KR101495970B1

KR101495970B1 - 칼슘 이온의 측정 방법

Info

Publication number: KR101495970B1
Application number: KR1020127025392A
Authority: KR
Inventors: 한스-페터 요젤; 한스-요아힘 키치아; 마티아스 뮈케
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2010-03-30
Filing date: 2011-03-28
Publication date: 2015-02-25
Also published as: AU2011234646B2; BR112012020015A2; CN102834721B; HK1175241A1; MX2012010759A; EP2553469A1; CN102834721A; SG183826A1; KR20120135291A; CA2794386A1; BR112012020015B1; JP5631480B2; ES2532991T3; US20130023055A1; CA2794386C; JP2013524187A; US8962338B2; WO2011120913A1; AU2011234646A1; EP2553469B1

Abstract

본 발명은 칼슘 측정용 시약 및 상기 시약을 사용하는 측정 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 모노-니트로 치환된 BAPTA-유형 킬레이터 (BAPTA = 1,2-비스(2-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산) 을 포함하는 칼슘 측정용 시약에 관한 것이다. 샘플, 예컨대 혈액 샘플 (예, 전혈, 혈장 또는 혈청) 또는 임의의 다른 수성 액체 샘플 (예, 뇌척수액, 림프, 타액 또는 소변) 에서의 칼슘의 정확한 측정을 가능하게 하는 측정 방법은 따라서 특히 상술된 임상적 진단에 유용하다.

Description

칼슘 이온의 측정 방법 {METHOD FOR MEASUREMENT OF CALCIUM IONS}

혈액 또는 혈청 칼슘 수준 각각은 진단상 유의한 가치가 있고, 중요한 치료적 의미를 가질 수 있다.

칼슘 이온에 대한 참조 범위는 매우 좁은 2.20 내지 2.55 mmol/ℓ이고, 상하한값의 약간의 편차는 여러 생리적 질병의 진단이다. 고칼슘혈증 (상승된 혈청 칼슘) 과 관련된 가장 통상적인 질환 둘은 부갑상선 기능항진증 및 악성 종양이고, 특히 악성 종양이 뼈대로 전이되고 뼈 흡수를 야기하는 경우이다 (즉, 전이성 병변의 부위로부터 칼슘의 방출을 수반하는 뼈의 국소 파괴). 감소된 혈청 칼슘 수준 (저칼슘혈증) 은 통상적으로 부갑상선 기능저하증과 연관된다. 신생아의 약 1 % 는 즉각적인 의학적 개입을 필요로 하는 자극감수성, 연축 및 경련과 같은 증상을 갖는 유의한 저칼슘혈증 (혈청 칼슘 <1.75 mmol/ℓ) 을 갖는다.

마그네슘은 칼슘과 같이 신체에서 발견되는 주요 원소들 중 하나이다. 마그네슘 수준의 감소는 또한 칼슘의 감소된 수준으로 발견되는 것들과 매우 유사한 임상 증상을 유도한다. 낮은 혈청 칼슘 및 낮은 혈청 마그네슘의 거의 동일한 임상 증상을 고려해 볼 때, 원소가 임상 증상을 야기한다는 것을 기술하는 것은 불가피하다. 종종 혈청 칼슘 및 마그네슘 측정 둘 모두는 원소 또는 경우에 따라서 원소 둘 모두가 정상 범위 밖에 있는지를 측정하는데 필요하고, 마그네슘이 칼슘을 수량화하는데 방해하지 않아야 한다.

칼슘 및 마그네슘 측정을 위한 참고 방법 각각은 원자 흡수이다. 일상적인 측정의 경우, 원자 흡수가 다소 불편하고, 충분한 정확성 및 재현성을 달성하기 위한 어세이를 수행하기 위해 고가의 기기장치 및 상당한 기술자를 필요로 한다.

특정 효소의 촉매 활성이 칼슘 이온의 존재에 강하게 의존하므로, 칼슘-의존 효소 활성의 측정을 통해 칼슘의 수량화를 가능하게 한다. 효소 절차에 기초한 칼슘 이온 측정 방법은 예를 들어 US 6,068,971 에 기술되어 있다.

칼슘 측정을 위한 임상 실험 일상에 자주 사용되는 현재 방법은 킬레이트화, 색-형성제, 예컨대 오르토-크레졸프탈레인 컴플렉손 (o-CPC), 아르세나조 III, 포스포나조 또는 클로로포스포나조를 채용하는 절차에 기초한다. 상기 방법들 중 하나 이상이 실험실의 임상적 일상에서 종종 사용되나, 각각에는 결점들이 있다.

o-CPC 방법의 감도는 pH 에 매우 의존적이다. 최대 감도의 경우, 반응은 약 pH 10.7 에서 수행된다. 그러나 상기 알칼리 pH 값에서 시약은 주위 이산화탄소를 쉽게 흡수한다. 물과 조합하여 탄산을 형성하는 이산화탄소의 흡수는 서서히 시약 pH 를 감소시켜서 결국 칼슘 측정에 비기능성인 시약이 되게 한다. pH 의 점진적인 변화는 또한 정확한 측정을 보장하기 위해서 더욱 빈번한 교정 작업을 필요로 한다. 또한, o-CPC 는 상당히 비선택적이고, 마그네슘과 다른 금속, 예컨대 가돌리늄을 결합시킨다. 혈청에서 통상 직면하는 수준에서의 마그네슘 방해를 없애기 위해서, 8-히드록시퀴놀린을 첨가하여 마그네슘을 킬레이트화시킨다.

아르세나조 III 에 기초하는 칼슘 측정 방법은 o-CPC 방법에 내재하는 높은 pH 및 마그네슘 방해 (측정 pH 에 따름) 의 문제를 겪지 않는다. 아르세나조 III 은 약산성 조건, 예를 들어 pH 5 내지 6 에서 칼슘을 결합시키고, 칼슘 측정이 pH 7 미만에서 행해지는 경우, 마그네슘의 결합은 미미하다. 아르세나조 III 가 o-CPC 방법의 많은 단점을 없애더라고, 상당히 낮은 감도 및 환경적 우려를 일으킨다. 아르세나조 III 각 mole 은 2 mole 의 비소를 함유하고, 아르세나조 III 시약의 처리는 비소를 갖는 물 공급물의 오염의 우려 때문에 많은 나라에서 중대한 문제이다.

JP-A-04-120464 에는 칼슘 및 마그네슘이 클로로포스포나조-III 를 킬레이트화 및 색-형성제로서 사용함으로써 동시에 수량화될 수 있다는 것이 개시되어 있다. 클로로포스포나조-III 경우에 있어서, 색 변화에 가장 적합한 pH 범위는 약산성이고 클로로포스포나조-III 는 비소가 없는 시약이다. 따라서, 클로로포스포나조-III 는 높은 pH 및 독성에 의해 야기되는 문제점들에 관해 유리하다. 그러나, 클로로포스포나조-III 를 사용하는 마그네슘 및 칼슘의 동시 수량화는 문제점을 제기한다. 이러한 킬란트는 보통 샘플에 첨가되어 마그네슘 및 칼슘 둘 모두를 결합시킴으로써 착색을 야기한다. 그 후, EGTA 가 첨가되어 오로지 결합 칼슘만을 방출하고, 이러한 방출은 색 변화를 야기한다. 그리고 나서 칼슘은 색 변화를 기초로 칼슘을 수량화한다. 클로로포스포나조-III 는 또한 높은 공시험 값을 제공하는 경향이 있어서, 이러한 사실은 칼슘 이온의 측정이 가능한 농도 범위를 제한한다.

BAPTA-유형 칼슘-킬레이트제가 기술되어 왔고, 완충계로서 예를 들어 세포 내의 칼슘 이온의 농도를 제어하기 위해 사용되어 왔다. Pethig, R. 등에 의한 (Cell calcium 10 (1989) 491-498) 에서는 7 개의 상이한 BAPTA-유형 칼슘 완충액의 해리 상수를 측정하였다. 그들은 칼슘을 이용하는 생리적 작용에서 디브로모-BAPTA 를 사용하는 것을 제안한다.

상기 논의된 바와 같이, 칼슘 이온 측정을 위한 여러 어세이 방법은 임상적 일상에서 공지되어 있다. 킬레이트화 및 색-형성제의 사용에 기초한 칼슘 측정용 여러 시약이 시판되고, 각각에는 추가 개선을 위한 여지가 남아있다.

따라서, 분석 샘플에서 칼슘을 양적으로 측정하는 시약 및 방법에 대해 충족되지 않은 요구가 있다. 이상적인 방법은 a) 저장 조건 하에 및 분석기 판에서 안정하고, b) 예를 들어 비소와 같은 독성 원소를 함유하지 않으며, c) 비교적 낮은 시약 공시험 흡광도를 갖고, d) 마그네슘 이온 또는 다른 금속 이온, 예컨대 가돌리늄에 결합하지 않으며, e) 신속한 측정 및 높은 샘플 처리량을 가능하게 하고, 및 f) 넓은 측정 범위에 걸친 칼슘 이온의 정확한 측정을 유도하는 킬레이터에 기초해야만 한다.

놀랍게도 BAPTA-유형 킬레이터의 모노-니트로-유도체가 칼슘 이온 측정에 매우 적절한 꽤 유리한 특성을 나타낸다는 것을 밝혀내었다.

발명의 요약

본 발명은 칼슘 이온 측정에 매우 유용하고 다른 긍정적 측면 중에서도 우수한 저장 안정성을 갖고, 비소에 의한 환경 오염 문제가 없으며, 마그네슘 또는 가돌리늄에 의한 방해를 나타내지 않고, 광범위한 농도에 대해 신속정확한 칼슘 측정을 가능하게 하는 시약을 제공한다.

본 발명은 샘플에서 칼슘 이온의 농도를 측정하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 모노-니트로-BAPTA-유형 킬레이터를 포함하는 용액을 샘플과 혼합시킴으로써 칼슘 이온을 모노-니트로-BAPTA-유형 킬레이터에 결합시키는 단계, 칼슘 이온을 모노-니트로-BAPTA-유형 킬레이터로부터 방출시키는 단계 (상기 방출은 모노-니트로-BAPTA-유형 킬레이터의 흡광도 변화를 야기함), 흡광도 변화를 측정하는 단계 및 측정된 흡광도 변화를 이용하여 칼슘 이온 농도를 측정하는 단계를 포함한다.

또한, 모노-니트로-BAPTA-유형 킬레이터를 함유하고 pH 8.5 내지 pH 11.5 범위의 pH 를 갖는, 칼슘 측정을 위한 안정한 시약 조성물을 개시한다.

게다가, 본 발명은 pH 가 pH 8.5 내지 pH 11.5 범위이고 모노-니트로-BAPTA-유형 킬레이터를 함유하는 칼슘 측정용 시약 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.

발명의 상세한 설명

바람직한 구현예에서 본 발명은 모노-니트로-BAPTA-유형 킬레이터를 포함하는 용액을 샘플과 혼합시킴으로써 칼슘 이온을 모노-니트로-BAPTA-유형 킬레이터에 결합시키는 단계, 칼슘 이온을 모노-니트로-BAPTA-유형 킬레이터로부터 방출시키는 단계 (상기 방출은 모노-니트로-BAPTA-유형 킬레이터의 흡광도 변화를 야기함), 흡광도 변화를 측정하는 단계 및 측정된 흡광도 변화를 이용하여 칼슘 이온 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 샘플에서 칼슘 이온의 농도를 측정하는 방법에 관한 것이다.

하기 단계를 포함하는, 샘플에서 칼슘 이온의 농도를 측정하는 방법을 개시한다:

a) 하기 화학식 I 의 화합물을 포함하는 용액을 샘플과 혼합시킴으로써 상기 화합물에 칼슘 이온을 결합시키는 단계:

[식 중에서, R1 은 수소, 할로겐, 카르복시, 알킬 및 포르밀로부터 선택되고, R2 는 독립적으로 수소, 할로겐, 알킬, 알콕시, 모르폴리노, CN, 카르복시 및 포르밀로부터 선택되고, R3 은 독립적으로 수소, 할로겐, N-알킬 술페이트, 카르복시, 알콕시, 페닐, CN, CF₃, 및 3차 부틸로부터 선택되고, R4 는 독립적으로 수소, 할로겐 또는 알킬로부터 선택되고, R5 및 R7 은 독립적으로 수소 또는 알킬이고, R6 은 수소, 알킬, 알콕시 및 할로겐으로부터 선택되고, 또는 R3 및 R4 는 방향족 가교를 형성하고, X+ 는 양으로 하전된 반대이온임], b) 상기 화합물로부터 칼슘 이온을 방출시키는 단계 (상기 방출은 상기 화합물의 흡광도 변화를 야기함), c) 흡광도의 변화를 측정하는 단계, d) (c) 에서 측정된 흡광도 변화를 사용하여 칼슘 이온의 농도를 측정하는 단계.

후보 치환기 R1, R2, R3, R4 및/또는 R6 으로서 언급한 할로겐은 바람직하게는 Cl- Br- 및 F- 로부터 선택된다.

하나의 바람직한 구현예에서, 치환기 R1 및/또는 R2, 및/또는 R3 은 카르복시이다.

R1, R2, R4, R5, R6, 및/또는 R7 을 위해 언급된 알킬은 바람직하게는 C1 내지 C3-알킬이다.

R2, R3, 및/또는 R6 을 위해 언급된 알콕시는 바람직하게는 메톡시 또는 에톡시이다.

R3 및 R4 사이의 방향족 가교는 바람직하게는 벤젠 고리계의 일부이다.

반대이온 X+ 는 바람직하게는 Na+, K+, Li+ 및 Cs+ 로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한 바람직한 X+ 은 K+ 또는 Na+ 이다.

본원에 사용된 바와 같이, 하기 용어들 중 각각은 이번 부문에서 그와 관련된 의미를 갖는다.

본원에서 단수는 문법적 대상의 하나 또는 하나 초과 (즉, 적어도 하나) 를 지칭하는 것으로 사용된다. 예로서, "마커" 는 하나의 마커 또는 하나 초과의 마커를 의미한다. 용어 "적어도" 는 임의로 하나 이상의 추가 대상이 존재할 수 있음을 표시하기 위해 사용된다.

표현 "하나 이상" 은 1 내지 50, 바람직하게는 1 내지 20, 또한 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 또는 15 이다.

화학식 I 에 따른 화합물은 칼슘 이온을 결합시킬 수 있다. 칼슘 결합시 또는 방출시, 칼슘의 스펙트럼 특징의 변화가 발생한다. 상기 스펙트럼 특징의 변화는 용이하게 측정될 수 있고, 샘플에 존재하는 칼슘 이온의 농도에 직접 연관된다.

우선 분석될 샘플에 존재하는 모든 칼슘 이온을 화학식 I 의 화합물에 결합시키는 것이 유리하다는 것을 밝혀내었다. 그렇게 함으로써 안정한 기준치가 수득된다. 상기 안정한 기준치는 특히 저농도의 칼슘 이온을 측정하는데 가치가 있다. 화학식 I 에 따른 화합물로부터 칼슘 이온의 방출시, 이의 스펙트럼 특징의 측정가능한 변화가 유발되어 샘플에 존재하는 칼슘 이온의 농도를 정확히 측정하는데 사용될 수 있다.

화학식 I 의 화합물은 넓은 pH 범위를 통해 칼슘 이온을 효율적으로 결합시킬 수 있다. 효율적인 칼슘 결합은 약 pH 5.0 내지 약 pH 11.0 에서 관찰될 수 있다. 하나의 구현예에서 본 발명에 따른 방법은 화학식 I 에 따른 화합물 및 샘플을 포함하는 어세이 혼합물의 pH 가 pH 5.0 내지 pH 11.0 인 조건 하에 실시된다. 상기 반응 혼합물은 적어도 화학식 I 에 따른 화합물 및 샘플의 분취량을 함유한다. 추가 바람직한 구현예에서, 반응 혼합물의 pH 는 pH 5.0 이상, pH 5.5 이상, pH 6.0 이상, pH 6.5 내지 pH 11 이하, 또한 pH 10 이하, pH 9.0 이하, pH 8.0 이하일 것이다.

화학식 I 에 따른 화합물의 최종 농도는 샘플에서 칼슘 이온의 신뢰할 수 있는 측정을 위해 충분히 높게 조절된다. 화학식 I 의 화합물을 사용하여 칼슘 이온을 측정함으로써 달성되는 높은 감도로 인해, 혈청 또는 혈장 같은 임상 샘플은 예를 들어, 약 100-배 희석되도 확실하게 측정될 수 있다. 당업자에게 명백하듯이 어세이 혼합물에서 화학식 I 에 따른 화합물의 최종 농도는 어세이 혼합물에서 칼슘 이온의 최종 농도와 대등해야 한다. 바람직한 구현예에서, 개시된 방법은 칼슘 이온의 최종 농도의 예상 상한가의 적어도 1.5 배인 최종 농도로 화학식 I 에 따른 화합물을 사용하여 실시될 것이다.

언급한 바와 같이, 5 mmol/ℓ 칼슘 이온을 갖는 샘플은 확실히 측정되어야 하고, 이는 예상되는 상한치이다. 상기 샘플이 1 : 100 로 희석되는 경우, 어세이 혼합물에서 칼슘 이온의 최종 농도는 0.05 mmol/ℓ 일 것이다. 화학식 I 에 따른 화합물의 최종 농도는 적어도 상기 농도의 1.5-배, 0.075 mmol/ℓ 이어야 한다. 또한 어세이 혼합물에서 화학식 I 에 따른 화합물의 바람직한 최종 농도는 예상 상한가 5 mmol/ℓ 를 갖는 샘플에 대해 계산된 바와 같이 칼슘 이온 농도의 적어도 2-배, 2.5-배, 3-배 및 기껏해야 20-배, 15-배 또는 10-배일 것이다. 바람직하게는 어세이 혼합물에서 화학식 I 에 따른 화합물의 최종 농도는 샘플에 대한 희석 계수로 5 mmol/ℓ 를 증가시킴으로써 수득되는 몰 농도의 적어도 1.5-배, 2-배, 2.5-배, 3-배 및 기껏해야 20-배, 15-배 또는 10-배일 것이다.

화학식 I 에 따른 화합물 용액의 장기간 안정성이 pH 8.5 이상에서 최상으로 보존된다는 것을 밝혀내었다. 새로 제조되거나 기능을 자주 확인할 필요가 없는 화학식 I 에 따른 화합물을 포함하는 시약을 사용하는 것이 바람직하고, 따라서 하나의 구현예에서 본 발명의 청구 범위에 따른 방법은 pH 8.5 내지 pH 11.5 범위의 pH 를 갖는 화학식 I 의 화합물을 포함하는 용액을 사용하여 실시된다.

대안의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 pH 8.5 내지 pH 11.0 또는 pH 9.0 내지 pH 10.5 범위의 pH 를 갖는 화학식 I 의 화합물을 포함하는 용액을 사용하여 수행된다.

바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 화학식 I 에 따른 화합물 [식 중, R1 은 수소 또는 할로겐임] 을 사용하여 실시된다.

바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 화학식 I 에 따른 화합물 [식 중, R2 는 수소, 할로겐, 카르복시, 모르폴리노 또는 알킬임] 을 사용하여 실시된다.

바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 화학식 I 에 따른 화합물 [식 중, R3 은 수소, 할로겐, 카르복시 또는 알콕시임] 을 사용하여 실시된다.

하나의 구현예에서, 본 발명에 개시된 방법에 사용하기 위해 화학식 I 에 따른 화합물은 바람직하게는 log k 가 9.0 이하인 결합 상수를 이용하여 칼슘 이온을 결합시켜야 한다. 한편, log k 로서 기재된 칼슘 이온에의 결합 상수는 적어도 4.0 이상이어야 한다. 바람직하게는 칼슘 이온을 위한 결합 상수 log k 는 4.5 내지 8.5 이어야 하고, 또한 바람직하게는 log k 는 5.0 내지 8.0 일 것이다.

log k 는 [Harrison, S.M. and Bers, D.M., Biochimica et Biophysica Acta 925 (1987) 133 - 143] 에 기재된 절차에 따라 측정된다. 간략하게는, 칼슘 결합 화합물은 25mM Hepes-완충액에서 pH 7.0 으로 중화된다. 온도는 20℃ 에서 일정하게 유지된다. 여러 농도의 칼슘 이온은 일정량의 칼슘 결합 화합물로 인큐베이션된다. 유리 및 결합 칼슘 이온의 분획이 측정되고 친화 상수가 스캐차드 플롯 (Scatchard plot) 의 도움으로 계산된다.

당업자는 치환기의 다양한 조합이 가능하다는 것을 인식할 것이다. 치환기는 화학식 I 에 따른 화합물의 결합 상수에 영향을 주거나 상기 상수를 조절하기 위해 선택 사용될 수 있다. 전자 흡인기는 결합 상수의 감소를 유도하나 전자 공여기는 일반적으로 칼슘 이온의 결합을 더욱 강하게 할 것이다.

바람직하게는 화학식 I 의 화합물에의 치환기는 log k 로서 제공되는 결합 상수가 7.0 이하, 또한 바람직하게는 4.0 내지 7.0, 4.5 내지 6.5 또는 5.0 내지 6.0 의 log k 가 되도록 선택된다.

본 발명에 따른 방법을 수행하기 위해서 화학식 I 에 따른 둘 이상의 화합물을 조합하는 것이 매우 가능할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 화학식 I 에 따른 단일 화합물이 사용된다.

본 발명에 따른 방법은 역적정에 기초한다, 즉 칼슘 이온이 우선 화학식 I 의 화합물에 결합되고 그 후 방출된다. 화학식 I 에 따른 화합물로부터의 칼슘 이온의 방출은 화학식 I 에 따른 화합물 보다 더 강하게 칼슘 이온을 결합시키는 킬레이터를 사용함으로써 매우 용이하게 달성된다. 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법의 단계 b) 에서 칼슘 이온의 방출을 위해 사용되는 킬레이터는 칼슘 검출 방법에 사용되는 화학식 I 의 화합물보다 10-배 높은 결합 상수를 갖는다.

예를 들어 log k 가 5.0 인 화학식 I 에 따른 화합물과 결합한 칼슘과 log k 가 6.0 인 킬레이터를 조합하는 것이 가능하지만, 적어도 7.0 이상의 log k 를 갖는 킬레이터를 사용하는 것이 바람직하다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 화학식 I 에 따른 화합물로부터 칼슘 이온을 방출하기 위해 사용되는 시약은 관심의 대상인, 예를 들어 화학식 I 에 따른 화합물의 흡수 또는 방출 스펙트럼을 방해하지 않는 스펙트럼 특징을 갖도록 선택되는 것이 가장 좋다.

바람직하게는 본원에 개시된 방법에서 화학식 I 에 따른 화합물로부터 칼슘 방출에 사용되는 시약/킬레이터는 디-, 트리-, 테트라-아세트산 유도체, 폴리-포스폰산 또는 인산 유도체, 4,4'-디플루오로-BAPTA, 5,5'-디브로모-BAPTA, 5,5'-디플루오로-BAPTA, 5-메틸-5'-포르밀-BAPTA, 5,5'-디메틸-BAPTA, (1,2-시클로헥실렌디니트릴로)테트라아세트산 (CETA), 시트르산, 니트릴로트리아세트산 (NTA), 이미노디아세트산 (IDA), N-(2-히드록시에틸)이미노디아세트산 (HIDA), N-(2-히드록시에틸)에틸렌디아민-N,N',N'-트리아세트산 (= HEDTA; CAS 150-39-0, log k = 8.14), CyDTA (= CAS 125572-95-4, log k = 12.50), TTHA (= CAS 869-52-3, log k = 10.06), Me-EDTA (= l,2-프로판디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산, log k = 10.4), BAPTA (= CAS 73630-08-7, log K 6.97), DTPA (= 디에틸렌트리아미노펜타아세트산; CAS-Nr.: 67-43-6, log k = 10.8), EGTA (= 에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N,N-테트라아세트산; CAS-Nr.: 67-42-5, log k = 10.9), DTPMP, (= 디에틸렌트리아민펜타(메틸렌포스폰산); CAS-Nr.: 15827-60-8, log k = 10.7) 및 EDPMP (= 에틸렌디아민테트라(메틸렌포스폰산); CAS-Nr.: 1429-50-1, log k = 10.2) 로부터 선택된다.

또한 본 발명에 따른 바람직한 방법은 칼슘 이온의 방출이 EDTA, DTPA, EGTA, DTPMP 및/또는 EDPMP 에 의해 트리거되도록 실시된다.

화학식 I 에 따른 화합물로부터 칼슘 이온을 방출시키는데 사용되는 킬레이터의 선택은, 화학식 I 의 화합물에 기초한 칼슘 이온이 킬레이터의 첨가 후 방출되는 한, 중요하지 않다. 최종 반응 혼합물에서 킬레이터의 농도는 바람직하게는 상기 혼합물에서 화학식 I 에 따른 화합물의 농도와 적어도 등몰이나 100 배 초과는 아닐 것이다. 예를 들어 피페팅에서 사소한 실수를 보완함으로써 만전을 기하기 위해서, 과잉의 킬레이터가 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본원에 개시된 방법을 수행하는 동안, 최종 반응 혼합물에서의 킬레이터의 농도는 화학식 I 의 화합물의 최종 농도보다 높고, 예를 들어, 1.5-배 내지 50-배이거나 또한 바람직하게는 2-배 내지 10-배이다.

칼슘 이온 측정을 위해 일상적 임상 화학에 사용되는 시약은 수송 및 장기 저장 조건 하에서 안정해야 한다. 화학식 I 에 따른 화합물은 알칼리 완충액 조건에 있기 때문에 산성 또는 중성 pH 에서 안정하지 않다는 것을 밝혀내었다. 화학식 I 에 따른 화합물을 포함하는 시약 조성물은 적어도 pH 가 8.5 이어야 하고, pH 는 더 높아야 한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 pH 가 pH 8.5 내지 pH 11.5 범위이고, 청구항 1 에 정의된 화학식 I 의 화합물을 함유하는 칼슘 이온 측정용 시약을 개시한다.

대안적인 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 시약은 pH 가 pH 8.5 내지 pH 11.0 또는 pH 9.0 내지 pH 10.5 범위이다.

pH 8.5 이상에서 용액을 중화시키는데 적절한 완충계가 당업자에게 익히 공지되어 있다. 바람직하게는 상기 완충계는 하기로부터 선택될 것이다: AMPD (= 2-아미노-2-메틸-1.3-프로판디올), CHES (= 2-(N-시클로헥실아미노)-에탄술폰산), AMPSO (= 3-[디메틸(히드록실메틸)-메틸아미노]-2-히드록시프로판술폰산), CAPSO (= 3-시클로헥실아미노)-2-히드록시-1-프로판술폰산), CAPS (= 3-시클로헥실아미노)-2-프로판술폰산), 글리신 완충계, 또는 탄산염 완충계. 또한 본 발명에 따른 바람직한 칼슘 이온 측정용 시약은 CAPS 또는 CAPSO 로부터 선택되는 완충계를 포함할 것이다.

상기 언급된 바와 같이, 순환에서의 칼슘 농도는 철저히 조절되고, 생리적 농도는 보통 2.20 내지 2.55 mmol/ℓ 이다. 순환에서 칼슘 이온의 상승 수준은 거의 4 mmol/ℓ 를 초과하지 않는다. 이러한 이유로, 순환에서 칼슘 이온을 측정하는데 알맞은 시약은 보통 5 mmol/ℓ 이하의 측정 범위를 포함하도록 제조된다. 칼슘 측정용 시약은 생리적으로 적절한 농도와 대등해야 한다. 그러나 소변에서의 칼슘 농도는 광범위하게 다양할 수 있다. 이는 칼슘 측정용 어세이가 또한 넓은 측정 범위를 포함해야 한다는 것을 요구한다.

바람직한 구현예에서, 칼슘 측정용 시약은 화학식 I 의 화합물을 0.10 mmol/ℓ 내지 50 mmol/ℓ 범위의 농도로 포함한다.

당업자는 측정될 샘플을 포함하는 어세이 혼합물에서 화학식 I 의 화합물의 최종 농도가 샘플에서의 칼슘 이온과 대등해야 한다는 것을 인식할 것이다. 하나의 구현예에서, 화학식 I 에 따른 화합물의 농도는 0.10 mmol/ℓ 내지 2 mmol/ℓ 범위일 것이다. 대안적인 구현예에서, 화학식 I 에 따른 화합물의 농도는 0.1, 0.125, 0.15, 또는 0.2 에서부터 2.0, 1.5 또는 1 mmol/ℓ 까지의 범위일 것이다. 상기 시약은 측정될 샘플과 혼합되어 추가의 희석 없이 사용될 수 있다.

다른 구현예에서, 화학식 I 의 화합물 기재의 더욱 농축된 칼슘 측정용 시약을 제공한다. 상기 더욱 농축된 시약은 샘플 측정을 위해 적절하게 희석될 수 있다. 본 발명에 따른 농축 형태의 시약은 화학식 I 에 따른 화합물을 0.5 내지 50 mmol/ℓ 범위로 포함할 것이다. 대안적인 구현예에서, 칼슘 이온 검출을 위해 더욱 농축된 시약 중의 화학식 I 에 따른 화합물의 농도는 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1 mmol/ℓ 에서부터 50, 40, 30, 20, 15, 또는 10 mmol/ℓ 까지의 범위일 것이다.

추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 개시된 칼슘 측정용 시약은 화학식 I 에 따른 화합물 [식 중, R1 이 수소 또는 할로겐임] 을 포함한다.

추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 개시된 칼슘 측정용 시약은 화학식 I 에 따른 화합물 [식 중, R2 가 수소, 할로겐, 카르복시, 모르폴리노 또는 알킬임] 을 포함한다.

추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 개시된 칼슘 측정용 시약은 화학식 I 에 따른 화합물 [식 중, 화학식 I 의 R3 이 수소, 할로겐, 카르복시 또는 알콕시임] 을 포함한다.

칼슘 이온 측정용 시약에 세제를 첨가하는 것이 유리하다는 것을 밝혀내었고, 이는 방해하는 비특이적 결합의 감소, 거품 또는 기포의 감소 또는 기타 긍정적인 영향으로 인한 것일 수 있다. 추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 pH 가 pH 8.5 내지 pH 11.5 범위이고, 청구항 1 에 정의된 화학식 I 의 화합물 및 세제를 함유하는 칼슘 이온 측정용 시약에 관한 것이다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "세제" 는 이온성 또는 비이온성 세제를 의미한다. 세제의 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 지방산 염, Triton

패밀리, 옥틸 글리코시드, 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸-암모니오]-1-프로판술포네이트 (CHAPS), 나트륨 도데실 말토시드 (DM), 라우릴디에틸아민 옥시드 (LDAO), NP-40 및 Tween

패밀리, 1차 아민, 아민 아세테이트 및 염산염, 4차 암모늄 염, 트리메틸에틸 암모늄 브로마이드, 치환된 디아민, 디에탄올아미노프로필아민 또는 디에틸아미노프로필아미드의 아미드, 사이클화 디에틸렌트리아민의 아미드, 알킬아릴 술포네이트, 석유 술포네이트, 술폰화 글리세리드, 콜아미드, 술포베타인, 알킬 글리코시드, 사포닌, 알킬-폴리에틸렌 글리콜 에테르.

하나의 구현예에서, 세제는 비이온성 세제이다. 비이온성 세제의 비제한적인 예는 Imbentin V413/91, Thesit, Triton

X-100, Triton

X-114, Brij

35, Brij

58, Tween

20, Tween

80, Nonidet

P-40, 옥틸 β 글루코시드 및 MEGA 8-옥타노일-N-메틸글루카미드이다. 하나의 구현예에서, 비이온성 세제는 Brij

35, Triton

X-100, Tween

20, 및 Nonidet

P-40 으로부터 선택된다.

상기 추가로 언급된 바와 같이, 칼슘 이온의 농도는 임상적 일상 진단에서 중요한 요인이다. 바람직한 칼슘 측정용 시약은 본 발명에 기재된 바와 같은 화학식 I 에 따른 화합물 또는 현재 사용되는 화합물과 같은 칼슘 지시약을 함유하는 하나 이상의 시약을 포함하는 키트 형태로 조립된다. 추가 바람직한 구현예에서, 본 발명은 칼슘 측정용 시험 키트로서, 화학식 I 에 따른 화합물을 포함하고, pH 가 pH 8.5 내지 pH 11.5 범위인 시약을 함유하는 시험 키트에 관한 것이다.

많은 예에서, 칼슘 이온 측정을 위해 맞추어진 키트 내에 둘 이상의 시약으로서, 화학식 I 에 따른 화합물을 포함하고 pH 가 pH 8.5 내지 pH 11.5 범위인 제 1 시약 및 킬레이터를 포함하는 제 2 시약을 포함하는 것이 유리할 것이다. 추가 바람직한 구현예에서, 본 발명은 화학식 I 에 따른 화합물을 포함하고 pH 가 pH 8.5 내지 pH 11.5 범위인 제 1 시약 및 칼슘 이온용 킬레이터를 포함하는 제 2 시약을 함유하는 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 또한 임의로 첨부 문서 및/또는 하나 이상의 추가 시약을 포함할 수 있다.

하기 실시예 및 도면는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되고, 이의 실제 범주는 첨부된 청구 범위에 기술되어 있다. 본 발명의 취지로부터 벗어남 없이 상술된 절차가 수정될 수 있음은 당연하다.

도 1 NM-BAPTA 의 합성을 도 1 에 도식화하였다.
도 2 Modular P 분석기 (Roche Diagnostics, 독일) 에서의 실시예 2, 마지막 열에 제공된 절차에 따른 칼슘 이온의 측정. 상부 (A) 에서 이론값 및 실제 측정된 값을 서로에 대해 좌표로 나타냈다. 하부 (B) 에서 회수 % 를 제공하였다, 즉 실제 측정된 값을 기대 (이론) 값의 백분율로 제공하였다.
도 3 cobas c501 분석기 (Roche Diagnostics, 독일) 에서의 실시예 2, 중간 열에 제공된 절차에 따른 칼슘 이온의 측정. 상부 (A) 에서 이론값 및 실제 측정된 값을 서로에 대해 좌표로 나타냈다. 하부 (B) 에서 회수 % 를 제공하였다, 즉 실제 측정된 값을 기대 (이론) 값의 백분율로서 제공하였다.
도 4 Modular P 분석기 (Roche Diagnostics, 독일) 에서의 실시예 2, 마지막 열에 제공된 절차에 따른 칼슘 이온의 측정. NM-BAPTA 의 농도는 표준 농도의 90 % 로 감소되었다. 상부 (A) 에서 이론값 및 실제 측정된 값을 서로에 대해 좌표로 나타냈다. 하부 (B) 에서 회수 % 를 제공하였다, 즉 실제 측정된 값을 기대 (이론) 값의 백분율로 제공하였다.
도 5 Modular P 분석기 (Roche Diagnostics, 독일) 에서의 실시예 2, 마지막 열에 제공된 절차에 따른 칼슘 이온의 측정. NM-BAPTA 의 농도는 표준 농도 80 % 로 감소되었다. 상부 (A) 에서 이론값 및 실제 측정된 값을 서로에 대해 좌표로 나타냈다. 하부 (B) 에서 회수 % 를 제공하였다, 즉 실제 측정된 값을 기대 (이론) 값의 백분율로 제공하였다.
도 6 NF-BAPTA 의 합성을 도 6 에 도식화하였다.
도 7 칼슘 이온의 존재 및 부재 각각에서의 NM-BAPTA 및 NF-BAPTA 각각에 대한 흡광도 스펙트럼을 제공하였다. 4 개의 스펙트럼의 기호 설명을 도면 아래 제공하였다.

실시예 1

NM - BAPTA 의 합성

NM-BAPTA 의 합성을 도 1 에 도식화하였다.

a) 1-(2- 클로로 - 에톡시 )-2-니트로-벤젠

2-니트로-페놀 (168.7 g) 및 톨루엔-4-술폰산 2-클로로에틸 에스테르 (100 g) 를 500 ㎖ DMF 에 용해시키고, 199 g 탄산칼륨을 조심스럽게 첨가한 후 1 시간 동안 110-120℃ 에서 교반하였다. 반응 혼합물을 분쇄된 얼음과 물의 혼합물 (8 ℓ) 에 붓고 격렬히 교반하였다. 잔류물을 여과하고, 물로 수회 세척하고 건조시켰다.

수율: 100-120 g

b) 4- 메틸 -1-니트로-2-(2-(2-니트로- 페녹시 )- 에톡시 )-벤젠

1-(2-클로로-에톡시)-2-니트로-벤젠 (116 g) 및 5-메틸-2-니트로-페놀 (88 g) 을 500 ㎖ DMF 에 용해시키고 160 g 탄산칼륨을 조심히 첨가한 후 4 시간 동안 90-110℃ 에서 교반하였다. 반응 혼합물을 분쇄된 얼름과 물의 혼합물 (8 ℓ) 에 붓고 격렬히 교반하였다. 잔류물을 여과하고, 물로 수회 세척하고 건조시켰다. 조생성물을 메탄올에 현탁시키고, 연노랑 잔류물을 재차 여과하고 물로 세척하고 건조시켰다.

수율: 150-165 g

c) 2-(2-(2-아미노- 페녹시 )- 에톡시 )-4- 메틸 - 페닐아민

100 g 4-메틸-1-니트로-2-(2-(2-니트로-페녹시)-에톡시)-벤젠 및 10 g 목탄 상의 팔라듐을 3.5 ℓ 디옥산에 현탁시키고 5.5 bar 의 수소 압력 하에 실온에서 수소화시켰다. 질소로 3 회 플래시한 후 촉매를 질소 분위기 하에 여과시키고 잔여 용액을 증발시키고 생성물을 진공하에 건조시켰다.

수율: 80 g

d) ((2-(2-(2-( 비스 - 메톡시카르보닐메틸 -아미노)- 페녹시 )- 에톡시 )-4- 메틸 - 페 닐)- 메톡시카르보닐메틸 -아미노)-아세트산 메틸 에스테르

2-(2-(2-아미노-페녹시)-에톡시)-4-메틸-페닐아민 (80 g) 을 2.5 ℓ DMF 에 용해시키고, 285 ㎖ 브로모-아세트산 메틸 에스테르, 429 g 탄산칼륨, 및 36.8 g 요오드화나트륨을 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃ 까지 2 시간 동안 가열하였다. 증발 후 잔여 브로모-아세트산 메틸 에스테르를 생성물로부터 헥산을 이용하여 제거하였다. 조생성물을 추가로 메탄올 중의 결정화에 의해 정제하였다.

수율: 93 g

e) ((2-(2-(2-( 비스 - 메톡시카르보닐메틸 -아미노)-5-니트로- 페녹시 )- 에톡시 )-4-메틸- 페닐 )- 메톡시카르보닐메틸 -아미노)-아세트산 메틸 에스테르

50 g ((2-(2-(2-(비스-메톡시카르보닐메틸-아미노)-페녹시)-에톡시)-4-메틸-페닐)-메톡시카르보닐메틸-아미노)-아세트산 메틸 에스테르를 600 ㎖ 빙 (glacial) 아세트산에 용해시켰다. 격렬히 교반하면서 빙아세트산 중의 1 molar 질산 91.5 ㎖ 를 첨가하고, 제 2 단계에서 28 ㎖ 의 농축된 황산을 첨가하였다. 온도를 30℃ 까지 증가시켰다. 반응 혼합물을 즉시 10 ℓ 얼음/물 혼합물에 부었다.잔류물을 여과하고, 물로 수회 세척하고 진공 하에 건조시켰다. 조생성물을 첫번째로 헥산 /아세트산 에틸 에스테르 (1 : 1) 을 용리액으로서 사용하고, 두번째로 톨루엔/아세토니트릴 (1 : 1) 을 용리액으로서 사용하여 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그래피로 추가 정제하였다. 생성물을 최종적으로 프로판-2-올로부터 결정화시켰다.

수율: 20 g

f) NM - BAPTA ; ((2-(2-(2-( 비스 - 카르복시메틸 -아미노)-5-니트로- 페녹실 )- 에톡 시)-4- 메틸 - 페닐 )- 카르복시메틸 -아미노)-아세트산의 칼륨염

9.5 g ((2-(2-(2-(비스-메톡시카르보닐메틸-아미노)-5-니트로-페녹시)-에톡시)-4-메틸-페닐)-메톡시카르보닐메틸-아미노)-아세트산 메틸 에스테르를 물/메탄올 (각 230 ㎖) 혼합물에 용해시키고, 160 ㎖ 1 molar 수산화칼륨 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 1 시간 동안 환류시켰다. 실온으로 냉각시키고, 250 ㎖ 물을 첨가한 후, 용액의 pH 를 pH 3 으로 조절하고, 메탄올을 증발시켰다. 산성 산 에틸 에스테르를 이용하는 용매 추출로 생성물을 단리하였다. 증발 후, 생성물을 진공 하에 건조시켰다.

((2-(2-(2-(비스-카르복시메틸-아미노)-5-니트로-페녹실)-에톡시)-4-메틸-페닐)-카르복시메틸-아미노)-아세트산을 메탄올에 용해시키고, 등몰의 메탄올 중의 수산화칼륨을 첨가하였다. 증발 및 건조 후 적절한 칼륨염을 단리할 수 있었다.

수율: 9 g

실시예 2

NM - BAPTA 를 이용한 칼슘 이온 측정에 대한 일반 절차

화학식 I 에 따른 모노-니트로-BAPTA-유형 화합물을 이용하는 칼슘 이온의 측정을 역적정 방법으로 수행한다.

관심 샘플의 분취량을, 모노-니트로-BAPTA-유형 화합물을 포함하는 용액과 혼합하고, 인큐베이션한다. 자동 분석기 (Roche Diagnostics, 독일) 에서, 상기 시약을 R1 로 칭한다. 안정한 기준값 신호가 수득될 때까지 인큐베이션을 수행한다. 보통 안정한 기준값 신호는 10 분 미만, 주로 2 내지 5 분 이내에 수득된다.

(임의로 예를 들어 증류수로 희석된) R1 및 샘플의 혼합물을 분석한다, 즉 가장 적절한 파장(들) 에서의 흡광도 값 및 스펙트럼을 측정한다.

화학식 I 에 따른 화합물에 기초한 칼슘 이온은 방출제, 예를 들어 EDTA 의 첨가에 의해 방출된다. 제 2 시약은 자동 분석기 (Roche Diagnostics, 독일) 에서 R2 로 칭한다. 필요되는 경우, 혼합물을 추가로 증류수로 희석할 수 있다.

그리고 나서 샘플, R1 및 R2 의 최종 혼합물 (임의로 예를 들어 증류수로 희석됨) 을 분석한다, 즉 가장 적절한 파장(들) 에서의 흡광도 값 및 스펙트럼을 측정한다.

흡광도의 변화는 관심의 샘플에서 칼슘 이온의 농도에 직접 연관되고, 칼슘 이온의 농도는 표준 절차에 따라 계산된다.

표 1 에서, 5 개의 상이한 자동 분석기 (Roche Diagnostics, 독일) 에서의 칼슘 이온 측정에 권장되는 적용들에 대한 개요를 제공한다. Modular P 및 Modular D 분석기에 대해 권장되는 적용은 동일하다.

[표 1]

HiCo R1 = 고농도 R1 시약;

LoCo R1 = 저농도 R1 시약;

Integra, cobas, Roche/Hitachi 902, Modular D, 및 Modular P 는 Roche Diagnostics (독일) 에서 유통된 분석기 시스템이다.

[표 2]

실시예 3

NM - BAPTA 를 사용하는 칼슘 측정의 선형성

본 발명에 개시된 칼슘 이온의 측정 방법은 기술적으로 탁월하다, 예를 들어 매우 높은 정확성을 보여준다. 이는 예를 들어 이론적 예상값 및 실제 측정값을 비교할 경우 분명하게 된다.

칼슘 이온의 상이한 농도 (→ 이론값) 를 신규 방법으로 측정된 실제값과 비교한다.

두 개의 상이한 분석기, Modular P 및 cobas c501 (둘 모두 Roche Diagnostics 에 의해 유통됨) 각각에 대해 측정된 값을 갖는 두 개의 대표적인 샘플만을 도 2 및 3 으로서 제공한다. 상기 두 개의 도면은 측정의 뛰어난 기술적 품질/정확성을 입증한다. 도 2 및 3 으로부터 명백하듯이, 실제로 측정된 모든 값은 상응하는 예상된 이론값의 95 내지 105 % 이내이고, 이는 조사된 농도의 전체 범위에 걸친 칼슘 이온의 상당히 정확한 측정으로 번역된다.

실시예 4

NM - BAPTA 의 최소 농도 확인

순환에서 칼슘 이온의 농도는 지극히 보기 드물게 4 mmol/ℓ 를 초과한다. 확실한 방식으로 5 mmol/ℓ 까지의 칼슘을 측정할 수 있는 시약은 순환에서 칼슘 이온을 확인하기에 가장 적절해야 한다.

칼슘 이온의 다양한 농도 (도 4 및 5 에서의 예상값) 를, 표 1 의 마지막 열에 기재한 적용을 이용하여 Modular P 기기에서 측정하였다. 그러나, 오로지 90 % 또는 80 % 각각의 NM-BAPTA 의 보통 농도를 사용하였다. 도 4 및 5 각각에서 볼 수 있는 바와 같이, 오로지 80 % 의 NM-BAPTA 가 실시예 2 에 제공된 표준 절차와 비교했을 때, 검출 혼합물에 존재하더라도 5 mmol/ℓ 이하의 칼슘 이온은 여전히 95 내지 105 % 로 회수된다. 도 5 로부터 명백하듯이, 5 mM 초과의 값은, NM-BAPTA 의 농도가 80 % 로 감소하는 경우 너무 작은 값으로 회수되는 경향이 있다. 이는 병적 샘플 (이 경우, 이 샘플은 상기 생픔에서와 같이 약 1 : 70 으로 희석됨) 에 존재하는 고농도의 칼슘을 측정하는 경우, NM-BAPTA 의 최종 농도는, 상기 샘플에서의 칼슘 이온의 정확한 측정을 보장하기 위해서, 약 0.2 mmol/ℓ 이어야 한다는 것을 의미한다.

실시예 5

NM - BAPTA 의 pH -의존적 안정성

칼슘 측정용 시약은 운송 조건에서뿐만 아니라 분석기의 판에서 가능한 안정해야 한다.

시약의 안정성을 조사하기 위해서, NM-BAPTA 를 상이한 pH 값에 저장하였다. 단기간 응력 모델을 적용시키고, NM-BAPTA 를 함유한 시약을 35℃ 에 저장하였다. 동일한 샘플의 분취량을 사용하는 다른 동일한 조건 하에서의 칼슘 이온의 측정에 상기 "응력화된" 시약을 사용하였다. 시약을 응력화시킨 후 측정된 값은 응력화되지 않은 시약으로 측정된 값과 제 0 일, 즉 시약에 대해 온도 응력을 시작한 그 날에 비교하였다.

사용된 완충계는 각각 pH 7.4 의 100 mmol/ℓ HEPES, pH 8.0 의 50 mmol/ℓ Tris, pH 10.0 의 50 mmol/ℓ NaHC03, pH 9.8 의 50 mmol/ℓ 글리신, 및 pH 10 의 40 mmol/ℓ CAPSO 이다. 상응하는 데이타는 표 3 내지 7 에 요약하였다.

[표 3]

표 3 으로부터 명백하듯이, NM-BAPTA 를 함유하는 시약은 pH 7.4 에서 안정하지 않다. 칼슘 이온의 회수는 오로지 80 % 이하의 범위이내이다.

[표 4]

표 4 로부터 명백하듯이, NM-BAPTA 를 함유하는 시약은 경계선에 있지만, pH 8.0 에서 여전히 허용되는 안정성을 갖는다. 칼슘 이온의 회수는 대부분 80 % 내지 90 % 범위 이내이다.

[표 5]

[표 6]

[표 7]

표 5 내지 7 로부터 명백하듯이, 본 출원서에 개시된 시약은 약 pH 10 쯤 에서 탁월한 안정성을 갖는다. 상기 시약을 1 주 동안 응력화시킨 후 칼슘 이온의 회수는 탁월하고, 대체로 90 % 내지 110 %, 주로 95 % 내지 105 % 의 원하는 범위가 많다. 이러한 높은 안정성은 사용된 완충계와 관계없이 달성될 수 있다.

실시예 6

NM - BAPTA 를 사용하는 칼슘 측정에 대해 마그네슘에 의한 방해가 없음

약 2.53 mmol/ℓ 의 생리적 농도로 칼슘 이온을 포함하는 샘플에 0 내지 15 mmol/ℓ 마그네슘 이온을 스파이크 하였다. 스파이크된 샘플을 실시예 2 에서 Modular P 에 대해 제공된 적용으로 Roche/Hitachi 917 분석기에서 측정하였다. 3 회 측정의 중앙값 결과는 하기 표 8 에 나타냈다.

[표 8]

표 8 에 제공된 회수 값으로부터 명백한 바와 같이, 상기 실험에서 마그네슘 이온은 칼슘 이온 측정을 방해하지 않는다.

실시예 7

NM - BAPTA 을 사용하는 칼슘 측정에 대해 가돌리늄에 의한 방해가 없음

약 2.35 mmol/ℓ 의 생리적 농도로 칼슘 이온을 포함하는 하나의 샘플 및 약 3.40 mmmol/ℓ 의 증가된 수준의 칼슘 이온을 갖는 하나의 샘플에 상이한 수준의 Omniscan

(C1 : 14 ㎕ 내지 986 ㎕, C2: 2.8 ㎕ 내지 997 ㎕) 을 스파이크하였다. Omniscan

은 가돌리늄을 포함하는 조영제로서 종종 사용된다. 스파이크된 샘플을 실시예 2 에서 Modular P 에 대해 제공된 적용으로 Hitachi 917 분석기에서 측정하였다. 3 회 측정의 중앙값 결과는 하기 표 9 에 나타냈다.

[표 9]

표 9 에 제공된 회수값으로부터 명백한 바와 같이, 상기 실험에서 측정된 모든 값이 95 내지 105 % 회수 범위에 잘 있기 때문에, 가돌리늄 이온은 칼슘 이온 측정을 방해하지 않는다.

실시예 8

NF - BAPTA 의 합성

NF-BAPTA 의 합성을 도 6 에 도식화하였다.

a) 1-(2- 클로로 - 에톡시 )-2-니트로-벤젠

실시예 1 참조

b) 4- 플루오로 -1-니트로-2-(2-(2-니트로- 페녹시 )- 에톡시 )-벤젠

1-(2-클로로-에톡시)-2-니트로-벤젠 (10 g) 및 5-플루오로-2-니트로-페놀 (7.86 g) 을 50 ㎖ DMF 에 용해시키고, 13.82 g 탄산칼륨을 조심스레 첨가한 후 19 시간 동안 90-110℃ 에서 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 격렬히 교반된 분쇄 얼음 및 물의 혼합물 (500 ㎖) 에 부었다. 잔류물을 여과하고, 물로 수회 세척하고 건조시켰다. 조생성물을 메탄올에 현탁시키고 연노랑색의 잔여물을 재차 여과하고 메탄올로 세척하고 건조시켰다

수율: 9.5 g

c) 2-(2-(2-아미노- 페녹시 )- 에톡시 )-4- 플루오로 - 페닐아민

9.48 g 4-플루오로-1-니트로-2-(2-(2-니트로-페녹시)-에톡시)-벤젠 및 1.5 g 목탄 상의 팔라듐을 500 ㎖ 디옥산 및 60 ㎖ 빙아세트산에 현탁시키고, 실온에서 수소화시켰다. 질소로 3 회 플래시한 후, 촉매를 질소 분위기 하에서 여과하고, 잔여 용액을 증발시키고 생성물을 진공 하에서 건조시켰다.

수율: 7.52 g

d) ((2-(2-(2-( 비스 - 메톡시카르보닐메틸 -아미노)- 페녹시 )- 에톡시 )-4- 플루오로 -페닐)- 메톡시카르보닐메틸 -아미노)-아세트산 메틸 에스테르

2-(2-(2-아미노-페녹시)-에톡시)-4-플루오로-페닐아민 (7.52 g) 를 250 ㎖ DMF 에 용해시키고, 38.4 ㎖ 브로모-아세트산 메틸 에스테르, 56 g 탄산칼륨, 및 2.13 g 요오드화나트륨을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 80℃ 까지 21 시간 동안 가열하였다. 증발시킨 후, 잔여 브로모-아세트산 메틸 에스테르를 생성물로부터 헥산으로 제거하였다. 조생성물을 추가로 메탄올에서 결정화시킴으로써 정제하였다.

수율: 4.14 g

e) ((2-(2-(2-( 비스 - 메톡시카르보닐메틸 -아미노)-5-니트로- 페녹시 )- 에톡시 )-4-플루오로- 페닐 )- 메톡시카르보닐메틸 -아미노)-아세트산 메틸 에스테르

2.5 g ((2-(2-(2-(비스-메톡시카르보닐메틸-아미노)-페녹시)-에톡시)-4-플루오로-페닐)-메톡시카르보닐메틸-아미노)-아세트산 메틸 에스테르를 30 ㎖ 빙아세트산에 용해시켰다. 격렬히 교반하면서 빙아세트산 중의 4.54 ㎖ 1 molar 질산을 첨가하고, 제 2 단계에서 11.35 ㎖ 의 농축된 황산을 첨가하였다. 온도를 30℃ 까지 증가시켰다. 반응 혼합물을 즉시 250 ㎖ 얼음/물 혼합물에 부었다. 잔류물을 여과하고, 물로 수회 세척하고 진공 하에 건조시켰다. 조생성물을 추가로 첫번째로 헥산 /아세트산 에틸 에스테르 (1 : 1) 를 용리액으로서, 두번째로 톨루엔/아세토니트릴 (1 : 1) 을 용리액으로서 사용하여 실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다.

수율: 0.82 g

f) NM - BAPTA ; ((2-(2-(2-( 비스 - 카르복시메틸 -아미노)-5-니트로- 페녹실 )- 에톡 시)-4- 플루오로 - 페닐 )- 카르복시메틸 -아미노)-아세트산의 칼륨염

0.82 g ((2-(2-(2-(비스-메톡시카르보닐메틸-아미노)-5-니트로-페녹시)-에톡시)-4-플루오로-페닐)-메톡시카르보닐메틸-아미노)-아세트산 메틸 에스테르를 물/메탄올 (각 20 ㎖) 의 혼합물에 용해시키고, 13.77 ㎖ 1 molar 수산화칼륨 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 1 시간 동안 환류시켰다. 실온으로 냉각시키고, 250 ㎖ 물을 첨가한 후 용액의 pH 를 pH 3 으로 조절하고, 메탄올을 증발시켰다. 산성 산 에틸 에스테르를 이용하는 용매 추출로 생성물을 단리시켰다. 증발시킨 후, 생성물을 진공 하에 건조시켰다.

((2-(2-(2-(비스-카르복시메틸-아미노)-5-니트로-페녹실)-에톡시)-4-플루오로-페닐)-카르복시메틸-아미노)-아세트산을 메탄올에 용해시키고, 등몰의 메탄올 중의 수산화칼륨을 첨가하였다. 증발 및 건조 후, 적절한 칼륨염을 단리시킬 수 있었다.

수율: 0.75 g

실시예 9

NF - BAPTA 에의 칼슘 이온의 결합.

칼슘 이온의 존재 및 부재시 NF-BAPTA 의 흡광도 특징은 Uvikon 930 광도계를 사용하여 분석하였다. 흡광도 스펙트럼은 0.09 mmol/ℓ Ca2+ 의 부재 또는 존재시 50 mmol/ℓ CAPSO (pH 7), 0.9% NaCl 및 0.01% Brij-35 에서 0.15 mmol/ℓ NM-BAPTA 또는 NF-BAPTA 를 사용하여 수득하였다.

도 7 에서 보는 바와 같이, NM-BAPTA 또는 NF-BAPTA 각각에 대한 흡광도 스펙트럼은 매우 많이 비슷하고, 상기 화합물들, 즉 화학식 I 에 따른 화합물들이 칼슘 이온 측정에 사용될 수 있음을 나타낸다.

Claims

하기 단계를 포함하는, 샘플에서 칼슘 이온의 농도를 측정하는 방법:
a) 하기 화학식 I 의 화합물을 포함하는 용액을 샘플과 혼합시킴으로써 상기 화합물에 칼슘 이온을 결합시키는 단계:

[식 중에서, R1 은 수소, 할로겐, 카르복시, 알킬 및 포르밀로부터 선택되고, R2 는 독립적으로 수소, 할로겐, 알킬, 알콕시, 모르폴리노, CN, 카르복시 및 포르밀로부터 선택되고, R3 은 독립적으로 수소, 할로겐, N-알킬 술페이트, 카르복시, 알콕시, 페닐, CN, CF₃, 및 3차 부틸로부터 선택되고, R4 는 독립적으로 수소, 할로겐 또는 알킬로부터 선택되고, R5 및 R7 은 독립적으로 수소 또는 알킬이고, R6 은 수소, 알킬, 알콕시 및 할로겐으로부터 선택되고, 또는 R3 및 R4 는 방향족 가교를 형성하고, X+ 는 양으로 하전된 반대이온임],
b) 상기 화합물로부터 칼슘 이온을 방출시키는 단계 (상기 방출은 상기 화합물의 흡광도 변화를 야기함),
c) 흡광도의 변화를 측정하는 단계,
d) (c) 에서 측정된 흡광도 변화를 사용하여 칼슘 이온의 농도를 측정하는 단계.
제 1 항에 있어서, 화학식 I 의 화합물을 포함하는 용액이 pH 8.5 내지 pH 11.5 범위의 pH 를 갖는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 화학식 I 의 화합물을 포함하는 용액이 pH 9.0 내지 pH 10.5 범위의 pH 를 갖는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 화학식 I 의 R1 이 수소 또는 할로겐인 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 화학식 I 의 R2 가 수소, 할로겐 또는 알킬인 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 화학식 I 의 R3 이 수소, 할로겐, 카르복시 또는 알콕시인 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 제 1 항의 단계 (b) 에서의 칼슘 이온의 방출이 20℃ 에서 7.0 이상의 칼슘 이온의 결합 상수 log k 를 갖는 칼슘 킬레이트제에 의해 트리거되는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 칼슘 이온의 방출이 EDTA(= 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산), DTPA(= 디에틸렌트리아미노펜타아세트산), EGTA(= 에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N,N-테트라아세트산), DTPMP(= 디에틸렌트리아민펜타(메틸렌포스폰산)) 및 EDPMP(= 에틸렌디아민테트라(메틸렌포스폰산))으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상에 의해 트리거되는 방법.
제 1 항에 정의된 바와 같은 화학식 I 의 화합물을 함유하는 pH 8.5 내지 pH 11.5 범위의 pH 를 갖는 칼슘 측정용 시약.
제 9 항에 있어서, 화학식 I 의 화합물을 0.10 mM 내지 50 mM 범위의 농도로 포함하는 시약.
제 9 항에 있어서, AMPD (= 2-아미노-2-메틸-1.3-프로판디올), CHES (= 2-(N-시클로헥실아미노)-에탄술폰산), AMPSO (= 3-[디메틸(히드록실메틸)-메틸아미노]-2-히드록시프로판술폰산), CAPSO (= 3-시클로헥실아미노)-2-히드록시-1-프로판술폰산), CAPS (= 3-시클로헥실아미노)-2-프로판술폰산)으로부터 선택되는 완충계, 글리신 완충계 또는 탄산염 완충계를 포함하는 시약.
제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 I 의 R1 이 수소 또는 할로겐인 시약.
제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 I 의 R2 가 수소, 할로겐 또는 알킬인 시약.
제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 I 의 R3 이 수소, 할로겐, 카르복시 또는 알콕시인 시약.
제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 시약을 포함하는 칼슘 측정용 시험 키트.