Embora o arsenazo III elimine muitas das desvantagens dos métodos de o-CPC, o mesmo sofre da sensibilidade, de preferência, baixa e preocupações ambientais. Cada mol de arsenazo III contém 2 moles de arsênico e o descarte dos reagentes de arsenazo III consiste em um problema crítico em muitos países devido às questões de contaminação do abastecimento de água com arsênico.

[0010] O documento sob o no. JP-A-04-120464 apresenta que o cálcio e o magnésio podem ser quantificados ao mesmo tempo mediante o uso de Clorofosfonazo-III como um agente quelante e de produção de cor. No caso de Clorofosfonazo-III, a faixa de pH mais adequada para esta mudança de cor é fracamente ácida e o Clorofosfonazo-III consiste em um reagente que não contém arsênico. Portanto, o Clorofosfonazo-III é vantajoso em relação aos problemas causados por um pH alto e alta toxicidade. No entanto, a quantificação simultânea de magnésio e cálcio com o uso de Clorofosfonazo-III apresenta um problema. Este quelante é usualmente adicionado a uma amostra para ligar tanto magnésio como cálcio, causando, assim, a coloração. Posteriormente, o EGTA é adicionado para liberar somente o cálcio ligado, esta liberação que causa uma mudança na cor. O cálcio é, então, quantificado com base na mudança na cor. O Clorofosfonazo-III também tende a proporcionar altos valores em branco, este fato limita a faixa de concentração em que a determinação de íons de cálcio é possível.

[0011] Os agentes quelantes de cálcio do tipo BAPTA têm sido descritos e usados como sistemas tampão para, por exemplo, controlar a concentração de íons de cálcio intracelulares. Pethig, R. et al., (Cell Calcium 10 (1989) 491-498) têm determinado as constantes de dissociação de sete tampões de cálcio do tipo BAPTA diferentes. Propõe-se utilizar dibromo-BAPTA no trabalho fisiológico com cálcio.

[0012] Conforme discutido acima, diversos métodos de ensaio para medição de íons de cálcio são conhecidos na rotina clínica. Vários reagentes para a determinação de cálcio com base no uso de um quelante e agente de produção de cor estão disponíveis, com cada um deixando espaço para aperfeiçoamento adicional.

[0013] Deste modo, existem necessidades não atendidas por reagentes e por métodos para medir de maneira quantitativa o cálcio em amostras analíticas. O método ideal deveria ter por base um quelante que a) é estável sob condições de armazenamento e integrado em um analisador, b) não contém elementos tóxicos como, por exemplo, arsênico, c) tem uma absorbância de branco de reagente relativamente baixa, d) não se liga a íons de magnésio ou outros íons de metal, como, gadolínio, e) permite determinações rápidas e alta taxa de rendimento da amostra, e f) conduz a uma medição precisa de íons de cálcio sobre uma ampla faixa de medição.

[0014] Revelou-se surpreendentemente que os mono-nitro- derivados de quelantes do tipo BAPTA exibem propriedades completamente vantajosas que os tornam muito adequados para a medição de íons de cálcio.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[0015] A presente invenção fornece um reagente que é muito útil na medição de íons de cálcio e, entre outros aspectos positivos, tem excelente estabilidade de armazenamento, é livre do problema da poluição ambiental por arsênico, não mostra interferência por magnésio ou gadolínio e permite a determinação de cálcio rápida e precisa sobre uma ampla faixa de concentrações.

[0016] A presente invenção se refere a um método para a determinação da concentração de íons de cálcio em uma amostra, o método que compreende as etapas de misturar a amostra com uma solução que compreende um quelante do tipo mono-nitro-BAPTA, ligar, assim, íons de cálcio ao quelante do tipo mono-nitro-BAPTA, liberar íons de cálcio a partir do quelante do tipo mono-nitro-BAPTA, em que a dita liberação causa uma mudança na absorbância do quelante do tipo mono-nitro-BAPTA, medir a mudança na absorbância e utilizar a mudança na absorbância medida para a determinação da concentração de íons de cálcio.

[0017] Também é apresentada uma composição de reagente estável para medição de cálcio que contém um quelante do tipo mono-nitro- BAPTA e que tem um pH que se situa em uma faixa a partir de pH 8,5 a pH 11,5.

[0018] Adicionalmente, a presente invenção é direcionada a um kit que compreende uma composição de reagente para medição de cálcio que tem um pH que se situa em uma faixa a partir de pH 8,5 a pH 11,5 e que contém um quelante do tipo mono-nitro-BAPTA.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0019] Em uma modalidade preferida, a presente invenção se refere a um método para a determinação da concentração de íons de cálcio em uma amostra, o método que compreende as etapas de misturar a amostra com uma solução que compreende um quelante do tipo mono-nitro-BAPTA, ligando, assim, os íons de cálcio ao quelante do tipo mono-nitro-BAPTA, liberar os íons de cálcio a partir do quelante do tipo mono-nitro-BAPTA, em que a dita liberação causa uma mudança na absorbância do quelante do tipo mono-nitro-BAPTA, medir a alteração na absorbância e utilizar a alteração na absorbância medida para a determinação da concentração de íons de cálcio.

[0020] É apresentado um método para a determinação da concentração de íons de cálcio em uma amostra, o método que compreende as etapas de a) misturar a amostra com uma solução que compreende um composto da Fórmula I.

[0021] em que R1 é selecionado a partir de hidrogênio, halogênio, carboxi, alquila e formil, R2 é independentemente selecionado a partir de hidrogênio, halogênio, alquila, alcoxi, morfolino, CN, carboxi e formila, R3 é independentemente selecionado a partir de hidrogênio, halogênio, sulfato de N- alquila, carboxi, alcoxi, fenila, CN, CF3, e butila terciária, R4 é independentemente selecionado a partir de hidrogênio, halogênio ou alquila, R5 e R7 são independentemente hidrogênio ou alquila, R6 é selecionado a partir de hidrogênio, alquila, alcoxi e halogênio, ou em que R3 e R4 formam uma ponte aromática e X+, é um contra-íon positivamente carregado, ligando, assim, os íons de cálcio ao composto, b) liberar os íons de cálcio a partir do composto, em que a dita liberação causa uma alteração na absorbância do composto, c) medir a alteração na absorbância, e d) utilizar a alteração na absorbância medida em (c) para a determinação da concentração de íons de cálcio.

[0022] O halogênio mencionado com R1, R2, R3, R4 e/ou R6 substituinte candidato é selecionado, de preferência, a partir de Cl- Br- e F-.

[0023] Em uma modalidade preferida, o R1 e/ou R2 e/ou R3 substituinte consiste em carboxi.

[0024] A alquila conforme mencionado para R1, R2, R4, R5, R6 e/ou R7 consiste, de preferência, em alquila C1 a C3.

[0025] O alcoxi conforme mencionado para R2, R3 e/ou R6 é, de preferência, metoxi ou etoxi.

[0026] A ponte aromática entre R3 e R4 é, de preferência, parte de um sistema de anel de benzeno.

[0027] O contra-íon X+ é, de preferência, selecionado a partir do grupo que consiste em Na+, K+, Li+ e Cs+. O X+também preferido consiste em K+ ou Na+.

[0028] Para uso na presente invenção, cada um dos seguintes termos tem o significado associado ao mesmo nesta seção.

[0029] Os artigos "um" e "uma"são usados no presente documento para se referir a um ou mais do que um (isto é, a ao menos um) do objetivo gramatical do artigo. A título de exemplo, "um marcador " se refere a um marcador ou mais do que um marcador. O termo “ao menos” é usado para indicar que opcionalmente um ou mais objetos adicionais podem estar presentes.

[0030] A expressão “um ou mais” denota 1 a 50, de preferência, 1 a 20, também preferido 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 ou 15.

[0031] Um composto de acordo com a Fórmula I é capaz de ligar íons de cálcio. Sob a ligação ou sob a liberação de cálcio, ocorre uma alteração nas suas características espectrais. Esta alteração nas características espectrais pode ser facilmente medida e está diretamente correlacionada à concentração de íons de cálcio presentes em uma amostra.

[0032] Revelou-se que é vantajoso primeiro ligar todos os íons de cálcio presentes em uma amostra a ser analisada ao composto da Fórmula I. Assim, uma linha de base estável é obtida. Tal linha de base estável é especialmente valiosa para a medição de baixas concentrações de íons de cálcio. Sob a liberação dos íons de cálcio a partir do composto de acordo com a Fórmula I, é induzida uma mudança mensurável em suas características espectrais que pode ser usada para determinar exatamente a concentração de íons de cálcio presentes em uma amostra.

[0033] O composto da Fórmula I pode se ligar de maneira eficaz aos íons de cálcio sobre uma ampla faixa de pH. A ligação de cálcio eficiente pode ser observada a partir de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 11,0. Em uma modalidade, o método de acordo com a presente invenção é praticado sob as condições em que o pH na mistura de ensaio que compreende o composto de acordo com a Fórmula I e a amostra é entre pH 5,0 e pH 11,0. A mistura de reação contém ao menos uma alíquota de uma amostra e um composto de acordo com a Fórmula I. Em modalidades preferidas adicionais, o pH na mistura de reação será a partir de pH 5,0 ou acima, a partir de pH 5,5 ou acima, a partir de pH 6,0 ou acima, a partir de pH 6,5 ou pH 11 ou abaixo, também, pH 10 ou abaixo, pH 9,0 ou abaixo, pH 8,0 ou abaixo.

[0034] A concentração final para um composto de acordo com a Fórmula I é ajustada para ser alta suficiente para a medição confiável de íons de cálcio em uma amostra. Devido à alta sensibilidade alcançada mediante a medição de íons de cálcio com o uso de um composto da Fórmula I, uma amostra clínica como soro ou plasma pode ser diluída, por exemplo, cerca de 100 vezes e ainda ser confiavelmente medida. Conforme é óbvio para um elemento versado na técnica, a concentração final de um composto de acordo com a Fórmula I em uma mistura de ensaio tem que corresponder à concentração final de íons de cálcio na tal mistura de ensaio. Em uma modalidade preferida, o método apresentado será praticado com o uso de um composto de acordo com a Fórmula I em uma concentração final que é ao menos 1,5 vezes o limite superior esperado para a concentração final de íons de cálcio.

[0035] Conforme mencionado, uma amostra que tem 5 mmol/L de íons de cálcio deveria ser confiavelmente medida, isto consiste no limite superior esperado. No caso em que tal amostra é diluída 1:100, a concentração final de íons de cálcio na mistura de ensaio será de 0,05 mmol/L. A concentração final do composto de acordo com a Fórmula I deveria ser ao menos 1,5 vezes esta concentração, isto é, 0,075 mmol/L. Também preferido, a concentração final de um composto de acordo com a Fórmula I em uma mistura de ensaio será ao menos 2 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes e no máximo 20 vezes, 15 vezes ou 10 vezes a concentração de íon de cálcio, conforme calculado para uma amostra que tem o limite superior esperado de 5 mmol/L. Prefere-se que a concentração final de um composto de acordo com a Fórmula I em uma mistura de ensaio seja ao menos 1,5 vezes, 2 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes e no máximo 20 vezes, 15 vezes ou 10 vezes a concentração molar obtida mediante a multiplicação de 5 mmol/L com o fator de diluição para a amostra.

[0036] Revelou-se que a estabilidade em longo prazo na solução de um composto de acordo com a Fórmula I é melhor conservada em um pH de 8,5 ou acima. Prefere-se utilizar um reagente que compreende um composto de acordo com a Fórmula I que não precisa ser recém preparado ou verificado frequentemente acerca se sua funcionalidade, portanto, em uma modalidade, o método de acordo com a reivindicação da presente invenção é praticado com uma solução que compreende o composto da Fórmula I que tem um pH na faixa a partir de pH 8,5 a pH 11,5.

[0037] Em modalidades preferidas alternativas, o método de acordo com a presente invenção é executado com uma solução que compreende o composto da Fórmula I que tem um pH na faixa a partir de pH 8,5 a pH 11,0 ou a partir de pH 9,0 a pH 10,5.

[0038] Em uma modalidade preferida, o método de acordo com a presente invenção é praticado com um composto de acordo com a Fórmula I, em que R1 é hidrogênio ou halogênio.

[0039] Em uma modalidade preferida, o método de acordo com a presente invenção é praticado com um composto de acordo com a Fórmula I, em que R2 é hidrogênio, halogênio, carboxi, morfolino ou alquila.

[0040] Em uma modalidade preferida, o método de acordo com a presente invenção é praticado com um composto de acordo com a Fórmula I, em que R3 é hidrogênio, halogênio, carboxi ou alcoxi.

[0041] Em uma modalidade, um composto de acordo com a Fórmula I para o uso em um método conforme apresentado na presente invenção de preferência, deveria se ligar a íons de cálcio com uma constante de ligação de log k igual a 9,0 ou menor. Por outro lado, a constante de ligação a íons de cálcio descrita como log k deveria ser de ao menos 4,0 ou maior. Prefere- se que a constante de ligação para íons de cálcio dada em log k deve ser entre 4,5 e 8,5, prefere-se também que o log k seja entre 5,0 e 8,0.

[0042] O log k é medido de acordo com o procedimento descrito em Harrison, S.M. e Bers, D.M., Biochimica et Biophysica Acta 925 (1987) 133 - 143. Em resumo, o composto de ligação de cálcio é tamponado ao pH 7,0 em 25mM de tampão Hepes. A temperatura é mantida constante a 20° C. Diversas concentrações de íons de cálcio são incubadas com uma quantidade constante de composto de ligação de cálcio. As frações de íons de cálcio ligados e livres são determinadas e a constante de afinidade calculada com a ajuda de um gráfico de Scatchard.

[0043] Conforme será observado por um elemento versado na técnica, diversas combinações de substituintes são possíveis. Os substituintes podem ser escolhidos e usados para influenciar ou modular a constante de ligação de um composto de acordo com a Fórmula I. Os grupos atraentes de elétrons irão conduzir a uma constante de ligação reduzida, enquanto os grupos doadores de elétron, em geral, irão resultar em uma ligação mais forte de íons de cálcio.

[0044] Prefere-se que os substituintes para o composto da Fórmula I sejam selecionados para resultar em uma constante de ligação, dada como log k, de 7,0 ou menos, prefere-se também uma log k entre 4,0 e 7,0, entre 4,5 e 6,5 ou entre 5,0 a 6,0.

[0045] Também pode ser possível combinar dois ou mais compostos de acordo com a Fórmula I a fim de executar o método de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade preferida, é usado um único composto de acordo com a Fórmula I.

[0046] O método de acordo com a presente invenção tem por base a titulação de retorno, isto é, os íons de cálcio são primeiro ligados ao composto da Fórmula I e liberados posteriormente. A liberação de íons de cálcio a partir do composto de acordo com a Fórmula I é mais facilmente alcançada mediante o uso de um quelante que se liga a íons de cálcio mais forte do que o composto de acordo com a Fórmula I. Em uma modalidade preferida, o quelante usado para a liberação dos íons de cálcio na etapa b) do método apresentado no presente documento acima tem uma constante de ligação que é 10 vezes maior conforme comparado com o composto da Fórmula I usado no método de detecção de cálcio.

[0047] Embora, por exemplo, seja possível combinar um composto de ligação de cálcio de acordo com a Fórmula I com uma log k de 5,0 com um quelante que tem uma log k de 6,0, prefere-se utilizar o quelante que tem ao menos uma log k de 7,0 ou maior. Conforme é óbvio para um elemento versado na técnica, o reagente usado para a liberação de íons de cálcio a partir de um composto de acordo com a Fórmula I é melhor escolhido por ter características espectrais que não interferem com aquelas de interesse, por exemplo, com o espectro de absorção ou emissão de um composto de acordo com a Fórmula I.

[0048] Prefere-se que o reagente/quelante usado para a liberação de cálcio a partir dos compostos de acordo com a Fórmula I, em um método conforme apresentado no presente documento, seja selecionado a partir de derivados de ácido di-, tri-, tetra-acético, ácidos poli-fosfônicos ou derivados de ácido fosfórico, 4,4’-Difluoro-BAPTA, 5,5’-Dibromo-BAPTA, 5,5’- Difluoro- BAPTA, 5-Metil-5’-formil-BAPTA, 5,5’-dimetil-BAPTA, ácido (1,2- Ciclohexilenodinitrilo)tetraacético (CETA), ácido cítrico, ácido nitrilotriacético (NTA), ácido iminodiacético (IDA), ácido N-(2-hidroxietil)iminodiacético (HIDA), ácido N-(2-Hidroxietil)etilenodiamina-N,N',N'-triacético (= HEDTA; CAS 150-390, log k = 8,14), CyDTA (= CAS 125572-95-4, log k = 12,50), TTHA (= CAS 86952-3, log k = 10,06), Me-EDTA (=ácido 1,2-Propanodiamina-N,N,N’,N’- tetraacético, log k = 10,4), BAPTA (= CAS 73630-08-7, log K 6,97), DTPA (=ácido Dietilentriaminopentaacético; CAS-Nr.: 67-43-6, log k =108), EGTA (=ácido etileno glicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N,N-tetraacético; CAS-Nr.: 67-42-5, log k=10,9), DTPMP, (=ácido dietilentriaminpenta(metilenofosfônico); CAS-Nr.: 15827-60-8, log k =10,7) e EDPMP (=ácido etilendiamintetra(metilenofosfônico); CAS-Nr.: 1429-50-1, log k =10,2).

[0049] Prefere-se também que o método de acordo com a presente invenção seja praticado de tal modo que a liberação de íons de cálcio seja disparada por EDTA, DTPA, EGTA, DTPMP e/ou EDPMP.

[0050] A escolha do quelante usado para a liberação de íons de cálcio a partir de um composto de acordo com a Fórmula I não é crítica, contanto que os íons de cálcio ligados ao composto da Fórmula I sejam liberados após a adição de tal quelante. A concentração do quelante na mistura de reação final será, de preferência, ao menos equimolar, mas não maior do que 100 vezes a concentração do composto de acordo com a Fórmula I nesta mistura. Por uma questão de segurança, por exemplo, mediante a compensação de erros mínimos em pipetagem, um excesso de quelante pode ser usado. Em uma modalidade, enquanto se executa o método conforme apresentado no presente documento, a concentração do quelante na mistura de reação final é maior do que a concentração final para o composto da Fórmula I, por exemplo, entre 1,5 vezes e 50 vezes ou, também preferido, entre 2 vezes e 10 vezes.

[0051] Um reagente usado em química clínica de rotina para a medição de íons de cálcio deveria ser estável sob condições de transporte e armazenamento em longo prazo. Revelou-se que um composto de acordo com a Fórmula I não é tão estável em pH neutro ou ácido como sob condições de tampão alcalino. As composições de reagente que compreendem um composto de acordo com a Fórmula I deveriam ter ao menos um pH de 8,5 ou o pH deveria ser maior. Em uma modalidade preferida, a presente invenção apresenta um reagente para a medição de íons de cálcio que tem um pH que se situa em uma faixa a partir de pH 8,5 a pH 11,5, e que contém um composto da Fórmula I, conforme definido na reivindicação 1.

[0052] Em modalidades preferidas alternativas, o reagente de acordo com a presente invenção tem um pH na faixa a partir de pH 8,5 a pH 11,0 ou a partir de pH 9,0 a pH 10,5.

[0053] Os sistemas tampão que são adequados para tamponar uma solução em um pH de 8,5 e/ou maior são bem conhecidos pelos elementos versados na técnica. Prefere-se que tal sistema tampão seja selecionado a partir de AMPD (= 2-Amino-2-Metil-1.3-Propanodiol), CHES (=ácido 2-(N- Ciclohexilamino)-etanossulfônico), AMPSO (=ácido 3- [Dimetil(hidroxilmetil)-metilamino]-2-hidroxiPropanossulfônico), CAPSO (=ácido 3-Ciclohexilamino)-2-hidroxi-1-Propanossulfônico), CAPS (=ácido 3- Ciclohexilamino)-2-Propanossulfônico), um sistema tampão de glicina, ou um sistema tampão de carbonato. Prefere-se também que o reagente para a medição de íons de cálcio de acordo com a presente invenção compreenda um sistema tampão selecionado a partir de CAPS ou CAPSO.

[0054] Conforme mencionado adicionalmente acima, a concentração de cálcio na circulação é rigidamente regulada e as concentrações fisiológicas são entre 2,20 a 2,55 mmol/L. Os níveis elevados de íons de cálcio na circulação chegam de forma muito rara acima de 4 mmol/L. Por esta razão, os reagentes adaptados para medir os íons de cálcio na circulação são usualmente fabricados para abranger uma faixa de medição de até 5 mmol/L. O reagente para a medição de cálcio deveria corresponder às concentrações fisiologicamente relevantes. Na urina, no entanto, as concentrações de cálcio podem variar até uma grande extensão. Isto exige que um ensaio para a medição de cálcio também deva abranger uma grande faixa de medição.

[0055] Em uma modalidade preferida, o reagente para a medição de cálcio compreende um composto da Fórmula I em uma concentração que se situa em uma faixa a partir de 0,10 mmol/L a 50 mmol/L.

[0056] Conforme será observado por um elemento versado na técnica, a concentração final de um composto da Fórmula I na mistura de ensaio, que compreende a amostra a ser medida, precisa corresponder à concentração de íons de cálcio na amostra. Em uma modalidade, a concentração do composto de acordo com a Fórmula I se situará na faixa de 0,10 mmol/L a 2 mmol/L. Em modalidades alternativas, a concentração do composto de acordo com a Fórmula I se situará na faixa a partir de 0,1, 0,125, 0,15 ou 0,2 a 2,0, 1,5 ou 1 mmol/L. Este reagente pode ser misturado com a amostra a ser medida usada sem diluição adicional.

[0057] Em outra modalidade, é fornecido um reagente mais concentrado para a medição de cálcio, com base no composto da Fórmula I. Tal reagente mais concentrado pode ser adequadamente diluído para a medição de uma amostra. A forma concentrada de um reagente de acordo com a presente invenção irá compreender um composto de acordo com a Fórmula I em uma faixa a partir de 0,5 a 50 mmol/L. Em modalidades alternativas, a concentração do composto de acordo com a Fórmula I em um reagente mais concentrado para a detecção de íons de cálcio se situará na faixa a partir de 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1 mmol/L a 50, 40, 30, 20, 15 ou 10 mmol/L.

[0058] Em uma modalidade preferida adicional, o reagente para a medição de cálcio, conforme apresentado na presente invenção, compreende um composto de acordo com a Fórmula I, em que R1 é hidrogênio ou halogênio.

[0059] Em uma modalidade preferida adicional, o reagente para a medição de cálcio, conforme apresentado na presente invenção, compreende um composto de acordo com a Fórmula I, em que R2 é hidrogênio, halogênio, carboxi, morfolino ou alquila.

[0060] Em uma modalidade preferida adicional, o reagente para a medição de cálcio, conforme apresentado na presente invenção, compreende um composto de acordo com a Fórmula I, em que R3 da Fórmula I é hidrogênio, halogênio, carboxi ou alcoxi.

[0061] Revelou-se que também é vantajoso adicionar um detergente a um reagente para a medição de íons de cálcio, isto pode ser devido à redução da interferência de ligação não específica, à redução de espuma e bolhas de ar ou outras influências positivas. Em uma modalidade preferida adicional, a presente invenção se refere a um reagente para a medição de íons de cálcio que tem um pH que se situa em uma faixa a partir de pH 8,5 a pH 11,5, que contém um composto da Fórmula I, conforme definido na reivindicação 1, e um detergente.

[0062] Para uso na presente invenção, o termo “detergente” se refere a um detergente iônico ou não iônico. Os exemplos de detergentes incluem, mas não se limitam a: dodecil sulfato de sódio (SDS), sais de ácido graxo, a família Triton®, octil glicosídeo, 3-[(3-colamidopropil)dimetil- amônio]-1-Propanossulfonato (CHAPS), dodecil maltosídeo de sódio (DM), óxido de laurildietilamina (LDAO), NP-40 e a família Tween®, aminas primárias, cloridratos e acetatos de amina, sais de amônio quaternário, brometo de trimetiletil amônio, amidas de diaminas substituídas, dietanolaminopropilamina ou dietilaminopropilamida, amidas de dietilenotriamina ciclizada, sulfonatos de alquilarila, sulfonatos de petróleo, glicerídeos sulfonatados, colamidas, sulfobetaínas, alquil glicosídeos, saponinas, alquil-polietileno glicol éteres.

[0063] Em uma modalidade, o detergente consiste em um detergente não iônico. Os exemplos não limitadores de detergentes não iônicos são Imbentin V413/91, Thesit, Triton® X-100, Triton® X-114, Brij® 35, Brij® 58, Tween® 20, Tween® 80, Nonidet® P-40, Octyl B Glucoside e MEGA 8-Octanoil-N-metilglucamida. Em uma modalidade, o detergente não iônico é selecionado a partir de Brij® 35, Triton® X-100, Tween® 20 e Nonidet® P-40,

[0064] Conforme mencionado adicionalmente acima, a concentração de íons de cálcio é um parâmetro importante em diagnósticos clínicos de rotina. Os reagentes para medição de cálcio são, de preferência, reunidos na forma de um kit que compreende ao menos um reagente que contém um indicador de cálcio, como os compostos atualmente usados ou um composto de acordo com a Fórmula I, conforme descrito nesta invenção. Em uma modalidade preferida adicional, a presente invenção se refere a um kit de teste para a medição de cálcio, o kit de teste que contém um reagente que compreende um composto de acordo com a Fórmula I e que tem um pH que se situa em uma faixa a partir de pH 8,5 a pH 11,5.

[0065] Em muitos casos, será vantajoso incluir ao menos dois reagentes em um kit adaptado para medir íons de cálcio, um primeiro reagente que compreende um composto de acordo com a Fórmula I e que tem um pH que se situa em uma faixa a partir de pH 8,5 a pH 11,50 e um segundo reagente que compreende um quelante. Em uma modalidade preferida adicional, a presente invenção se refere a um kit que contém um primeiro reagente que compreende um composto de acordo com a Fórmula I e que tem um pH que se situa em uma faixa a partir de pH 8,5 a pH 11,50 e um segundo reagente que compreende um quelante para íons de cálcio. O kit também pode compreender, opcionalmente, uma instrução para uso e/ou um ou mais reagentes adicionais.

[0066] Os seguintes exemplos e figuras são fornecidos para ajudar no entendimento da presente invenção, cujo verdadeiro escopo é apresentado nas reivindicações em anexo. Compreende-se que podem ser feitas modificações nos procedimentos apresentados sem que se desvie do espírito da invenção.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0067] Figura 1: A síntese de NM-BAPTA é descrita de maneira esquemática na Figura 1.

[0068] Figura 2: Medição de íons de cálcio de acordo com o procedimento dado no Exemplo 2, última coluna, sobre o analisador Modular P da Roche Diagnostics, Alemanha. Na parte superior (A), o valor teórico e o valor realmente medido são representados em gráfico um em função do outro. Na parte inferior (B), é dada a % de recuperação, isto é, o valor realmente medido é dado como porcentagem do valor esperado (teórico).

[0069] Figura 3: Medição de íons de cálcio de acordo com o procedimento dado no Exemplo 2, coluna do meio, sobre o analisador cobas c501 da Roche Diagnostics, Alemanha. Na parte superior (A), o valor teórico e o valor realmente medido são representados um em função do outro. Na parte inferior (B), é dada a % de recuperação, isto é, o valor realmente medido é dado como porcentagem do valor esperado (teórico).

[0070] Figura 4: Medição de íons de cálcio de acordo com o procedimento dado no Exemplo 2, última coluna, sobre o analisador Modular P da Roche Diagnostics, Alemanha.

[0071] A concentração de NM-BAPTA tem sido reduzida para 90 % da concentração padrão. Na parte superior (A), o valor teórico e o valor realmente medido são representados um em função do outro. Na parte inferior (B), é dada a % de recuperação, isto é, o valor realmente medido é dado como porcentagem do valor esperado (teórico).

[0072] Figura 5: Medição de íons de cálcio de acordo com o procedimento dado no Exemplo 2, última coluna, sobre o analisador Modular P da Roche Diagnostics, Alemanha. A concentração de NM-BAPTA tem sido reduzida para 80 % da concentração padrão. Na parte superior (A), o valor teórico e o valor realmente medido são representados um em função do outro. Na parte inferior (B), é dada a % de recuperação, isto é, o valor realmente medido é dado como porcentagem do valor esperado (teórico).

[0073] Figura 6: A síntese de NF-BAPTA é descrita de maneira esquemática na Figura 6.

[0074] Figura 7: Os espectros de absorbância para NM-BAPTA e NF-BAPTA, respectivamente, ambos na presença e ausência de íons de cálcio, respectivamente, são dados. A chave para os quatros espectros é dada embaixo da figura.

EXEMPLO 1 Síntese de NM-BAPTA

[0075] A síntese de NM-BAPTA é descrita de maneira esquemática na Figura 1. a) 1-(2-Cloro-etoxi)-2-nitro-benzeno

[0076] 2-Nitro-fenol (168,7 g) e 2-cloroetil éster do ácido tolueno-4- sulfônico (100 g) foram dissolvidos em 500 ml DMF e foram agitados por 1 h a 110 a 120°C, após a adição cuidadosa de 199 g de carbonato de potássio. A mistura de reação foi derramada em uma mistura de gelo triturado e água (8 l), a qual foi vigorosamente agitada. O resíduo foi removido por filtração, lavado várias vezes com água e seco.

[0077] Rendimento: 100 a 120 g b) 4-Metil-1-nitro-2-(2-(2-nitro-fenoxi)-etoxi)-benzeno

[0078] 1-(2-Cloro-etoxi)-2-nitro-benzeno (116 g) e 5-metil-2-nitro- fenol (88 g) foram dissolvidos em 500 ml DMF e foi agitado por 4 h a 90 a 110 °C, após a adição cuidadosa de 160 g de carbonato de potássio. A mistura de reação foi derramada em uma mistura de gelo triturado e água (8 l), a qual foi vigorosamente agitada. O resíduo foi removido por filtração, lavado várias vezes com água e seco. O produto bruto foi suspenso em metanol e o resíduo amarelo pálido foi novamente removido por filtração, lavado com metanol e seco.

[0079] Rendimento: 150 a 165 g. c) 2-(2-(2-Amino-fenoxi)-etoxi)-4-metil-fenilamina

[0080] 100 g de 4-metil-1-nitro-2-(2-(2-nitro-fenoxi)-etoxi)-benzeno e 10 g de paládio em carvão vegetal foram suspensos em 3,5 l de dioxano e hidrogenados em temperatura ambiente, sob uma pressão de hidrogênio de 5,5 bar. Após a vaporização três vezes com nitrogênio, o catalisador foi removido por filtração sob uma atmosfera de nitrogênio e a solução restante foi evaporada e o produto foi seco sob vácuo.

[0081] Rendimento: 80 g d) éster metílico do ácido ((2-(2-(2-(Bis-metoxicarbonilmetil-amino)- fenoxi)-etoxi) -4-metil- fenil)-metoxicabonilmetil-amino)-acético

[0082] 2-(2-(2-Amino-fenoxi)-etoxi)-4-metil-fenilamina (80 g) foram dissolvidos em 2,5 l de DMF e 285 ml de éster metílico do ácido bromo-acético, 429 g de carbonato de potássio e 36,8 g de iodeto de sódio foram adicionados. A mistura de reação foi aquecida até 80 °C por 2 h. Após a evaporação, o éster metílico do ácido bromo-acético restante foi removido a partir do produto com hexano. O produto bruto foi adicionalmente purificado por meio de cristalização em metanol.

[0083] Rendimento: 93 g e) éster metílico do ácido ((2-(2-(2-(Bis-metoxicarbonilmetil-amino)- 5-nitro-fenoxi)-etoxi)-4- metil-fenil)-metoxicabonilmetil-amino)-acético

[0084] 50 g de éster metílico do ácido ((2-(2-(2-(Bis- metoxicarbonilmetil-amino)-fenoxi)-etoxi)-4-metilfenil)-metoxicabonilmetil- amino)-acético foram dissolvidos em 600 ml de ácido acético glacial. Sob agitação vigorosa, 91,5 ml 1 molar de ácido nítrico em ácido acético glacial foi adicionado e, em uma segunda etapa, 28 ml de ácido sulfúrico concentrado foi adicionado. A temperatura aumentou até 30 °C. A mistura de reação foi diretamente derramada em uma mistura de gelo/água de 10 l. O resíduo foi removido por filtração, lavado várias vezes com água e seco sob vácuo. O produto bruto foi adicionalmente purificado por meio de cromatografia de coluna em sílica gel, primeiro com hexano /éster etílico de acético ácido (1:1) como eluente e um segundo momento com tolueno/acetonitrila (1:1) como eluente. O produto foi finalmente cristalizado a partir de propan-2-ol.

[0085] Rendimento: 20 g f) NM-BAPTA; Sal de potássio de ácido ((2-(2-(2-(bis-carboximetil- amino)-5-nitrofenoxil)-etoxi)-4-metil-fenil)-carboximetil-amino)-acético

[0086] 9,5 g de éster metílico do ácido ((2-(2-(2-(Bis- metoxicarbonilmetil-amino)-5-nitro-fenoxi)-etoxi)-4-metil- fenil)- metoxicabonilmetil-amino)-acético foram dissolvidos em uma mistura de água/metanol (230 ml cada) e 160 ml 1 molar de solução de hidróxido de potássio foi adicionado. A mistura de reação foi refluxado por 1 h. Após o resfriamento até a temperatura ambiente e a adição de 250 ml de água, o pH da solução foi ajustado para pH 3 e o metanol foi evaporado. O produto foi isolado por meio de extração de solvente com solução ácida de éster etílico de ácido. Após a evaporação, o produto foi seco sob vácuo.

[0087] O ácido ((2-(2-(2-(bis-carboximetil-amino)-5-nitro- fenoxil)-etoxi)-4-metilfenil)-carboximetil-amino)-acético foi dissolvido em metanol e o hidróxido de potássio equimolar em metanol foi adicionado. Após a evaporação e a secagem, o sal de potássio adequada poderia ser isolado.

[0088] Rendimento: 9 g

EXEMPLO 2 PROCEDIMENTO GERAL PARA A MEDIÇÃO DE ÍONS DE CÁLCIO COM NM-BAPTA

[0089] A medição de íons de cálcio com um composto do tipo mono-nitro-BAPTA de acordo com a Fórmula I é executada em um método de titulação de retorno.

[0090] Uma alíquota da amostra de interesse é misturada com uma solução que compreende o composto do tipo mono-nitro-BAPTA e incubada. Nos analisadores automáticos da Roche Diagnostics, Alemanha, este reagente é chamado de R1. A incubação é executada até que um sinal de linha de base estável seja obtido. Usualmente, um sinal de linha de base estável é obtido em menos do que 10 min, geralmente, dentro de 2 a 5 min.

[0091] A mistura de amostra e R1 (opcionalmente diluída, por exemplo, com água destilada) é, então, analisada, isto é, os valores de absorbância estão no(s) comprimento(s) de onda mais adequado(s) ou um espectro é medido.

[0092] Os íons de cálcio ligados a um composto de acordo com a Fórmula I são, então, liberados mediante a adição de um agente de liberação, por exemplo, EDTA. Este segundo reagente é chamado de R2 nos analisadores automáticos da Roche Diagnostics, Alemanha. Onde exigido, a mistura pode ser adicionalmente diluída com água destilada.

[0093] A mistura final de amostra, R1 e R2 (opcionalmente diluída, por exemplo, com água destilada) é, então, analisada, isto é, os valores de absorbância estão no(s) comprimento(s) de onda mais adequado(s) ou um espectro é medido.

[0094] A alteração na absorbância está diretamente correlacionada à concentração de íons de cálcio na amostra de interesse e a concentração de íons de cálcio é calculada de acordo com os procedimentos padrão.

[0095] Na tabela I, é dada uma visão geral sobre as aplicações recomendadas para a medição de íons de cálcio em cinco analisadores automáticos diferentes da Roche Diagnostics, Alemanha. As aplicações recomendadas para o analisador Modular P e Modular D são idênticas. TABELA 1: VOLUMES DE PIPETA RECOMENDADOS (EMμL) PARA A MEDIÇÃO DE ÍONS DE CÁLCIO

HiCo R1 = alta concentração de reagente R1; LoCo R1 = baixa concentração de reagente R1; Integra, cobas, Roche/Hitachi 902, Modular D, e Modular P são sistemas analisadores distribuídos pela Roche Diagnostics, Alemanha. TABELA 2 COMPOSIÇÕES DE HICO R1, LOCO R1 E R2, RESPECTIVAMENTE

EXEMPLO 3 LINEARIDADE DA MEDIÇÃO DE CÁLCIO COM O USO DE NM-BAPTA

[0096] O método para a medição de íons de cálcio apresentado na presente invenção é tecnicamente excelente, por exemplo, mostra uma precisão muito alta. Isto se trona evidente, por exemplo, se os valores realmente medidos e teoricamente esperados forem comparados.

[0097] As diferentes concentrações de íons de cálcio (^valores teóricos) são comparadas com os valores reais medidos no novo método.

[0098] Somente dois exemplos representativos, com valores medidos em dois analisadores diferentes, Modular P e cobas c501 (ambos distribuídos pela Roche Diagnostics), respectivamente, são dados como as Figuras 2 e 3. Estas duas figuras demonstram a excelente qualidade/precisão técnica das medições. Conforme é óbvio a partir das Figuras 2 e 3, todos os valores realmente medidos estão dentro de 95 a 105% do valor teórico esperado correspondente, o qual se converte para uma medição, de preferência, exata de íons de cálcio sobre toda a faixa de concentrações investigadas.

EXEMPLO 4 Determinação da concentração mínima de NM-BAPTA

[0099] A concentração de íons de cálcio na circulação excede 4 mmol/L somente de forma rara. Um reagente capaz de medir até 5 mmol/L de cálcio de uma maneira confiável deveria ser mais adequado para determinar os íons de cálcio na circulação.

[00100] Diversas concentrações de íons de cálcio (valores esperados nas Figuras 4 e 5) têm sido medidas no instrumento Modular P com o pedido descrito na última coluna da Tabela 1. No entanto, somente 90 % ou 80 %, respectivamente, da concentração regular de NM-BAPTA tem sido usada. Conforme pode ser observado a partir das Figuras 4 e 5, respectivamente, mesmo se somente 80 % de NM-BAPTA estiverem presentes na mistura de detecção, conforme comparado com o procedimento padrão dado no Exemplo 2, os íons de cálcio até 5 mmol/L ainda são recuperados em entre 95 a 105 %. Conforme é óbvio a partir da Figura 5, os valores acima de 5 mM tendem a ser recuperados com valores baixos demais se a concentração de NM-BAPTA for reduzida para 80 %. Isto significa que para a medição das altas concentrações de cálcio, conforme presente em algumas amostras patológicas (no caso em que tal amostra é diluída cerca de 1:70 conforme no exemplo acima), a concentração final de NM-BAPTA deveria ser de cerca de 0,2 mmol/L a fim de assegurar uma medição correta de íons de cálcio naquelas amostras.

EXEMPLO 5 ESTABILIDADE DEPENDENTE DE PH DE NM-BAPTA

[00101] Um reagente para a medição de cálcio deveria ser tão estável quanto possível, tanto sob condições de transporte como integrado em um analisador.

[00102] Com a finalidade de investigar sua estabilidade, NM- BAPTA tem sido armazenado em diferentes valores de pH. Um modelo de estresse em curto prazo tem sido aplicado e o reagente que contém NM-BAPTA armazenado a 35°C. O reagente “estressado” tem sido usado na medição de íons de cálcio sob condições de outra forma idênticas com o uso de alíquotas das mesmas amostras. Os valores medidos após o estresse do reagente têm sido comparados com os valores medidos com um reagente não estressado no dia zero, isto é, o dia quando o estresse de temperatura sobre o reagente foi iniciado.

[00103] Os sistemas tampão usados foram 100mmol/L de HEPES em pH 7,4, 50 mmol/L de Tris um pH 8,0, 50 mmol/L de NaHCO3 em pH 10,0, 50 mmol/L de glicina em pH 9,8 e 40 mmol/L de CAPSO em pH 10, respectivamente. Os dados correspondentes são resumidos nas Tabelas 3 a 7. TABELA 3 ESTABILIDADE DE NM-BAPTA EM 100 MMOL/L DE HEPES PH7,4 A 35 °C

[00104] Conforme é óbvio a partir da Tabela 3, o reagente que contém NM-BAPTA não é estável em pH 7,4. A recuperação de íons de cálcio é somente na faixa de 80% ou abaixo. TABELA 4 ESTABILIDADE DE NM-BAPTA EM 50 MMOL/L DETRIS PH8,0 A 35 °C

[00105] Conforme é óbvio a partir da Tabela 4, o reagente que contém NM-BAPTA tem um limite, mas estabilidade ainda aceitável em pH 8,0, A recuperação de íons de cálcio é principalmente na faixa de 80 % a 90 %.

TABELA 5 ESTABILIDADE DE NM-BAPTA EM 50 MMOL/L DE NAHCO3 PH10,0 A 35 °C

TABELA 6 ESTABILIDADE DE NM-BAPTA EM 50 MMOL/L DE GLICINA PH9,8 A 35 °C

TABELA 7 ESTABILIDADE DE NM-BAPTA EM 40 MMOL/L DE CAPSO, PH10,0 A 35 °C

[00106] Conforme é óbvio a partir das Tabelas 5 a 7, o reagente apresentado no presente pedido tem uma excelente estabilidade em um pH em torno de 10. A recuperação de íons de cálcio após o estresse de tal reagente a 35°C por uma semana é excelente e grane no faixa desejada entre 90 % a 110 %, principalmente, até entre 95 % e 105 %. Esta alta estabilidade pode ser alcançada independentemente do sistema tampão usado.

EXEMPLO 6 NENHUMA INTERFERÊNCIA POR MAGNÉSIO NAS MEDIÇÕES DE CÁLCIO COM O USO DE NM-BAPTA

[00107] Uma amostra que compreende íons de cálcio em uma concentração fisiológica de 2,53 mmol/L tem sido reforçada com 0 a 15 mmol/L de íons de magnésio. As amostras reforçadas foram medidas em um analisador Roche/Hitachi 917 em uma aplicação conforme dado no Exemplo 2 para o Modular P. Os resultados médios das determinações triplas são dados na Tabela 8 abaixo. TABELA 8 NENHUM EFEITO SOBRE AS MEDIÇÕES DE ÍON DE CÁLCIO POR ÍONS DE MAGNÉSIO

[00108] Conforme é óbvio a partir dos valores de recuperação dados na Tabela 8, no experimento acima, os íons de magnésio não interferem com a medição de íons de cálcio.

EXEMPLO 7 NENHUMA INTERFERÊNCIA POR GADOLÍNIO EM MEDIÇÕES DE CÁLCIO COM O USO DE NM-BAPTA

[00109] Uma amostra que compreende íons de cálcio em uma concentração fisiológica de cerca de 2,35 mmol/L, assim como uma amostra com nível elevado de íons de cálcio de cerca de 3,40 mmmol/L, tem sido reforçada com diferentes níveis de Omniscan® (C1: 14 μL ad 986 μL, C2: 2,8 μL ad 997 μL). Omniscan® consiste em um agente de contraste frequentemente usado que compreende gadolínio. As amostras reforçadas têm sido medidas em um analisador Hitachi 917 em uma aplicação conforme dado no Exemplo 2 para Modular P. Os resultados médios da determinação tripla são dados na Tabela 9 abaixo. TABELA 9 NENHUM EFEITO SOBRE AS MEDIÇÕES DE ÍON DE CÁLCIO POR ÍONS DE GADOLÍNIO

[00110] Conforme é óbvio a partir dos valores de recuperação dados na Tabela 9, no experimento acima, os íons de gadolínio não interferem com a medição de íons de cálcio, devido ao fato de que todos os valores medidos estão bem com a faixa de recuperação de 95 a 105 %.

EXEMPLO 8 SÍNTESE DE NF-BAPTA

[00111] A síntese de NF-BAPTA é descrita de maneira esquemática na Figura 6. a) 1-(2-Cloro-etoxi)-2-nitro-benzeno

[00112] Vide Exemplo 1 b) 4-Fluoro-1-nitro-2-(2-(2-nitro-fenoxi)-etoxi)-benzeno

[00113] 1-(2-Cloro-etoxi)-2-nitro-benzeno (10 g) e 5-fluoro-2-nitro- fenol (7,86 g) foram dissolvidos em 50 ml DMF e foi agitado por 19 h a 90 a 110°C, após a adição cuidadosa de 13,82 g de carbonato de potássio. A mistura de reação foi derramada em uma mistura de gelo triturado e água (500 ml), a qual foi vigorosamente agitada. O resíduo foi removido por filtração, lavado várias vezes com água e seco. O produto bruto foi suspenso em metanol e o resíduo amarelo pálido foi novamente removido por filtração, lavado com metanol e seco.

[00114] Rendimento: 9,5 g. c) 2-(2-(2-Amino-fenoxi)-etoxi)-4-fluoro-fenilamina

[00115] 9,48 g de 4-fluoro-1-nitro-2-(2-(2-nitro-fenoxi)-etoxi)- benzeno e 1,5 g de paládio em carvão vegetal foram suspensos em 500 ml de dioxano e 60 ml de ácido acético glacial e hidrogenados em temperatura ambiente. Após a vaporização três vezes com nitrogênio, o catalisador foi removido por filtração sob uma atmosfera de nitrogênio e a solução restante foi evaporada e o produto foi seco sob vácuo.

[00116] Rendimento: 7,52 g d) éster metílico do ácido ((2-(2-(2-(Bis-metoxicarbonilmetil-amino)- fenoxi)-etoxi)-4-fluoro -fenil)-metoxicabonilmetil-amino)-acético

[00117] 2-(2-(2-Amino-fenoxi)-etoxi)-4-fluoro-fenilamina (7,52 g) foram dissolvidos em 250 ml de DMF e 38,4 ml de éster metílico do ácido bromo- acético, 56 g de carbonato de potássio, e 2,13 g iodeto de sódio foram adicionados. A mistura de reação foi aquecida até 80°C por 21 h. Após a evaporação, o éster metílico do ácido bromo-acético restante foi removido a partir do produto com hexano. O produto bruto foi adicionalmente purificado por meio de cristalização em metanol.

[00118] Rendimento: 4,14 g e) éster metílico do ácido ((2-(2-(2-(Bis-metoxicarbonilmetil-amino)- 5-nitro-fenoxi)-etoxi)-4- fluoro-fenil)-metoxicabonilmetil-amino)-acético

[00119] 2,5 g de éster metílico do ácido ((2-(2-(2-(Bis- metoxicarbonilmetil-amino)-fenoxi)-etoxi)-4-fluorofenil)-metoxicabonilmetil- amino)-acético foram dissolvidos em 30 ml de ácido acético glacial. Sob agitação vigorosa, 4,54 ml 1 molar de ácido nítrico em ácido acético glacial foi adicionado e, em uma segunda etapa, 11,35 ml de ácido sulfúrico concentrado foi adicionado. A temperatura aumentou até 30°C. A mistura de reação foi diretamente derramada em uma mistura de gelo/água de 250 ml. O resíduo foi removido por filtração, lavado várias vezes com água e seco sob vácuo. O produto bruto foi adicionalmente purificado por meio de cromatografia de coluna em sílica gel primeiro com hexano /éster etílico de ácido acético (1:1) como eluente e em um segundo momento com tolueno/acetonitrila (1:1) como eluente.

[00120] Rendimento: 0,82 g f) NM-BAPTA; Sal de potássio do ácido ((2-(2-(2-(bis-carboximetil- amino)-5-nitrofenoxil)-etoxi)-4-fluoro-fenil)-carboximetil-amino)-acético

[00121] 0,82 g de éster metílico do ácido ((2-(2-(2-(Bis- metoxicarbonilmetil-amino)-5-nitro-fenoxi)- etoxi)-4-mfluoro-fenil)- metoxicabonilmetil-amino)-acético foram dissolvidos em uma mistura de água/metanol (20 ml cada) e 13,77 ml 1 molar de solução de hidróxido de potássio foi adicionado. A mistura de reação foi refluxada por 1 h. Após o resfriamento até a temperatura ambiente e a adição de 250 ml de água, o pH da solução foi ajustado para pH 3 e o metanol foi evaporado. O produto foi isolado por meio de extração de solvente com solução ácida de éster etílico de ácido. Após a evaporação, o produto foi seco sob vácuo.

[00122] O ácido ((2-(2-(2-(bis-carboximetil-amino)-5-nitro-fenoxil)- etoxi)-4-fluorofenil)-carboximetil-amino)-acético foi dissolvido em metanol e o hidróxido de potássio equimolar em metanol foi adicionado. Após a evaporação e a secagem, o sal de potássio adequado poderia ser isolado.

[00123] Rendimento: 0,75 g

EXEMPLO 9 LIGAÇÃO DE ÍONS DE CÁLCIO A NF-BAPTA

[00124] As características de absorbância de NF-BAPTA na presença e ausência de íons de cálcio foram analisadas com o uso de um fotômetro Uvikon 930. Os espectros de absorbância foram tomados com 0,15 mmol/L de NM-BAPTA ou NF-BAPTA, respectivamente, em 50 mmol/L de CAPSO (em pH 7), 0,9% de NaCl e 0,01% de Brij-35 na ausência ou na presença de 0,09 mmol/L de Ca2+, respectivamente.

[00125] Conforme mostrado na Figura 7, os espectros de absorbância para NM-BAPTA ou NF-BAPTA, respectivamente, são muito parecidos, indicando que ambos os compostos, isto é, os compostos de acordo com a Fórmula I, em geral, podem ser usados na medição de íons de cálcio.

Claims

1. MÉTODO PARA DETERMINAR A CONCENTRAÇÃO DE ÍONS DE CÁLCIO, em uma amostra, caracterizado por compreender as etapas de: (a) misturar uma amostra com uma solução, formando assim uma mistura, a solução possuindo um pH em uma faixa a partir de 9,0 a 10,5 e compreendendo um composto que possui a estrutura química representada pela Fórmula I

em que R1 é selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, halogênio selecionado a partir de Cl, Br e F, carboxi, alquila C1-C3 e formila, R2 é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, halogênio selecionado a partir de Cl, Br e F, alquila C1-C3, alcoxi C1-C2, morfolino, CN, carboxi e formila, R3 é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, halogênio selecionado a partir de Cl, Br e F, sulfato de N-alquila, carboxi, alcoxi C1-C2, fenila, CN, CF3 e butila terciária, R4 é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, halogênio selecionado a partir de Cl, Br e F, ou alquila C1-C3, R5 e R7 são independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em hidrogênio ou alquila C1-C3, R6 é selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, alquila C1-C3, alcoxi C1-C2 e halogênio selecionado a partir de Cl, Br e F, ou em que R3 e R4 formam uma ponte aromática e a solução compreende adicionalmente X+ que é um contra-íon positivamente carregado; (b) incubar a mistura por um período de tempo, no qual íons de cálcio na amostra se liga ao composto; (c) medir o valor da absorbância da linha de base da mistura; (d) adicionar um agente de liberação à mistura, em que o agente de liberação é um agente quelante de cálcio que tem, a 20 °C, uma constante de ligação para íons de cálcio de log k igual a 7,0 ou mais; (e) incubar a mistura da amostra, a solução, e o agente de liberação por um período de tempo, no qual íons de cálcio são liberados a partir do composto; (f) medir um valor da segunda absorbância da mistura da amostra, a solução, e o agente de liberação; (g) calcular uma diferença entre o valor da absorbância da linha de base e o valor da segunda absorbância; e (h) determinar uma concentração de íons de cálcio da amostra com base na referida etapa de calcular.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo R1 da Fórmula I ser selecionado do grupo consistindo em hidrogênio e halogênio selecionado a partir de Cl, Br e F.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo R2 da Fórmula I ser selecionado do grupo consistindo em hidrogênio, halogênio selecionado a partir de Cl, Br e F e alquila C1-C3.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo R3 da Fórmula I ser selecionado do grupo consistindo em hidrogênio, halogênio selecionado a partir de Cl, Br e F, carboxi e alcoxi C1-C2.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela solução possuir um pH na faixa a partir de 9,8 a 10,0.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo agente de liberação ser selecionado a partir do grupo consistindo em EDTA, DTPA, EGTA, DTPMP e EDPMP.

7. REAGENTE PARA MEDIÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE ÍONS DE CÁLCIO, em uma amostra, caracterizado por compreender uma solução aquosa possuindo um pH na faixa a partir de 9,0 a 10,5, um contra-íon positivamente carregado, e um composto tendo uma estrutura química representada pela Fórmula I, conforme definido na reivindicação 1.

8. REAGENTE, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por compreender o composto em uma concentração variando a partir de 0,10 mM a 2,0 mM.

9. REAGENTE, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por compreender um sistema tampão, em que o sistema tampão é selecionado a partir do grupo que consiste em AMPD (2-amino-2-metil-1,3- propanodiol), CHES (ácido 2-(N-ciclohexilamino)-etanossulfônico), AMPSO (ácido 3-[dimetil(hidroxilmetil)metilamino]-2-hidroxipropanossulfônico), CAPSO (ácido 3-ciclohexilamino)-2-hidroxi-1-propanossulfônico), CAPS (ácido 3- ciclohexilamino)-2-propanossulfônico), um sistema tampão de glicina e um sistema tampão de carbonato.

10. REAGENTE, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo R1 da Fórmula I ser selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio e halogênio selecionado a partir de Cl, Br e F.

11. REAGENTE, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo R2 da Fórmula I ser selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, halogênio selecionado a partir de Cl, Br e F e alquila C1-C3.

12. REAGENTE, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo R3 da Fórmula I ser selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, halogênio selecionado a partir de Cl, Br e F, carboxi e alcoxi C1C2.

13. KIT DE TESTE, para a medição da concentração de íons de cálcio em uma amostra, caracterizado por compreender: um reagente que compreende uma solução aquosa possuindo um pH na faixa a partir de 9,0 a 10,5, um contra-íon positivamente carregado, e um composto tendo uma estrutura química representada pela Fórmula I, conforme definido na reivindicação 1, e um agente de liberação, o agente de liberação tendo, a 20 °C, uma constante de ligação para íons de cálcio de log k igual a 7,0 ou mais.

14. KIT, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo reagente compreender o composto em uma concentração variando a partir de 0,10 mM a 2,0 mM.