JP5614281B2 - フェニルホスホリルコリン誘導体 - Google Patents
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[式中、R1〜R4はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、若しくはカルボキシル基を表す。但し、R1〜R4の少なくとも一つはハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、若しくはカルボキシル基を表す。]
で示されるフェニルホスホリルコリン誘導体。
[式中、R1〜R4はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、若しくはカルボキシル基を表す。但し、R1〜R4の少なくとも一つはハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、若しくはカルボキシル基を表す。]
で示されるフェニルホスホリルコリン誘導体を含む、ホスホリパーゼD測定用試薬。
[式中、R1〜R4はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、若しくはカルボキシル基を表す。但し、R1〜R4の少なくとも一つはハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、若しくはカルボキシル基を表す。]
で示されるフェニルホスホリルコリン誘導体と、ホスホリパーゼDとを、リン酸モノエステラーゼの存在下に混合して反応を開始させた後、吸光度増加速度を測定し、当該吸光度増加速度に基づいて行うことを特徴とする、カルシウムイオンの定量方法。
[式中、R1〜R4はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、若しくはカルボキシル基を表す。但し、R1〜R4の少なくとも一つはハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、若しくはカルボキシル基を表す。]
で示されるフェニルホスホリルコリン誘導体を含む、カルシウムイオン定量用試薬。
[式中、R1〜R4はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、若しくはカルボキシル基を表す。但し、R1〜R4の少なくとも一つはハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、若しくはカルボキシル基を表す。]
で示されるフェニルホスホリルコリン誘導体、ホスホリパーゼD及びリン酸モノエステラーゼを構成成分として含む、カルシウムイオン定量用キット。
[式中、R1〜R4はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、若しくはカルボキシル基を表す。但し、R1〜R4の少なくとも一つはハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、若しくはカルボキシル基を表す。]
で示される構造を有する。
O-(2-Chloro-4-Nitrophenylphosphoryl)choline、
O-(2-Fluoro-4-Nitrophenylphosphoryl)choline、
O-(3-Chloro-4-Nitrophenylphosphoryl)choline、
O-(3-Fluoro-4-Nitrophenylphosphoryl)choline、
O-(4-Nitro-3-Trifluoromethylphenylphosphoryl)choline、
O-(2-Carboxy-4-Nitrophenylphosphoryl)choline、
O-(3-Carboxy-4-Nitrophenylphosphoryl)choline、
等が挙げられる。
(式中、R1〜R4は前記と同じ。)
で示されるパラニトロフェノール誘導体(以下、「本発明に係るパラニトロフェノール誘導体」と略記する場合がある。)とリン酸化試薬を用いてフェニルホスホジクロリデートを合成し、コリン化合物と縮合する方法に準じて本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体を合成する例を記載する。
ジメチルアミノエタノールに対して、ヨードメタン1.0〜2.0倍モルを、溶媒(例えばジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アニソール、エチレングリコールモノエチルエーテル等のエーテル類、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、エチレングリコール、1,4-ブタンジオール等のアルコール類)中で、-20〜100℃(好ましくは0〜50℃)で0.1〜24時間(好ましくは1〜12時間)反応させることにより、コリン化合物が得られる。
本発明に係るパラニトロフェノール誘導体に対して、オキシ塩化リン1.0〜1.5倍モルを、溶媒(例えばジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アニソール、エチレングリコールモノエチルエーテル等のエーテル類)中で、-80〜0℃、好ましくは-78〜-50℃で0.1〜24時間、好ましくは1〜16時間反応させることにより、本発明に係るフェニルホスホジクロリデートが得られる。
上記(2)で得られた本発明に係るフェニルホスホジクロリデートに対して、上記(1)で得られたコリン化合物0.5〜5.0モル(好ましくは1.0〜2.0モル)を、塩基触媒(例えばピリジン、キノリン、トリエチルアミン、N,N-ジメチルアニリン、ピペリジン、4-ジメチルアミノピリジン、1,5-ジアザビシクロ[4.3.0]ノナ-5-エン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン、トリ-n-ブチルアミン等の有機アミン類)の存在下、必要ならば溶媒(例えばアセトニトリル、プロピオニトリル、n-ブチロニトリル等のニトリル類、例えばテトラヒドロフラン、ジオキサン、アニソール、エチレングリコールモノエチルエーテル等のエーテル類、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、N,N-ジメチルアセトアミド(DMA)、アセトアミド、N-メチルピロリドン等のアミド類)中で-20〜100℃(好ましくは0〜50℃)で0.1〜24時間(好ましくは0.5〜12時間、より好ましくは1〜8時間)で反応させることにより、目的とする本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体が得られる。
O-(2-Fluoro-4-Nitrophenylphosphoryl)choline、
O-(3-Chloro-4-Nitrophenylphosphoryl)choline、
O-(3-Fluoro-4-Nitrophenylphosphoryl)choline、
O-(4-Nitro-3-Trifluoromethylphenylphosphoryl)choline、
が挙げられる。
O-(2-Fluoro-4-Nitrophenylphosphoryl)choline、
O-(3-Fluoro-4-Nitrophenylphosphoryl)choline、及び
O-(4-Nitro-3-Trifluoromethylphenylphosphoryl)choline、
が挙げられる。
反応式:
・ホスホリパーゼD、カルシウムイオン+本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体+水
→ 本発明に係るパラニトロフェニルリン酸誘導体+コリン
・リン酸モノエステラーゼ、本発明に係るパラニトロフェニルリン酸誘導体+水
→ 本発明に係るパラニトロフェノール誘導体(黄色)+リン酸
(2)ホスホリパーゼDを含有する第一試液と、本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体とリン酸モノエステラーゼを含有する第二試液からなるもの。
下記方法により、各種パラニトロフェノール誘導体のpKa及び発色率を測定し、本発明に係るカルシウムイオンの定量方法に使用可能と思われる、パラニトロフェノール誘導体(遊離色素)を選択した。尚、下記説明文中の3a、3b等の記載は、下記表1に記載の化合物名に対応する。
まず、パラニトロフェノールは、和光純薬工業(株)製を用いた。化合物3aは、2-Chloro phenol(和光純薬工業(株)製)をSynthetic Communication, 1996, 26(20), 3783-3790 に記載の方法に従いニトロ化して合成した。
パラニトロフェノールと、表1に記載のパラニトロフェノール誘導体5種、すなわち上記で合成した化合物3aと、化合物3b(和光純薬工業(株)製)、化合物6a(和光純薬工業(株)製)、化合物6b(和光純薬工業(株)製)、化合物6c(東京化成工業(株)製)それぞれの水溶液(濃度:1.55mM)を調製した。次いで、水溶液各100μlを、それぞれ下記pH緩衝液3mLに溶解した(各パラニトロフェノール誘導体の終濃度:50μM)。
緩衝液:50mMグリシン-HCl緩衝液(pH2〜5, 30℃)
50mM MES緩衝液(pH5〜8, 30℃)
50mM CHES緩衝液(pH8〜11, 30℃)
得られた溶解液について、分光光度計(日立U−3000型)で吸収曲線を取り、405nm及びλmaxのOD値とpHをプロットしpKaを求めた。また、405nm及びλmaxでの発色率(pH7緩衝液中におけるパラニトロフェノール誘導体の吸光度/1N NaOH溶液中におけるパラニトロフェノール誘導体の吸光度)も併せて求めた。
結果を表1に示す。
4-nitrophenol:7.1、2-fluoro-4-nitrophenol:7.1、3-4-nitrophenol:5.3、
2,3-difluoro-4-nitrophenol:4.7、2,5-difluoro-4-nitrophenol:4.7、
3,5-difluoro-4-nitrophenol:4.4、4-nitro-2,3,6-trifluorophenol:3.5、
4-nitro-2,3,5,6-tetrafluorophenol:2.9、2-chloro-4-nitrophenol:5.5。
更に表1から明らかな如く、本発明に係るパラニトロフェノール誘導体は、従来のパラニトロフェノールよりもpKaが低下しており、中性付近で高発色していること、すなわち、発色率が増加し、発色安定性が向上することが判る。
以上の結果から、これらのパラニトロフェノール誘導体を遊離するフェニルホスホリルコリン誘導体が、ホスホリパーゼDを用いたカルシウムイオンの定量に、より適していることがわかった。
そこで、次にこれらのパラニトロフェノール誘導体を遊離するフェニルホスホリルコリン誘導体を、下記の反応スキームに従って、合成した。
ジエチルエーテル(500ml)に、ジメチルアミノエタノール(25ml、0.249mmol)とヨードメタン(50g、0.352mmol)を添加し、0℃で終夜撹拌した。反応終了後、析出した塩をジエチルエーテル(300ml)で洗浄し、目的とするコリン化合物(反応スキームAの化合物2)を得た(56.7g、収率99%)。
実験例3で得られた化合物4a (15g、51.7mmol)をアセトニトリル(100ml)に溶解し、それに実験例2で得られた化合物2(11.9g、51.7mmol)とキノリン(6.7g、51.7mmol)を添加し、0℃で6時間撹拌した。その後、精製水(5ml)とピリジン(23ml)を添加し、室温で1時間撹拌した。反応終了後、反応液を飽和重曹水(400ml)で中和し、Sephadex G-10(溶出液:水)で精製を行い、本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体(O-(2-Chloro-4-Nitrophenylphosphoryl)choline、化合物5a、反応スキームBの化合物5において、R=Clの化合物)を得た(5.2g、収率30%)。
Mass(posi=339)
NMR (D2O,400MHz) δ:8.38(d, 1H, J=2.8), 8.13-8.16(dd, 1H, J=2.8,9.2), 7.48(d, 1H, J=9.2)、4.42(t, 2H, J=4.4)、3.65(t, 2H, J=4.4)、3.13(s,9H)。
ジエチルエーテル(200ml)に、オキシ塩化リン(10g、65.2mmol)、化合物3b(反応スキームBの化合物3において、R=Fの化合物、和光純薬工業(株)製)(10.2g、65.2mmol)及びトリエチルアミン(6.6g、65.2mmol)を添加し、-78℃で終夜撹拌した。反応終了後、析出した塩を濾過し、溶媒を減圧留去して、目的とする本発明に係るフェニルホスホジクロリデート(化合物4b、(反応スキームBの化合物4において、R=Fの化合物)を得た(14.4g、収率81%)。
実験例4で得られた化合物4b (14.4g、52.6mmol)をアセトニトリル(100ml)に溶解し、それに実験例2で得られた化合物2(12.2g、52.6mmol)とキノリン(6.8g、52.6mmol)を添加し、0℃で6時間撹拌した。その後、精製水(5ml)とピリジン(25ml)を添加し、室温で1時間撹拌した。反応終了後、反応液を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出液:メタノール)及び再結晶(溶媒:メタノール、アセトン)で精製を行い、本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体(O-(2-Fluoro-4-Nitrophenylphosphoryl)choline、化合物5b、反応スキームBの化合物5において、R=Fの化合物)を得た(6.5g、収率38%)。
Mass(posi=323)
NMR(D2O,400MHz)δ:8.02-8.10(m, 2H)、7.41-7.45(dd, 1H, J=8.0,16.8)、4.39(t, 2H, J=4.4)、3.63(t, 2H, J=4.4),3.13(s, 9H)。
実験例5で得られた化合物7a (12.1g、41.7mmol)をアセトニトリル(100ml)に溶解し、実験例2で得られた化合物2(9.6g、41.7mmol)とキノリン(5.4g、41.7mmol)を添加し、0℃で6時間撹拌した。その後、精製水(5ml)とピリジン(25ml)を添加し、室温で1時間撹拌した。反応終了後、反応液を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出液:メタノール)及び再結晶(溶媒:メタノール、アセトン)で精製を行い、本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体(O-(3-Chloro-4-Nitrophenylphosphoryl)choline、化合物8a、反応スキームCの化合物8において、R=Clの化合物)を得た(5.1g、収率36%)。
Mass(posi=339)
NMR(D2O,400MHz)δ:8.01(dd, 1H, J=0.8,8.8)、7.38(dd, 1H, J=1.2,2.4)、7.19-7.22(m, 1H)、4.35(t, 2H, J=4.4),3.61(t, 2H, J=4.4)、3.12(s, 9H)。
ジエチルエーテル(200ml)に、オキシ塩化リン(10g、65.2mmol)、化合物6b(反応スキームCの化合物6において、R=Fの化合物、和光純薬工業(株)製)(10.2g、65.2mmol)及びトリエチルアミン(6.6g、65.2mmol)を添加し、-78℃で終夜撹拌した。反応終了後、析出した塩を濾過し、溶媒を減圧留去して、目的とする本発明に係るフェニルホスホジクロリデート(化合物7b、反応スキームCの化合物7において、R=Fの化合物)を得た(14.4g、収率81%)。
実験例6で得られた化合物7b (14.4g、52.6mmol)をアセトニトリル(100ml)に溶解し、実験例2で得られた化合物2(12.2g、52.6mmol)とキノリン(6.8g、52.6mmol)を添加し、0℃で6時間撹拌した。その後、精製水(5ml)とピリジン(25ml)を添加し、室温で1時間撹拌した。反応終了後、反応液を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出液:メタノール)及び再結晶(溶媒:メタノール、アセトン)で精製を行い、本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体(O-(3-Fluoro-4-Nitrophenylphosphoryl)choline、化合物8b、反応スキームCの化合物8において、R=Fの化合物)を得た(6.6g、収率39%)。
Mass(posi=323)
NMR(D2O,400MHz)δ:8.11(dd, 1H, J=,8.8,18.0)、7.07-7.15(m, 2H)、4.35(t, 2H, J=4.4)、3.61(t, 2H, J=4.4)、3.12(s,9H)。
ジエチルエーテル(200ml)に、オキシ塩化リン(7.0g、45.6mmol)、化合物(6c)(反応スキームCの化合物6において、R=CF3の化合物、東京化成工業(株)製)(9.5g、45.6mmol)、トリエチルアミン(4.6g、45.6mmol)を添加し、-78℃で終夜撹拌した。反応終了後、析出した塩を濾過し、溶媒を減圧留去して、目的とする本発明に係るフェニルホスホジクロリデート(化合物7c、反応スキームCの化合物7において、R=CF3の化合物)を得た(12.5g、収率85%)。
実験例7で得られた化合物7c (12.5g、38.6mmol)をアセトニトリル(100ml)に溶解し、実験例2で得られた化合物2(8.9g、38.6mmol)とキノリン(5.0g、38.6mmol)を添加し、0℃で6時間撹拌した。その後、精製水(5ml)とピリジン(25ml)を添加し、室温で1時間撹拌した。反応終了後、反応液を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出液:メタノール)及び再結晶(溶媒:メタノール、アセトン)で精製を行い、本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体(O-(4-Nitro-3-Trifluoromethylphenylphosphoryl)choline、化合物8c、反応スキームCの化合物8において、R=CF3の化合物)を得た(3.3g、収率23%)。
Mass(posi=373)
NMR(D2O,400MHz)δ:8.05(d, 1H, J=,8.8)、7.63(d, 1H, J=1.6)、7.51(dd, 1H, J=2.0,9.2)、4.36(t, 2H, J=4.4)、3.61(t, 2H, J=4.4)、3.12(s, 9H)。
ジクロロメタン(500ml)に3,5−ジフルオロフェノール(反応スキームDの化合物9、和光純薬工業(株)製)(25.0g、0.19mol)を溶解し、0℃で70%濃硝酸(13.5ml、0.19mol)をゆっくり添加し、3時間撹拌した。反応終了後、反応液を氷水に投入し、抽出(CH2Cl2)、乾燥(MgSO4)を実施し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出液;酢酸エチル:ヘキサン=1:9)で精製して、目的とする3、5−ジフルオロ−4−ニトロフェノール(反応スキームDの化合物10)を得た(12.8g、収率38%)。
ジエチルエーテル(250ml)に、オキシ塩化リン(10.7g、69.7mmol)、実験例8で得られた化合物10(12.2g、69.7mmol)、トリエチルアミン(7.1g、69.7mmol)を添加し、-78℃で終夜撹拌した。反応終了後、析出した塩を濾過し、溶媒を減圧留去して、目的とする本発明に係るフェニルホスホジクロリデート(反応スキームDの化合物11)を得た(14.3g、収率70%)。
実験例9で得られた化合物11 (14.2g、48.6mmol)をアセトニトリル(100ml)に溶解し、実験例2で得られた化合物2(11.2g、48.6mmol)とキノリン(6.3g、48.6mmol)を添加し、0℃で6時間撹拌した。その後、精製水(6ml)とピリジン(21ml)を添加し、室温で1時間撹拌した。反応終了後、反応液を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出液:メタノール)及び再結晶(溶媒:メタノール、アセトン)で精製を行い、本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体(反応スキームDの化合物12)を得た(3.2g、収率20%)。
Mass(posi=339)
NMR(D2O,400MHz)δ: 6.99 (d, 2H, J=10.8)、4.36 (t, 2H, J=4.0), 3.62 (t, 2H, J=4.0)、3.14 (s,9H)。
(1)試液の調製
下記の組成の各試液を調製した。
試液1:4U/mlホスホリパーゼD(旭化成株式会社製T−07、Streptomyces chromofuscus由来)、53.3μMグリコールエーテルジアミン四酢酸、13.3μMジエチレントリアミン五酢酸、33.3mM塩化マグネシウム、0.13%トリトンX−100を含有する1.1mM PIPES−NaOH緩衝液(pH7.3)。
試液2:0〜100mMのパラニトロフェニルホスホリルコリン、もしくは上記実施例3及び4で合成した本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体(反応スキームCの化合物8a又は化合物8c)、5U/mlアルカリホスファターゼを含有する5mM PIPES−NaOH緩衝液(pH7.2)。
カルシウムイオン溶液:塩化カルシウム(和光純薬工業(株)製、特級)を精製水で希釈して、カルシウムイオンとして100mg/dLの水溶液を調製し、カルシウムイオン溶液とした。
日立自動分析機(7170型)を用い、試液1を180μL、試液2を60μL、及びカルシウム溶液4μLを混合し、37℃で反応を行い、主波長405nm、副波長660nmの吸光度を経時的に測定し、反応タイムコースを得た。得られた反応タイムコースから、吸光度増加速度を計算した。
次いで、用いた各基質(パラニトロフェニルホスホリルコリン又は本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体)の濃度に対する吸光度増加速度をプロットし、逆数グラフを得た。
得られた基質濃度(mM)と吸光度増加速度(ΔE/min)との関係を、図1に示す。
図1において、(a)はホスホリパーゼDの基質として従来のパラニトロフェニルホスホリルコリンを、(b)〜(c)はホスホリパーゼDの基質として本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体を、すなわち化合物8a又は化合物8cをそれぞれ用いた場合の結果を示す。
また、図1をもとに得られた各逆数グラフの近似式からKmを求めた。
結果を表2に示す。
上記各実施例で合成した本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体を用いて、カルシウムイオンの定量を行った。
下記の組成の各試液を調製した。
試液1:4U/mlホスホリパーゼD(旭化成株式会社製T−07、Streptomyces chromofuscus由来)、53.3μMグリコールエーテルジアミン四酢酸、13.3μMジエチレントリアミン五酢酸、33.3mM塩化マグネシウム、0.13%トリトンX−100を含有する61.1mM PIPES−NaOH緩衝液(pH7.3)。
試液2:16mMのパラニトロフェニルホスホリルコリン、もしくは上記実施例2,3,4,5で合成した本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体(反応スキームBの化合物5b、反応スキームCの化合物8a、化合物8b、化合物8c)、5U/mlアルカリホスファターゼを含有する5mMPIPES−NaOH緩衝液(pH7.2)。
カルシウムイオン標準液:マルチキャリブレーターA(和光純薬工業(株)製) 10 mg/dL。
カルシウムイオン溶液:〔和光純薬工業(株)製 塩化カルシウム、特級〕を用いてCa:20 mg/dL溶液を調製し、本品を精製水で希釈して、各濃度の水溶液(1mg/dL、2mg/dL、4mg/dL、10mg/dL、20mg/dL)を調製した。
日立自動分析機(7170型)を用い、試液1を180μL、試液2を60μL、及び各濃度のカルシウムイオン溶液 4μLを混合し、37℃で反応を行い、主波長405nm、副波長660nmの吸光度を、各測光ポイントで経時的に測定し、反応タイムコースを得た。
結果を図2(a)〜(e)に示す。
図2において、(a)はホスホリパーゼDの基質として従来のパラニトロフェニルホスホリルコリンを、(b)〜(e)はホスホリパーゼDの基質として、本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体を、すなわち化合物5b、化合物8a、化合物8b、化合物8cをそれぞれ用いた場合の結果を示す。
尚、各試薬の最終反応液中の濃度は、それぞれ本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体は約4mM、ホスホリパーゼDは約3U/mL、アルカリホスファターゼは約1.25U/mLである。
また、得られた反応タイムコースから吸光度増加速度を計算した。
別に、カルシウムイオン溶液の代わりに精製水又はカルシウムイオン標準液(10mg/dL)を用いる以外は上記と同様に反応を行い、吸光度を経時的に測定し、得られた反応タイムコースから吸光度増加速度を計算し、カルシウムイオン濃度と吸光度増加速度との関係を示す検量線を作成した。
次いで、上記で得られた、各濃度のカルシウム溶液毎に測定を行って得られた吸光度増加速度を、検量線に当てはめ、各カルシウム溶液の濃度を求めた。
各カルシウム溶液のカルシウムイオン濃度(検体Ca量)と、検量線から求めた当該カルシウム溶液のカルシウムイオン濃度(測定値)との関係を図3(a)〜(e)に示す。
図3において、(a)はホスホリパーゼDの基質として従来のパラニトロフェニルホスホリルコリンを、(b)〜(e)はホスホリパーゼDの基質として、本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体を、すなわち化合物5b、化合物8a、化合物8b、化合物8cをそれぞれ用いた場合の結果を示す。
図3(b)〜(e)から明らかな如く、本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体を用いてカルシウムイオンの定量を行った場合、従来のパラニトロフェニルホスホリルコリンを用いた場合(図3(a))と同様に、カルシウムイオン濃度に比例した、良好な検量線が得られ、ホスホリパーゼDを用いたカルシウムイオンの定量に用いることが出来ることが判る。
また、測定に用いたカルシウム溶液の実際のカルシウム濃度と、検量線より求めた同じカルシウム溶液のカルシウム濃度とは良く相関しており、この測定系により得られた測定値の信頼度が高いことがわかる。
(1)試液の調製
下記の組成の試液1及び試液2を調製した。
試液1:実施例8と同じ。
試液2:16mMのパラニトロフェニルホスホリルコリン、もしくは上記実施例4及び実施例5で合成した本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体(化合物8b又は化合物8c)、5U/mlアルカリホスファターゼを含有する5mM PIPES−NaOH緩衝液(pH7.2)。
日立自動分析機(7170型)を用い、試液1を180μL、試液2を60μL、及び生理食塩水を混合し、37℃で反応を行い、405nmの吸光度を測定した。
その後、試液2を冷蔵(7℃)と過酷(25℃)条件にて保存し、2週間後、4週間後に、生理食塩水を試料として、同様の測定を行った。
結果を図4(a)〜(c)に示す。
図4において、(a)は従来のパラニトロフェニルホスホリルコリンを、(b)及び(c)は本発明のニトロフェニルホスホリルコリン誘導体を、すなわち化合物8b又は化合物8cをそれぞれ用いた場合の結果を示す。
また、図4(a)〜(c)において、―□―は冷蔵(7℃)で保存した場合、―■―は過酷(25℃)条件で保存した場合の結果をそれぞれ示す。
図4(b)〜(c)より明らかな如く、本発明に係るフェニルホスホリルコリン誘導体(化合物8b,8c)は、4週間、7℃又は25℃で保存しても絶対吸光度の変化がほとんどなく、従来のパラニトロフェニルホスホリルコリン(図4(a))と同程度の安定性があることが判る。
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