JPH0687800B2 - リパ−ゼ基質、及びリパ−ゼの視覚的測定法及び測定試薬 - Google Patents

リパ−ゼ基質、及びリパ−ゼの視覚的測定法及び測定試薬

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JPH0687800B2
JPH0687800B2 JP61099516A JP9951686A JPH0687800B2 JP H0687800 B2 JPH0687800 B2 JP H0687800B2 JP 61099516 A JP61099516 A JP 61099516A JP 9951686 A JP9951686 A JP 9951686A JP H0687800 B2 JPH0687800 B2 JP H0687800B2
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 リパーゼ（トリアシルグリセリンアシルヒドロラーゼEC
3.1.1.3）は油滴及び水性相間の界面の乳化した長鎖脂
肪酸のトリグリセリドを加水分解する。急性膵炎又は膵
臓癌のような一定の疾患においては、通常非常に低い血
清中のリパーゼ濃度が上昇し、従つて、リパーゼ活性の
測定は臨床上著しく重要である。従つて、リパーゼ測定
は臨床化学にとつて、並びに生物化学、薬化学及び栄養
化学にとつても著しく重要である。
従来技術 すでに一連のリパーゼ測定法が公知である。こうして、
遊離酸をアルカリ液で滴定する。該方法は妨害を受けや
すく、特に特異的ではない。更にUV中での測光法は公知
である。こうして、西ドイツ国特許公開第3342106号公
報中にはUV−測定用基質として非イオン系界面活性剤と
組合わせた高脂肪酸のモノ−又はジクリセリドの使用が
記載されている。しかしながらUV−テストは比較的費用
のかかる測定装置を必要とし、かつ装置の故障、試薬の
消耗のような可能な妨害がしばしば容易にわからない。
従つて、簡単な装置で実施することができ、直接視覚的
にコントロールすることができる呈色テストに対する要
求がある。
基質としてのジメルカプトプロパノール−トリエステル
を色原体としてのジチオビスニトロ安息香酸、エステラ
ーゼ阻害剤及びリパーゼ賦活剤と一緒に使用するクロオ
カ（Kurooka）による呈色テストはすでに公知である。
しかしながらこの方法は十分な正確さを示さない（J.Cl
in.Chem.Clin.Biochem.第20巻、537〜552頁（1982
年））。更に、基質としてトリリノレイン、補助系とし
てリポキシゲナーゼを用いる方法が公知であるが、この
際引き続き行なう呈色反応において脂肪酸ヒドロペルオ
キシドにより鉄（II）を鉄（III）に酸化し、かつチオ
シアン酸鉄（III）を検出する。この方法は全く信頼の
おける結果を示さない（J.Clin.Chem.Biochem.第20巻、
第745〜752頁（1982）） 混濁測定も公知であるが、比較的僅かな感度を示す。
発明が解決しようとする問題点 従つて、本発明の課題は公知呈色テストの欠点を示さ
ず、正確な結果を提供し、操作が簡単で高い感度を有
し、種々の自動分析システムへの適応が困難ではない僅
かな積層相を有する、リパーゼの測定のための呈色テス
トを提供することである。
問題点を解決するための手段 この課題は本発明により一般式 〔式中、Ａは炭素原子数１〜16のアルキレン基又は炭素
原子数２〜16のアルケニレン基を表わし、Ｒ及びR1は同
一又は異なっていてよく、それぞれ炭素原子数１〜20の
アルキル基又はアシル基、又は炭素原子数２〜20のアル
ケニル基を表わすか、又はC1〜8−アルキル置換してい
てよいアリール基又はアルキル基中の炭素原子数１〜８
のアルアルキル基を表わし、基Ｒ及びR1の一方は水素原
子であってもよく、Ｘは芳香族ヒドロキシ−又はチオー
ル化合物の基を表わし、かつそれぞれＹ及びＺは相互に
独立して−Ｓ−又は−Ｏ−を表わし、Ｚは−CH2−も表
わす〕のリパーゼ基質により解決する。
リパーゼの作用下に、本発明によるリパーゼ基質は基Ｘ
に相応する芳香族ヒドロキシ化合物又はチオール化合物
の遊離下に切断され、これらの化合物を直接視覚的に測
定するか又は好適な発色団又は螢光団とカツプリングさ
せ、カツプリング生成物を測定する。
Ｒ又は／及びR1は有利に炭素原子数６〜18、特に８〜12
を表わす。加水分解に対する非鋭敏性のために、Ｒ及び
R1はアシル基よりアルキル基が特に有利である。天然の
トリグリセリドはアシル基を有しているにもかかわら
ず、Ｒ及びR1がアルキル、アルケニル又はアルアルキル
を有する化合物が良好なリパーゼ基質であることが判明
したのは意外であつた。
Ｒ及び／又はR1の例はアルキル基としてメチル−、エチ
ル−、プロピル−、ブチル−、ペンチル−、ヘキシル
−、ヘプチル−、オクチル−、ノニル−、デシル−、ウ
ンデシル−、ドデシル−、テトラデシル−、ヘキサデシ
ル−及びオクタデシル基であり、更に相応するアシル
基、例えばアセチル−、プロピオニル−、ブチリル−、
バレリル−、カプロニル−、カプリル−、カプリニル
−、ラウリル−、ミリスチル−、パルミチル−及びステ
アリル基並びにオレイル−、クロトニル−、リノリル
基、フエニル−、ベンジル−又はオクチルフエニル基で
ある。
本発明によるリパーゼ基質はジカルボン酸COOH−Ａ−CO
OH（式中、Ａは有利に炭素原子数３〜７である）の基を
有する。Ａが誘導される酸の例としてはマロン酸、コハ
ク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン
酸、アゼライン酸、セバシン酸、ノナンジカルボン酸、
デカンジカルボン酸及びウンデカンジカルボン酸であ
る。炭素原子数３〜７のＡに相応する、グルタール酸〜
アゼライン酸が前記のように有利である。
Ｘは芳香族ヒドロキシ−又はチオール化合物であつて良
いが、これは発色団を形成するか又は後反応によりはじ
めて色素に変換することができる。典型的な例はフエノ
ール、チオフエノール、ナフトール、チオナフトール及
びその誘導体並びに自体発色団である化合物、例えばレ
ゾルフイン−、クロルフエノールレツド−、インドキシ
ル−又はチオフルオレシイン基である。好適なヒドロキ
シ−又はチオール化合物をすべて挙げることはその数が
非常に多いので不可能であるが、まさに発色性である
か、又は発色団に変換可能な芳香族ヒドロキシ−又はチ
オール化合物は専門家に公知である。
僅かな極性を示し、かつ親油性である発色団が有利であ
る。しかしながら水溶性はなお保証されているべきであ
る。
前記発色団の親油性特性は好適な置換により、例えばア
ルキル基でプラスに影響をうける。レゾルフイン基に好
適な置換分としては特にメチル−、ジメチル−及びエチ
ル基を挙げることができるが、臭素での置換も好適であ
る。
本発明による化合物は新規である。該化合物は不斉中心
を有しており、従つて光学活性である。リパーゼ基質と
しては通常の製法により生じるラセミ体としても、光学
活性異性体としても使用することができる。
本発明によるリパーゼ基質の製造は自体公知の方法によ
り行なうことができる。こうして、1,2−Ｏ−ジエ−テ
ル−及び1,2−ジアシルグリセリン誘導体は例えばメソ
ツズ・イン・エンテモロギー（Methods in Enzymolog
y）、第98巻、第623頁（1983）及びオレギネー（Oleagi
neux）、第23巻、第185頁（1968年）中に記載されてい
る。アルカンジオール誘導体からの合成は、例えばカナ
デイアン・ジヤーナル・オブ・ビオケミストリー（Can.
J.Biochem.）第46巻、第69頁（1968年）に記載されてい
る。
1,2−Ｏ−ジエ−テル−及び1,2−ジアシル−グリセリン
化合物から出発し、クロロホルム／ピリジンのような無
水媒体中で相応するジカルボン酸無水物と反応させるこ
とにより相応するグリセロジカルボン酸モノエステルが
得られる。ジカルボン酸無水物を製造するための好適な
方法はフーベン・バイル・ミユラー（Houben-Weyl-Muel
ler）の“メトーデン・デル・オルガーニツシエン・ケ
ミー（Methoden der Organischen Chemie）”、第IV/4
巻、第786頁に記載されている。
基Ｘが誘導される芳香族ヒドロキシ−又はチオール化合
物でのモノエステルのエステル化は、例えばジシクロヘ
キシルカルボジイミドのような吸湿剤の存在下に芳香族
アルコール又はチオールとジカルボン酸モノエステルと
を直接反応させることにより実施される。更に、ジカル
ボン酸モノエステルを活性化エステル、例えばヒドロキ
シスクシンイミドエステル又はイミダゾリドに変換し、
かつ活性化エステルを芳香族アルコール又はチオールと
反応させることによつても実施することができる。
まず、芳香族アルコール又はチオールを用いてジカルボ
ン酸のモノエステル、例えばアジピン酸−モノニトロフ
エニルエステル又はグルタル酸モノフエニルエステルを
製造し、次いでこれを1,2−Ｏ−ジアルキル−もしくは
−ジアシルグリセリンで、例えば酸クロリド、酸無水物
又は活性化エステルの中間体形成を介してエステル化す
ることも同様に可能である。芳香族アルコール又はチオ
ールとのジカルボン酸モノエステルの製造は例えば酸無
水物と芳香族化合物とから1:1のモル比で、又はジカル
ボン酸と芳香族化合物とから2:1のモル比で、又は容易
に脱離可能な保護基を有するジカルボン酸モノエステル
と芳香族化合物とから行なうことができる。好適な方法
は例えばアルヒブ・デル・フアルマツイー（Arch.Phar
m.）、第287巻、第514頁（1954年）に記載されている。
更に、1,2−Ｏ−ジアルキル−もしくは1,2−Ｏ−ジアシ
ルグリセロ−ジカルボン酸−モノエステルは、先ずジカ
ルボン酸と容易に脱離性のアルコール、例えばベンジル
アルコール又は2,2,2−トリクロルエチルアルコールと
からジカルボン酸モノエステルを製造し、次いでこのよ
うにして得られた酸を前記ジアルキル−もしくはジアシ
ル−グリセリンでエステル化することにより製造される
ことができる。引き続き、保護基を除去し、芳香族アル
コール又はチオールとの反応を前記のように行なう。
もう１つの製造法は、先ず1,2−イソプロピリデン−グ
リセリンのような保護グリセリンをジカルボン酸モノエ
ステルと反応させて相応して保護されたグリセロ−３−
ジカルボン酸−ジエステルを形成し、次いでグリセリン
の保護基を除去し、遊離したOH基をアルキル化もしくは
アシル化する。最後に、最初に存在したモノエステル基
（カルボキシル保護基）を脱離し、芳香族アルコール又
はチオールと反応させる。
本発明による基質の前記の製法はすべてではなく、専門
家は本発明によるすべての化合物を容易に製造すること
ができる一連の自体公知法を更に提供することができ
る。前記方法により得られたラセミ生成物から、所望の
場合光学的に純粋な異性体を公知の分割法により得るこ
とができる。同様に、該異性体を自体公知法で立体特異
的に経過する製法により獲得することもできる。
リパーゼの視覚的測定のための本発明による方法は、本
発明によるリパーゼ基質にリパーゼ含有試料を作用さ
せ、遊離した芳香族ヒドロキシ−又はチオール化合物の
量を直接又は好適な発色団と結合させたのち生じた色素
を視覚的に測定することを特徴とする。
この方法の特徴は、公知方法において何重にも必要とさ
れる助酵素又はエステラーゼ阻害剤を必要としないこと
にある。この種の添加物は高いだけでなく、多くの場合
あまり安定ではない。本発明の特別な利点は、本発明に
よるリパーゼ基質及び緩衝物質と共に、界面活性剤、特
に胆汁酸塩、コリパーゼ、発色性カツプラー及び／又は
塩化ナトリウムのような塩を含有する、良好な保存性を
有する視覚的測定用試薬を可能としたことである。更
に、該試薬は有利に尿素、保存剤及び／又は活性化剤を
含有することができる。
有利な組成中には次の試薬を含有する： 基質 0.05〜10mg/ml、 デソキシコール酸塩 ２〜50mg/ml、 コリパーゼ 0.001〜0.01mg/ml、 尿素 １〜100mg/ml、 NaCl 0.1〜10mg/ml、 緩衝物質 １〜50mg/ml、 （それぞれ試験における調合済溶液に対して） 胆汁酸としては公知界面活性胆汁酸、例えばコール酸、
タウロコール酸、デソキシコール酸、タウロデソキシコ
ール酸、グリコデソキシコール酸もしくはそのアルカリ
塩、特にナトリウム塩を挙げることができる。有利な量
は２〜50mg/mlである。
本発明による試薬のその他の主な成分はコリパーゼであ
る。特に好適であるのは不純物不含コリパーゼである。
有利な量は0.001〜0.01mg/mlである。
更に本発明による試薬は尿素を、有利に１〜100mg/mlを
含有していてよい。
緩衝物質としては、本発明による試薬の範囲においてpH
値を6.0と10.5との間に調整するすべての公知緩衝剤が
好適である。有利なpH値範囲は7.0と9.5との間である。
好適な緩衝剤の例はジエタノールアミン緩衝剤、トリエ
タノールアミン緩衝剤、トリス緩衝剤、及びグツド（Go
od）緩衝剤、例えばヘペス（Hepes）−緩衝剤（凍結乾
燥前の添加に好適である）、タプス（Taps）−緩衝剤、
CHES−緩衝剤（２−（シクロヘキシルアミノ）−エタン
スルホン酸）及びビシン（Bicine）である。有利な緩衝
物質量は１〜50mg/mlの間にある。
塩としてはアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩及びア
ンモニウム塩が好適であり、0.1〜10mg/mlの濃度で使用
するのが有利である。
保存剤としては測定すべきリパーゼの酵素活性を妨害し
ないものが本発明の範囲において好適である。特に好適
であるのはアルカリアジド、特にナトリウムアジドであ
る。他の保存剤、例えばチオジド及び他の硫黄含有保存
剤も同様に好適である。保存剤の有利な量は0.01〜2mg/
mlである。
活性化剤としてはアルカリ土類金属イオン、有利にカル
シウムイオンが好適である。カルシウムイオンはデソキ
シコール酸と不溶性の化合物となるので、カルシウムの
存在においては胆汁酸としてタウロデソキシコール酸が
有利である、それというのもタウロデソキシコール酸は
１〜５ミリモルという高いカルシウム濃度で許容性であ
るためである。
最終組成に希釈することを指示した、乾燥又は濃縮した
剤形を使用する場合、該剤形は前記物質を相応する量比
で、かつ有利に保護コロイドで含有する。
保護コロイドとしては化学者に公知の物質、例えばポリ
ヒドロキシ化合物、血清アルブミン、ポリビニルピロリ
ドン、固体ポリエチレンオキシド等である。有利にはポ
リヒドロキシ化合物、特に分子中にペントース単位１〜
10もしくはヘキソース単位１〜10を有するモノマーもし
くはポリマーのペントース又はヘキソース及び／又は室
温で固定のポリエチレングリコールである。好適なポリ
ヒドロキシ化合物の有利な例はマンニツト及び類似の糖
アルコール、グルコースのオリゴ糖類、マンノース、マ
ルトヘプタオース、平均分子量3500〜7000のポリエチレ
ングリコール、その他これに類するものである。他の使
用可能な保護コロイドは例えばアラニンのようなアミノ
酸、アラビヤゴムのような植物ゴム糖である。保護コロ
イドもしくは保護コロイドの混合物の有利な量は20〜90
重量％である。特に好適であるのは糖アルコール及びポ
リアルキレングリコールの混合物である。
本発明による試薬は好適な担体材料上に含浸されて存在
していてもよい。吸収性担体材料並びに膨潤性、可溶性
フイルム形成性担体材料を挙げることができる。この形
において、本発明による試薬は直接視覚的に又は好適な
測定装置により測定することのできる試験テープの製造
を可能にした。
リパーゼを測定するための本発明による呈色試験は高い
感度で著しく正確な結果をもたらす。本発明によう呈色
試験は操作が非常に簡単であり、試験テープにも好適で
ある。積層相が非常に僅かであるか、又は全くないの
で、種々の自動分析装置に容易に適用することができ
る。
測定自体は終点法によつても、動力学的にも実施するこ
とができる。栓をしなくてもよいし、生じた反応生成物
の振盪もしなくてよいので、多くの公知法に対して動力
学的に実施することができるという利点を有する。
実施例 次に実施例につき本発明を詳細に説明する。
例１ ａ）1,2−Ｏ−ジヘキシル−rac−グリセロ−３−グルタ
ル酸モノエステル クロロホルム30ml中の1,2−Ｏ−ジヘキシルグリセリン
3.3g（11.5ミリモル）の溶液に、順次ピリジン2.5ml、
４−ジメチルアミノピリジン スパーテル先端量及びグ
ルタル酸無水物2.6g（23ミリモル）を添加する。混合物
を10時間還流下に加熱し、冷却後クロロホルム200mlで
希釈する。クロロホルム相を1N塩酸で振出し、乾燥させ
る。乾燥剤の濾別後、溶剤を吸引濾過し、残分をシリカ
ゲルカラムを介して（溶離剤：酢酸エステル／石油エー
テル1:1）精製する。
TLC:Rf:0.45（酢酸エステル／石油エーテル1:2＋氷酢１
％） 1,2−Ｏ−ジヘキシル‐rac−グリセロ−３−グルタル酸
−レゾルフインエステル： ｂ）1a）1.4g（3.7ミリモル）をクロロホルム20ml中に
溶かし、氷冷下に蓚酸クロリド2ml（23.3ミリモル）を
滴加する。氷浴を除去し、溶液を室温で12時間攪拌す
る。引き続き、溶剤を留去し、残分をトルエン中に取り
込み、再たび濃縮する。このようにして得られた油状物
質を更に精製することなく使用する。
ｃ）レゾルフイン0.8g（3.7ミリモル）をジメチルホル
ムアミド40ml中にピリジン1.1ml及びスパーテル先端部
量の4-ジメチルアミノピリジンの添加下に懸濁させる。
これにジメチルホルムアミド20ml中の1b）の溶液を滴加
する。室温で１〜２日間攪拌した後、濾過し、溶剤を蒸
発させる。残分を酢酸エステル中に取り込み、不溶性の
成分を濾別し、濾液を1N塩酸、次いで水で振盪する。有
機相を乾燥させ、溶剤を留去すると、油状残分が得ら
れ、これをシリカゲルのカラムクロマトグラフイーを介
して精製する（溶離剤：酢酸エステル／石油エーテル
1:1）。TLC:Rf:0.70（酢酸エステル／ヘキサン 1:1） 例２ ａ）1,2−Ｏ−ジオクチル−rac−グリセロ−３−グルタ
ル酸−モノエステル 例1a）と同様にして、1,2−Ｏ−ジオクチル−グリセリ
ン13g（41ミリモル）、クロロホルム150ml、ピリジン10
ml及びグルタル酸無水物6.8g（59.5ミリモル）から製
造。
収率:6.5g（37％） TLC:Rf:0.31（酢酸エステル／石油エーテル1:1）。
1,2−Ｏ−ジオクチル−rac−グリセロ−３−グルタル酸
レゾルフインエステル： ｂ）例1b）と同様にして2a）2g（4.5ミリモル）から製
造。
ｃ）レゾルフイン0.96g（4.5ミリモル）をクロロホルム
50ml中に、1,8-ジアザビシクロ−（5,4,0）−ウンデク
−７−エン0.75ml（５ミリモル）及び４−ジメチルアミ
ノピリジン0.1gの添加下に溶かす。ここにクロロホルム
20ml中の2b）の溶液を滴下する。１〜２日間室温で攪拌
した後、濾過して、溶剤を留去する。例1c）と同様に処
理を行なう。
TLC:Rf:0.66（酢酸エステル／ヘキサン1:1）。
例３ ａ）1,2−Ｏ−ジオクチル−rac−グリセロ−３−ピメリ
ン酸−モノエステル 例1a）と同様にして1,2−Ｏ−ジオクチルグリセリン3.2
g（10ミリモル）及びピメリン酸無水物2.1g（15ミリモ
ル）から製造。
TLC:Rf:0.61（酢酸エステル／石油エーテル1:1） IR（cm-1）：（膜）:1740、1710。
1,2−Ｏ−ジオクチル−rac−グリセロ−３−ピメリン酸
−レゾルフインエステル： ｂ）例1b）と同様にして3a）2.2g（4.7ミリモル）から
製造 ｃ）例2c）と同様にして、レゾルフイン1g（4.7ミリモ
ル）、1,8−ジアザビシクロ−（5,4,0）−ウンデク−７
−エン0.7ml及び3b）から例2c）と同様に製造。
TLC:Rf＝0.78（酢酸エステル／ヘキサン1:2） 例４ ａ）1,2−Ｏ−ジオクチル−rac−グリセロ−３−アゼラ
イン酸−モノエステル 例1a）と同様にして1,2−Ｏ−ジオクチル−グリセリン
6.3g（20ミリモル）、クロロホルム80ml、ピリジン5ml
及びアゼライン酸無水物5.2g（30ミリモル）から製造。
1,2−Ｏ−ジオクチル−rac−グリセロ−３−アゼライン
酸−レゾルフインエステル： ｂ）例1b）と同様にして4a）3.2g（6.5ミリモル）及び
蓚酸クロリド3mlから製造。
ｃ）例2c）と同様にしてレゾルフイン1.4g（6.5ミリモ
ル）、クロロホルム65ml、1,8−ジアザビシクロ−（5,
4,0）−ウンデク−７−エン1.1ml及び4b）から製造。
TLC:Rf＝0.86（酢酸エステル／ヘキサン1:2） IR（cm-1）：（膜）1762、1736 例５ ａ）1,2−Ｏ−ジデシル−rac−グリセロ−３−グルタル
酸−モノエステル 例1a）と同様にして1,2−Ｏ−ジデシル−グリセリン3.7
g（10ミリモル）、クロロホルム40ml、ピリジン2.5ml及
びグルタル酸無水物1.8g（15.8ミリモル）から製造。
TLC:Rf:0.77（酢酸エステル／ヘキサン1:2） 1,2−Ｏ−ジデシル−rac−グリセロ−３−グルタル酸−
レゾルフインエステル： ｂ）例1b）と同様にして5a）2.5g（５ミリモル）、クロ
ロホルム50ml及び蓚酸クロリド2.2mlから製造。
ｃ）例2c）と同様にしてレゾルフイン1.1g（５ミリモ
ル）、1,8−ジアザビシクロ−（5,4,0）−ウンデク−７
−エン1ml及び5b）から製造。
TLC:Rf＝0.70（酢酸エステル／ヘキサン1:1） 例６ ａ）1,2−Ｏ−ジウンデシル−rac−グリセロ−３−グル
タル酸−モノエステル 例1a）と同様にして1,2−Ｏ−ジウンデシル−グリセリ
ン2g（５ミリモル）、クロロホルム25ml、ピリジン1.4m
l及びグルタル酸無水物0.9g（7.5ミリモル）から製造。
TLC:Rf:0.55（酢酸エステル／石油エーテル1:2） IR（cm-1）：（膜）1740、1710 1,2−Ｏ−ジウンデシル−rac−グリセロ−３−グルタル
酸−レゾルフインエステル： ｂ）例1b）と同様にして6a）2g（3.9ミリモル）、クロ
ロホルム5ml及び蓚酸クロリド1.8mlから製造。
ｃ）例2c）と同様にして、レゾルフイン0.83g（3.9ミリ
モル）、1,8−ジアザビシクロ−（5,4,0）−ウンデク−
７−エン0.61ml及び6b）から製造。
TLC:Rf＝0.47（RP18、エタノール／アセトン2:1） 例７ ａ）1,2−Ｏ−ジラウリル−rac−グリセロ−３−グルタ
ル酸−モノエステル 例1a）と同様にして、1,2−Ｏ−ジラウリル−グリセリ
ン10.7g（25ミリモル）、クロロホルム70ml、ピリジン
5.5ml及びグルタル酸無水物3.3g（29ミリモル）から製
造。
TLC:Rf:0.33（酢酸エステル／石油エーテル1:1） IR（cm-1）：（膜）:1741、1708 1,2−Ｏ−ジラウリル−rac−グリセロ−３−グルタル酸
ーレゾルフインエステル ｂ）例1b）と同様にして、7a）5.5g（10ミリモル）、ク
ロロホルム50ml及び蓚酸クロリド4.3ミリモルから製
造。
ｃ）例2c）と同様にして、レゾルフイン2.2g（10ミリモ
ル）、クロロホルム100ml及び1,8−ジアザビシクロ−
（5,4,0）−ウンデク−７−エン1.5ml及び7b）から製
造。
TLC:Rf＝0.78（酢酸エステル／石油エーテル1:1） IR（cm-1）：（膜）1765、1720 例８ ａ）1,2−Ｏ−ジラウリル−rac−グリセロ−３−ピメリ
ン酸−モノエステル 例1a）と同様にして、1,2−Ｏ−ジラウリル−グリセリ
ン8.6g（20ミリモル）、クロロホルム50ml、ピリジン15
ml及びピメリン酸無水物4.3g（30ミリモル）から製造。
TLC:Rf:0.5（酢酸エステル／石油エーテル1:2） IR（cm-1）：膜:1740、1710 1,2−Ｏ−ジラウリル−rac−グリセロ−３−ピメリン酸
−レゾルフインエステル： ｂ）例1b）と同様にして、8a）1.66g（３ミリモル）及
び蓚酸クロリド1.3mlから製造。
ｃ）例2c）と同様にして、レゾルフイン0.65g（３ミリ
モル）、クロロホルム30ml、1,8−ジアザビシクロ−
（5,4,0）−ウンデク−７−エン0.5ml及び8b）から製
造。
TLC:Rf＝0.75（酢酸エステル／ヘキサン1:1） IR（cm-1）：（膜）:1768、1739 例９ ａ）1,2−Ｏ−ジテトラデシル−rac−グリセロ−３−グ
ルタル酸−モノエステル 1,2−Ｏ−ジテトラセシル−グリセリン14.6g（30ミリモ
ル）、クロロホルム150ml、ピリジン8.2ml及びグルタル
酸無水物5.1g（45ミリモル）から例1a）と同様にして製
造。
TLC:Rf:0.42（酢酸エステル／石油エーテル1:2） IR（cm-1）：（KBr）1740、1710 1,2−Ｏ−ジテトラデシル−rac−グリセロ−３−グルタ
ル酸−レゾルフインエステル： ｂ）例1b）と同様にして、9a）3g（５ミリモル）及び蓚
酸クロリド2.2mlから製造。
ｃ）例2c）と同様にしてレゾルフイン1.06g（５ミリモ
ル）、クロロホルム50ml、1,8−ジアザビシクロ−（5,
4,0）−ウンデク−７−エン0.75ml及び9b）から製造。
TLC:Rf＝0.34（RP18、アセトニトリル／ジクロルメタン
1:1） IR（cm-1）：（KBr）:1763、1735 例10 ａ）1,2−Ｏ−ジテトラデシル−rac−グリセロ−３−ピ
メリン酸−モノエステル 例9a）と同様にして、ピメリン酸無水物6.4g（45ミリモ
ル）から製造。
TLC:Rf:0.45（酢酸エステル／石油エーテル1:2） IR（cm-1）：（膜）1740、1708 1,2−Ｏ−ジテトラデシル−rac−グリセロ−３−ピメリ
ン酸レゾルフインエステル ｂ）例1b）と同様にして、10a）3.1g（５ミリモル）及
び蓚酸クロリド2.2mlから製造。
ｃ）例2c）と同様にして、レゾルフイン1.06g（５ミリ
モル）、クロロホルム50ml及び1,8−ジアザビシクロ−
（5,4,0）−ウンデク−７−エン0.78ml及び10b）から製
造。
TLC:Rf＝0.71（酢酸エステル／石油エーテル1:2） IR（cm-1）：（膜）:1755、1734 例11 ａ）1,2−Ｏ−ジヘキサデシル−sn−グリセロ−３−グ
ルタル酸−モノエステル 例1a）と同様にして、1,2−ジヘキサデシル−sn−グリ
セリン2.7g（５ミリモル）、クロロホルム50ml、ピリジ
ン3ml及びグルタル酸無水物1.5g（13ミリモル）から製
造。
TLC:Rf:0.65（酢酸エステル／石油エーテル1:1） IR（cm-1）：（KBr）1740、1710 1,2−Ｏ−ジヘキサデシル−sn−グリセロ−３−グルタ
ル酸−レゾルフインエステル： ｂ）例1b）と同様にして、11a）2.2g（3.3ミリモル）及
び蓚酸クロリド1mlから製造。
ｃ）例1c）と同様にして、レゾルフイン0.71g（3.3ミリ
モル）、ジメチルホルムアミド20ml、ピリジン0.5ml及
び11b）から製造。
TLC:Rf＝0.72（酢酸エステル／石油エーテル1:2） 例12 ａ）1,2−Ｏ−ジベンジル−rac−グリセロ−３−グルタ
ル酸−モノエステル 例1a）と同様にして、1,2−Ｏ−ジベンジル−グリセリ
ン3g（11ミリモル）、クロロホルム30ml、ピリジン2.5m
l及びグルタル酸無水物1.8g（16ミリモル）から製造。
TLC:Rf:0.39（酢酸エステル／石油エーテル1:1＋氷酢１
％） 1,2−Ｏ−ジベンジル−rac−グリセロ−３−グルタル酸
−レゾルフインエステル： ｂ）例1b）と同様にして、12a）2.9g（7.5ミリモル）、
クロロホルム30ml及び蓚酸クロリド3.3mlから製造。
ｃ）レゾルフイン1.6g（7.5ミリモル）、クロロホルム7
5ml、1,8−ジアザビシクロ−（5,4,0）−ウンデク−７
−エン1.2ml及び12b）から、例2c）と同様に製造。
TLC:Rf＝0.48（酢酸エステル／ヘキサン1:1） 例13 ａ）１−Ｏ−オクタデシル−２−Ｏ−ベンジル−sn−グ
リセロ−３−グルタル酸モノエステル １−Ｏ−オクタデシル−２−Ｏ−ベンジル−sn−グリセ
リン2.2g（５ミリモル）、クロロホルム50ml、ピリジン
3ml及びグルタル酸無水物1.5g（13ミリモル）から例1
a）と同様にして製造。
IR（cm-1）：（膜）1730、1700 １−Ｏ−オクタデシル−２−Ｏ−ベンジル−sn−グリセ
ロ−３−グルタル酸−レゾルフインエステル： ｂ）例1b）と同様にして、13a）1.7g（3.1ミリモル）及
び蓚酸クロリド1.3mlから製造。
ｃ）例1c）と同様にしてレゾルフイン0.8g（37ミリモ
ル）、ジメチルホルムアミド20ml、ピリジン0.7ml及び1
3b）から製造。
TLC:Rf＝0.68（酢酸エステル／石油エーテル1:1） IR（cm-1）：（KBr）:1768、1739 例14 ａ）1,2−ジオクタノイル−sn−グリセロ−３−グルタ
ル酸−モノエステル 1,2−ジオクタノイル−sn−グリセリン6.8g（20ミリモ
ル）、クロロホルム100ml、ピリジン12.5ml及びグルタ
ル酸無水物5.8g（50ミリモル）から例1a）と同様にして
製造。
TLC:Rf:0.49（酢酸エステル／石油エーテル1:1） 1,2−ジオクタノイル−sn−グリセロ−３−グルタル酸
−レゾルフインエステル ｂ）例1b）と同様にして14a）2.2g（５ミリモル）及び
蓚酸クロリド2.2mlから製造。
ｃ）レゾルフイン1.05g（５ミリモル）、ジメチルホル
ムアミド30ml、ピリジン0.75ml及び14b）から例1c）と
同様にして製造。
TLC:Rf＝0.86（RP18、アセトニトリル／ジクロルメタン
1:2） 例15 ａ）1.2.−ジオレイル−rac−グリセロ−３−グルタル
酸−モノエステル 例1a）と同様にして、ジオレイン3.1g（５ミリモル）、
クロロホルム40ml、ピリジン3ml及びグルタル酸無水物
1.5g（13ミリモル）から製造。
TLC:Rf＝0.32（酢酸エステル／石油エーテル1:1） IR（cm-1）：（膜）:1740、1706 ジオレインは工業用ジオレインからシリカゲル上で溶離
剤として酢酸エステル／石油エーテル1:3を用いてクロ
マトグラフイーを行なうことにより純粋な形に製造する
ことができる。
1.2.−ジオレイル−rac−グリセロ−３−グルタル酸−
レゾルフインエステル： ｂ）15a）3.5g（4.8ミリモル）及び蓚酸クロリド1.3ml
から例1b）と同様にして製造。
ｃ）レゾルフイン0.9g（4.2ミリモル）、ジメチルホル
ムアミド20ml、ピリジン1ml及び15b）から例1c）と同様
にして製造。
TLC:Rf＝0.78（酢酸エステル／石油エーテル1:1）。
例16 1,2−Ｏ−ジテトラデシル−rac−グリセロ−３−ピメリ
ン酸−ナフチルエステル 製造は１−ナフトール0.72g（５ミリモル）から例10b）
及びｃ）と同様に行なう。溶離剤酢酸エステル／ヘキサ
ン1:3を用いてシリカゲル上でフラツシユ・クロマトグ
ラフイーにより精製。
TLC:Rf＝0.89（酢酸エステル／石油エーテル1:5） 例17 1.2.−ジオレイル−rac−グリセロ−３−グルタル酸−
レゾルフインエステル 例15a）による1.2−ジオレイル−３−グリセログルタル
酸モノエステル10.3g（14.2ミリモル）、レゾルフイン
3.2g（15ミリモル）、ジシクロヘキシルカルボジイミド
6.2g（30ミリモル）及びスパーテル先端部量の４−ジメ
チルアミノピリジンをジメチルホルムアミド75ml中で室
温で２〜３日間攪拌する。次いで、酢酸エステルで希釈
し、沈殿を濾別する。酢酸エステル相を1N塩酸で振出
し、硫酸ナトリウム上で乾燥させる。溶剤を留去した
後、油状残分が得られ、これをシリカゲル−カラムクロ
マトグラフイ−（溶離剤：酢酸エステル／石油エーテル
1:1）により精製する。
同様に、相応するクロルフエノールレツド誘導体が製造
された。
TLC:Rf＝0.69（RP18;イソプロパノール／メタノール1:
2） 例18 1,2−Ｏ−ジオクチル−３−ピメリン酸−モノエステル
の製造 第１工程：文献:J.H.シヨート（Short）、U.ビーヤマツ
ヒヤー（Biermcher）著、Chim.Ther.第1966巻、第456
頁ピメリン酸モノベンジルエステルの合成（Synthese v
on Pimerinsauere monobenzyl ester）。
第２工程：ピメリン酸モノベンジルエステル2.5g（10ミ
リモル）から例1b）と同様に製造。得られた油状物質を
1,2−Ｏ−ジオクチルグリセリン3.2g（10ミリモル）、
ピリジン7mlの溶液に滴加する。例1c）と同様に処理。
第３工程：前記生成物をテトラヒドロフラン20ml中に溶
かし、パラジウム／活性炭0.4gを添加後水素添加した。
粗生成物をシリカゲル−カラムを介して精製する。
溶離剤：酢酸エステル／石油エーテル1:1。
TLC:Rf＝0.61（酢酸エステル／石油エーテル1:1） IR（cm-1）：膜:1740、1710 例19 1.2.−ジオレイル−グリセロ−３−グルタル酸モノエス
テルの合成 ａ）1,2−Ｏ−イソプロピリデン−グリセロ−３−グル
タル酸−トリクロルエチルエステル 第１工程：イソプロピリデングリセロール5.55g（42ミ
リモル）及び2,2,2−トリクロルエチル−水素−グルタ
ル酸エステル12g（45.3ミリモル）をエチレングリコー
ルジメチルエーテル中に溶かし、ジシクロヘキシルカル
ボジイミド10.5g（51ミリモル）を添加した。２日間攪
拌した後濾過し、蒸留する。
沸点:170℃（0.1mmHg）無色油状物質。
TLC:Rf＝0.82（アセトン／クロロホルム1:8） 第２工程：得られた油状物質をエーテル11ml中に溶か
し、メタノール3ml及び3N塩酸3mlを添加し、室温で12時
間攪拌する。有機相を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で、
次いで飽和塩化ナトリウム溶液で振出し、乾燥させる。
溶剤を留去した後、油状残分が残留する。
TLC:Rf＝0.23（酢酸エステル／石油エーテル1:1） ｂ）1,2−ジオレイル−グリセロ−３−グルタル酸トリ
クロルエチルエステル 第３工程：前記生成物6.1g（18ミリモル）及び油酸7.84
g（38ミリモル）をエチレングリコールジメチルエーテ
ル100ml中に溶かし、エチレングリコールジメチルエー
テル50ml中のジシクロヘキシルカルボジイミド10.5g（3
7ミリモル）を滴加する。室温で12時間攪拌した後、濾
過し、順次3N塩酸、炭酸水素ナトリウム溶液で、次いで
水で振出する。有機相の乾燥及び濃縮後、残分をシリカ
ゲル上クロマトグラフイーを行なう。
第４工程:1.2.−ジオレイル−グリセロ−３−グルタル
酸−モノエステル トリクロルエチル保護基を文献〔ジユステ（Juste）、
シンテシス（Synthesis）、1976巻、第457頁〕により脱
離。
例20 ａ）1,2−Ｏ−ジデシル−rac−グリセロ−３−ピメリン
酸−モノエステル 1,2−Ｏ−ジデシル−グリセリン5.6g（15ミリモル）、
クロロホルム100ml、ピリジン3.2ml及びピメリン酸無水
物4.0g（28ミリモル）から例1a）と同様にして製造。
TLC:Rf＝0.36（酢酸エステル／ヘキサン1:1） IR（cm-1）：（膜）1735、1710 1,2−Ｏ−ジデシル−rac−グリセロ−３−ピメリン酸−
レゾルフインエステル ｂ）20a）3g（5.8ミリモル）、クロロホルム50ml及び蓚
酸クロリド2.2mlから例1b）と同様にして製造。
ｃ）レゾルフイン1.1g（５ミリモル）、1,8−ジアザビ
シクロ−（5,4,0）−ウンデク−７−エン1ml（6.4ミリ
モル）及び20bから例2c）と同様に製造。
TLC:Rf＝0.71（酢酸エステル／ヘキサン1:1） IR（cm-1）：（膜）1755、1720 例21 ａ）1,2−Ｏ−ジラウリル−rac−グリセロ−３−アゼラ
イン酸−モノエステル 1,2−Ｏ−ジラウリルグリセリン6.7g（15.6ミリモ
ル）、クロロホルム100ml、ピリジン3.2ml及びアゼライ
ン酸無水物4.0g（23ミリモル）から例1a）と同様にして
製造。
TLC:Rf＝0.22（酢酸エステル／ヘキサン1:1） IR（cm-1）：（膜）:1738、1710 1,2−Ｏ−ジラウリル−rac−グリセロ−３−アゼライン
酸−レゾルフインエステル ｂ）21a）1.5g（2.5ミリモル）、クロロホルム30ml及び
蓚酸クロリド1.5mlから例1b）と同様にして製造。
ｃ）レゾルフイン0.55g（2.5ミリモル）、クロロホルム
25ml、1,8−ジアザビシクロ−（5,4,0）−ウンデク−７
−エン0.5ml（3.2ミリモル）及び21bから例2c）と同様
にして製造。
TLC:Rf＝0.78（酢酸エステル／ヘキサン1:1） IR（cm-1）：（膜）:1762、1740 例22 蒸留水60ml中に攪拌下にデソキシコール酸ナトリウム1.
2g及びコリパーゼ（豚から）0.15mgを溶かす。強力な攪
拌下にｎ−プロパノール1.7ml中のリパーゼ基質、1,2−
Ｏ−ジオクチル−rac−グリセロ−３−アゼライン酸−
レゾルフインエステル（例４）70mgの溶液を加圧下にで
きるだけ細い噴流で注入する。蒸留水200ml中に尿素1.5
g、デソキシコール酸ナトリウム1g、塩化ナトリウム200
mg、トリス（TRIS）800mg及びトリス・HCl107mgを溶解
して含有する溶液を前記のように製造した乳液と十分に
混合する。
このように製造した溶液2.5mlを試料（血清）100μｌと
混合する。反応を578nmHgで測光法により追跡する。
公知リパーゼ活性の標準に関して、試料のリパーゼ活性
は次のように計算される： 試料のリパーゼ活性の計算は次の式によつても可能であ
る： Ｖ全：試験配合量の全容量〔cm3〕Ｖ 試料：試料の容量〔cm3〕 ε:578nmにおける色原体の吸光係数 d:キユベツトの層厚〔cm〕 ΔE/分:578nmにおける１分間あたりの吸光変化 前記反応条件において吸光係数ε＝60.65cm・μmol-1で
ある。
例23 種々のリパーゼ基質に関して、空値変化、エステラーゼ
感度、リパーゼ感度及び混濁測定試験との相関性を測定
した。
空値変化は例１による試薬及び種々のリパーゼ基質によ
り調べた。試料のかわりに水100μｌを添加し、578nmに
おける吸光変化を追跡した（mE/分）。
エステラーゼ感度を調べるためには試料のかわりにカル
ボキシルエステラーゼ（EC3.1.1.1、約20000U/l、ベー
リンガー・マンハイム社、注文番号（Best-No）10469
8）100μｌを添加し、吸光変化を前記のように追跡し
た。
リパーゼ感度を調べるためには試料のかわりに、リパー
ゼ（EC3.1.1.3、約100U/l、ベーリンガーマンハイム
社、注文番号（Best-No）414590）100μｌを添加し、吸
光変化を前記のように追跡した。
混濁測定試験に対する相関性を調べるために、リパーゼ
の上昇量（０〜1000U/l）で混濁試験（ベーリンガーマ
ンハイム社、注文番号262358）を実施し、例22による呈
色試験と比較し、かつ相関係数を調べる。
結果を第１表に示す。
例24 デソキシコール酸ナトリウム8.5g、コリパーゼ0.05g、
マンニツト20g、塩化カルシウム0.05g、塩化ナトリウム
0.82g、トリス（TRIS）2.7g及びトリス・HCl0.4gを蒸留
水200ml中に溶かす。プロパノール7ml中に1,2−Ｏ−ジ
テトラデシル−rac−グリセロ−３−ピメリン酸−ナフ
トールエステル0.35gを溶かして含有する溶液を攪拌下
に噴射注入する。このようにして得られた乳液を−40℃
で凍結し、凍結乾燥させる。得られた凍結乾燥物質70mg
を蒸留水2ml中に溶かし、フアスト・レツドTR溶液（フ
アスト・レツド＝４−クロル−３−メチル−ベンゾ−ル
ジアゾニウムナフタリン−1,5−ジスルホネート）（蒸
留水10ml中231mg）100μｌを加える。試料（血清）100
μｌの添加後、反応を405nmで測光法で追跡する。リパ
ーゼ濃度の調査は例22と同様に検量線に関して行なう。
例25 蒸留水120ml中のタウロデソキシコレート3.04g、ポリワ
ツクス40002.7g、塩化カルシウム7mg、コリパーゼ（豚
から）0.2mgの溶液中にｎープロパノール3.5ml中のリパ
ーゼ基質、1,2−Ｏ−ジデシル−rac−グリセロ−３−グ
ルタル酸−レゾルフインエステル150mgを攪拌下に噴射
注入する。
このようにして得られた乳液に次の溶液を添加し、十分
に混合する： タウロデソキシコレート10g、ポリワツクス6.4g、マン
ニツト50g、尿素14g、塩化ナトリウム800mg及びトリス1
5gを蒸留水300ml中に溶かす。塩酸溶液でpH値をpH＝7.5
に調節する。その後、該溶液を蒸留水で400mlにする。
このようにして製造された反応混合物2.5mlを試料（血
清）100μｌを混合する。反応を578nmで測光法により追
跡する。
評価は例22中と同様に行なう。
例26 蒸留水120ml中のタウロデソキシコレート3.04g、ポリワ
ツクス40002.7g、塩化カルシウム7mg、コリパーゼ（豚
から）0.2mgの溶液に、ｎープロパノール3.5ml中のリパ
ーゼ基質、1,2−Ｏ−ジデシル−rac−グリセロ−３−グ
ルタル酸−レゾルフインエステル150mgを攪拌下に噴射
注入する。
このようにして得られた乳液に次の溶液を添加し、十分
に混合する： タウロデソキシコレート10g、ポリワツクス6.4g、マン
ニツト50g、尿素14g、塩化ナトリウム800mg、チエス（C
HES）28gを蒸留水300ml中に溶かす。塩酸溶液でpH値をp
H＝8.5とする。その後、該溶液を蒸留水で400mlにす
る。
このように製造された反応混合物2.5mlを試料（血清）1
00μｌと混合する。反応を578nmで測光法により追跡す
る。
評価を例22に記載したと同様に行なう。
例27 蒸留水100ml中のタウロデソキシコール酸ナトリウム4.0
g、塩化カルシウム0.06g、コリパーゼ（豚から）0.2m
g、マンニツト5.0g及びポリワツクス4000 2.0gからな
る溶液中にｎープロパノール4ml中に溶けている1,2−Ｏ
−ジテトラデシル−rac−グリセロ−３−ピメリン酸−
ナフトールエステル150mlを攪拌下に噴射注入する。十
分な冷却下に、このように得られた乳液を数分間超音波
で処理する。
第２の溶液は100ml中にタウロデソキシコール酸ナトリ
ウム2.4g、トリス2.0g、マンニツト12.0g、尿素3.5g及
び塩化ナトリウム0.5gを含有する。塩酸で、この溶液の
pH値をpH＝8.3にする。
第３の溶液はフアスト・レツドTR（フアスト・レツドTR
＝４−クロル−３−メチル−ベンゾール−ジアゾニウム
−ナフタリン−1,5−ジスルホネート）1gを蒸留水40ml
中に溶解して含有する。
５部の溶液１及び６部の溶液２とを１部の溶液３と混合
する。このようにして得られた溶液で、試験テープ製造
に好適な吸収性紙、例えばシユライヒヤー及びシユル
（Schleicher und Schll）社のVS532種を含浸させ、
空気循環乾燥箱中で30〜65℃の温度で注意深く乾燥す
る。
次の使用の際まで、乾燥剤の存在で保存するのがよい。
試料（血清）のリパーゼに関する試験のためには、試料
を少量（数滴）テープ上に与える。黄色着色の時間経過
から調べる試料のリパーゼ活性を決定することができ
る。
例28 ａ）1,2−Ｏ−ジラウリル−rac−グリセロ−３−テトラ
デカンジ酸モノエステル： 1,2−Ｏ−ジラウリルグリセリン8.6g（20ミリモル）、
クロロホルム100ml、ピリジン4ml、ジメチルアミノピリ
ジン0.4g、テトラデカンジ酸無水物9.6g（40ミリモル）
から例1a）と同様に製造。
TLC:Rf＝0.45（酢酸エステル／石油エーテル1:5） 1,2−Ｏ−ジラウリル−rac−グリセロ−３−テトラデカ
ンジ酸（６−メチルレゾルフイン）−エステル： ｂ）28a）3.35g（５ミリモル）及び蓚酸クロリド2.2ml
から例1b）と同様にして製造。
ｃ）４−メチルレゾルフイン1.2g（５ミリモル）、クロ
ロホルム20ml、1,8−ジアザビシクロ−（5,4,0）−ウン
デク−７−エン0.75ml、ジメチルアミノピリジン0.1g及
び28b）から例2c）と同様にして製造。
TLC:Rf＝0.63（酢酸エステル／ヘキサン1:4） ｄ）例22に記載したように乳液を製造する。しかしなが
ら、そこに記載したリパーゼ基質のかわりに、ｎ−プロ
パノール1.7ml中のリパーゼ基質、1,2−Ｏ−ジラウリル
−rac−グリセロ−３−テトラデカンジ酸−（６−メチ
ルレゾルフイン）−エステル70mgが溶解している溶液を
使用する。
この際、次の試験特異的特性値が得られた （例23及び第１表参照） 空値:0.2mE/分、 エステラーゼ活性:0.7mE/分、 リパーゼ感度:100U/lあたり23.6mE/分、 相関係数:0.9509 例29 1,2−Ｏ−ジラウリル−rac−グリセロ−３−グルタル酸
−（６−メチル−レゾルフイン−）エステル： ａ）４−メチルレゾルフイン2.3g（10ミリモル）を用い
て例7a）〜ｃ）と同様にして製造。
TLC:Rf＝0.68（酢酸エステル／ヘキサン1:2） ｂ）蒸留水60ml中に攪拌下にタウロデソキシコール酸ナ
トリウム0.9g及びコリパーゼ（豚から）0.3gを攪拌下に
溶解する。良好な攪拌下に、ｎ−プロパノール1.7ml中
の1,2−Ｏ−ジラウリル−rac−グリセロ−３−グルタル
酸−（６−メチル−レゾルフイン−）エステル70mgの溶
液を前記溶液中に噴射注入する。更に、200ml中に尿素
0.5g、タウロデソキシコール酸ナトリウム1g、塩化ナト
リウム200mg及びトリス2.9gを含有し、かつそのpH値が
7.5に調節されている溶液（200ml）を添加する。十分に
混合した後、このように製造された溶液2.5mlを試料
（血清）100μｌと混合する。この反応を578nmHgで測光
法により追跡し、例22に記載されているように評価す
る。
試験特異性特性値（例23及び第１表参照）： 空値:0.4mE/分、 リパーゼ感度:100mE/分あたり28mE/分、 相関係数:0.988 例30 ４−メチルレゾルフイン： ２−メチル−４−ニトロソレゾルシン7.5g、レゾルシン
4.2g、褐石3.6g、硫酸4.3ml、メタノール75ml、亜鉛粉
末4g及び25％アンモニア18mlから西ドイツ国特許第3411
574号明細書に記載されているように製造。
TLC:Rf＝0.70（エタノール／アセトン2:1） UV/VIS（0.1M燐酸カリウム緩衝液、pH8.5）： max＝579nm ２−メチル−ニトロソレゾルシンの製造は西ドイツ国特
許第3411575号明細書A1により得られる。
例31 1,2−Ｏ−ジラウリル−rac−グリセロ−３−グルタル酸
−（４−メチルウンベリフエリルー）エステル： ａ）7a）2.75g（５ミリモル）及び４−メチルウンベリ
フエロン1g（５ミリモル）をテトラヒドロフラン30ml中
に溶かし、次いでジシクロヘキシルカルボジイミド2g
（10ミリモル）及びジメチルアミノピリジン0.15gを添
加する。室温で24時間攪拌機、濾過し、濃縮する。粗生
成物をフラツシユ・クロマトグラフイーにより精製す
る、 TLC:Rf＝0.40（酢酸エステル／石油エーテル1:3） ｂ）乳液製造は例22に記載したように行なうが、例22で
使用したリパーゼ基質のかわりに、ｎ−プロパノール1.
7ml中の1,2−ジラウリル−rac−グリセロ−３−グルタ
ル酸−（４−メチルウンベリフエリル）−エステル35mg
を使用する。
反応を25℃で蛍光測定により行なう。すなわち364nmの
励起波長、スリツト幅5nm及び448nmの発光波長及び10nm
のスリツト幅で行なう。
試験特異性特性値（例23及び第１表を参照）： 空値:4.0mE/分、 リパーゼ感度:100U/lあたり28mE/分、 相関係数:0.9942 例32 1,2−Ｏ−ジラウリル−rac−グリセロ−３−グルタル酸
−（ｎ−ニトロチオフエニル）エステル： 32a〜ｂ）を例7a〜ｂ）により製造。
ｃ）ｐ−ニトロチオフエノール1.4g（10ミリモル）、ジ
メチルホルムアミド100ml、ピリジン2.4ml、ジメチルア
ミノピリジン0.2g及び32b）から例1c）と同様に製造。
TLC:Rf＝0.76（酢酸エステル／ヘキサン1:4） ｄ）蒸留水27ml中に次の化合物を良好な攪拌下に溶か
す： デソキシコール酸ナトリウム 4.83mg CHES〔＝２−（シクロヘキシルアミノ） −エタンスルホン酸〕 28.00mg 尿素 17.50g 塩化ナトリウム 2.13mg 豚のコリパーゼ 0.16mg 塩化カルシウム 0.33mg タウロデソキシコール酸ナトリウム 152.00mg 溶液のpH値をpH＝8.3に調節する。該溶液に1,2−Ｏ−ジ
ラウリル−rac−グリセロ−３−グルタル酸（ｐ−ニト
ロ−チオフエニル）−エステルの溶液を十分な攪拌下に
噴射注入する。引き続き、冷却下に該溶液を２分間超音
波で処理する（通常の強度）。
このように得られた乳液1mlに試料（リパーゼ含有人血
清）50μｌを加え、混合した。反応を405nmHgで測光法
により行ない、例22に記載したように計算する。
試験特異性特性値： 空値:0.3mE/分、 リパーゼ感度:100U/lあたり12.2mE/分 相関係数:0.998 例33 ａ）１−Ｏ−（２−メトキシ−オクタデシル）−２−Ｏ
−メチル−rac−グリセロ−３−グルタル酸モノエステ
ル： １−Ｏ−（２−メトキシ−オクタデシル）−２−Ｏ−メ
チルグリセリン3g（7.7ミリモル）、クロロホルム25m
l、ピリジン1.8ml、ジメチルアミノピリジン0.1g及びグ
ルタル酸無水物1.75g（15ミリモル）から例1a）と同様
にして製造。
収率:1.5g（39％）、 TLC:Rf＝0.68（RP18、アセトン／エタノール1:2） １−Ｏ−（２−メトキシ−オクタデシル）−２−Ｏ−メ
チル−rac−グリセロ−３−グルタル酸−（６−メチル
レゾルフイン）−エステル： ｂ）33a）1.5g（３ミリモル）及び蓚酸クロリド1.5mlか
ら例1b）と同様にして製造。
ｃ）４−メチルレゾルフイン0.68g（３ミリモル）、1,8
−ジアザビシクロ−（5,4,0）ウンデク−７−エン0.45m
l及び33b）から例2c）と同様にして製造。
TLC:Rf＝0.86（酢酸エステル） ｄ）試験乳液の製造を例22に記載されているように行な
うが、ここではリパーゼ基質として１−Ｏ−（２−メト
キシ−オクタデシル）−２−Ｏ−メチル−rac−グリセ
ロ−３−グルタル酸−（６−メチル−レゾルフイン）−
エステルを使用する。
リパーゼ濃度を調べることは、異なるリパーゼ濃度の二
つの標準からの、吸光変化に対して１分あたりの吸光変
化を記載した検量線により行なわれる。
空値:8.4mE/分、 エステラーゼ感度:25.3mE/分、 リパーゼ感度:100U/lあたり19.0mE/分、 相関係数:0.9483 例34 ａ）1,2−Ｏ−ジラウリル−rac−グリセロ−３−コハク
酸−モノエステル： 1,2−Ｏ ジラウリルグリセリン8.56g（20ミリモル）、
コハク酸無水物4g（40ミリモル）、クロロホルム60ml、
ピリジン4.6ml及びジメチルアミノピリジン0.24gから例
1a）により製造。該生成物をヘキサンから結晶化。
融点:41〜43℃ TLC:Rf＝0.26（酢酸エステル／ヘキサン1:4） 1,2−Ｏ−ジラウリル−rac−グリセロ−３−コハク酸−
レゾルフイン−エステル： ｂ）34a）2.65g（５ミリモル）、レゾルフイン1.06g
（５ミリモル）、ジシクロヘキシルカルボジイミド6.18
g（30ミリモル）、ジメチルアミノピリジン0.1g及びジ
メチルホルムアミド50mlから例17）と同様にして製造。
TLC:Rf＝0.47（酢酸エステル／石油エーテル1:3） ｃ）ここでも、例22に記載されているように乳液を製造
する。しかし、この場合リパーゼ基質としては、プロパ
ノール1.7ml中に溶解した1,2−Ｏ−ジラウリル−rac−
グリセロ−３−コハク酸−レゾルフインエステル70mgを
使用する。
この際、次の試験特異性特性値が得られる （例23及び第１表を参照）： 空値:3.8〜4.0mE/分、 エステラーゼ感度：調べず、 リパーゼ感度:100U/lあたり8.7mE/分、 相関係数:0.8793 例35 ａ）２−Ｏ−ラウリル−オクタデカンジオール（1,2）
−１−グルタル酸−モノエステル： ２−Ｏ−ラウリル−オクタデカンジオール（1,2）4.6g
（10ミリモル）、クロロホルム29ml、ピリジン2.3ml、
ジメチルアミノピリジン0.12g、グルタル酸無水物2.3g
（20ミリモル）から例1a）と同様にして製造。
TLC:Rf＝0.54（石油エーテル／酢酸エステル4:1） ２−Ｏ−ラウリル−オクタデカンジオール（1,2）−１
−グルタル酸−（ｆ−メチルレゾルフイン）−エステ
ル： ｂ）35a）1.15g（２ミリモル）及び蓚酸クロリド0.88ml
から例1b）と同様に製造。
ｃ）４−メチルレゾルフイン0.45g（２ミリモル）、ク
ロロホルム20ml、1,8−ジアザビシクロ−（5,4,0）−ウ
ンデク−７−エン0.3ml、ジメチルアミノピリジン40mg
及び35b）から例2c）と同様にして製造。
TLC:Rf＝0.37（石油エーテル／酢酸エステル5:1） ｄ）例22に記載されているように乳液を製造するが、リ
パーゼ基質としてｎ−プロパノール1.7ml中に溶解した
２−Ｏ−ラウリル−オクタデカンジオール−1,2−１−
グルタル酸−（６−メチルレゾルフイン）−エステル70
mgを使用する。
例23、第１表に相応して、次の試験特異性特性値が得ら
れた： 空値:0.3〜1.0mE/分、 エステラーゼ感度:1.0mE/分、 リパーゼ感度:100U/lあたり25.5mE/分、 相関係数:0.996 例36 ａ）1,2−Ｏ−ジラウリル−rac−３−チオグリセロ−３
−Ｓ−グルタル酸モノエステル： 1,2−Ｏ−ジラウリル−rac−３−チオグリセリン2.5g
（4.8ミリモル）、クロロホルム14ml、ピリジン1.1ml及
びグルタル酸無水物1.1g（9.6ミリモル）から例1a）と
同様に製造。
TLC:Rf＝0.5（ヘキサン／テトラヒドロフラン1:4） 1,2−Ｏ−ジラウリル−rac−３−チオグリセロ−３−Ｓ
−グルタル酸−（６−メチルレゾルフイン）−エステ
ル： ｂ）36a）0.74g（1.3ミリモル）及び蓚酸クロリド0.6ml
から例1b）と同様に製造。
ｃ）４−メチルレゾルフイン0.3g（1.3ミリモル）、ク
ロロホルム13ml、1,8−ジアザビシクロ−（5,4,0）−ウ
ンデク−７−エン0.2ml、ジメチルアミノピリジン27mg
及び36b）から例2c）と同様にして製造。
TLC:Rf＝0.38（石油エーテル／酢酸エステル17:3） 出発物質として使用した1,2−Ｏ−ジラウリル−rac−チ
オグリセリンをOrg.Synth.III.第366頁及び363頁と同様
にして次のように得られる： 1,2−Ｏ−ジラウリルグリセリンとトルオールスルホン
酸クロリドとを反応させ、ジラウリル−グリセロ−３−
トルオールスルホネートとし、次いでチオ尿素と反応さ
せて相応するイソチウロニウム塩とし、引き続き塩酸で
加水分解する。
TLC:Rf＝0.52（石油エーテル／酢酸エステル49:1） ｄ）例22に記載したように乳液を製造する。しかしなが
ら、そこに使用したリパーゼ基質のかわりにｎ−プロパ
ノール1.7ml中の1,2−Ｏ−ジラウリル−rac−３−チオ
グリセロ−３−Ｓ−グルタル酸−（６−メチルレゾルフ
イン）−エステル70mgの溶液を使用する。
試験特異性特性値： 空値:0.2〜0.9mE/分 エステラーゼ感度:1.3mE/分 リパーゼ感度:100U/lあたり4.1mE/分 相関係数:0.857 例37 ａ）1,2−Ｓ−ジラウリル−rac−1,2−ジチオグリセロ
−３−グルタル酸モノエステル： 1,2−Ｓ−ジラウリル−1,2−ジチオグリセリン3g（6.5
ミリモル）、ピリジン30ml及びグルタル酸無水物1.5g
（13ミリモル）から例1a）と同様にして製造。
TLC:Rf＝0.43（石油エーテル／酢酸エステル1:1） 1,2−Ｓ−ジラウリル−rac−1,2−ジチオグリセロ−３
−グルタル酸−（６−メチル−レゾルフイン）−エステ
ル： ｂ）37a）1.2g（２ミリモル）及び蓚酸クロリド1mlか
ら、例1b）と同様にして製造。
ｃ）４−メチルレゾルフイン0.46g（２ミリモル）、ク
ロロホルム20ml、1,8−ジアザビシクロ−（5,4,0）−ウ
ンデク−７−エン0.3ml及び37b）から例2c）と同様にし
て製造。TLC:Rf＝0.37（酢酸／石油エーテル1:4） 出発材料として使用した1,2−Ｓ−ジラウリル−rac−1,
2−ジチオグリセリンを次のように製造： エタノール250ml中の水酸化カリウム9g（160ミリモル）
の溶液にエタノール100ml中の2,3−ジメルカプトプロパ
ノール10g（80ミリモル）を滴加する。１時間の攪拌
後、エタノール100ml中のドデシルブロミド40g（160ミ
リモル）の溶液を滴加する。反応を完結させるために更
に２日間攪拌し、次いで濾過し、氷を加える。2N塩酸で
酸性にした後、エーテルで３回抽出し、有機相を乾燥さ
せ、かつ濃縮する。残分をシリカゲルカラム上で精製す
る（溶離剤：酢酸エステル／石油エーテル1:10）。TLC:
Rf＝0.54（酢酸エステル／石油エーテル1:10） ｄ）例22に記載されているように乳液を製造する。この
場合は例22に使用したリバーゼ基質のかわりにｎ−プロ
パノール1.7ml中に溶解した1,2−Ｓ−ジラウリル−rac
−1,2−ジチオグリセロ−３−Ｓ−グルタール酸−（６
−メチルレゾルフイン）−エステル70mgを使用する。
空値:3mE/分 エステラーゼ感度:3.4mE/分 リパーゼ感度:100U/lあたり24mE/分 相関係数:0.9943

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】一般式 ［式中、Ａは炭素原子数１〜16のアルキレン基又は炭素
    原子数２〜16のアルケニレン基を表わし、Ｒ及びR1は同
    一又は異なっていてよく、それぞれ炭素原子数１〜20の
    アルキル基又はアシル基、又は炭素原子数２〜20のアル
    ケニル基を表わすか、又はC1〜8−アルキル置換してい
    てよいアリール基又はアルキル基中の炭素原子数１〜８
    のアルアルキル基を表わし、基Ｒ及びR1の一方は水素原
    子であってもよく、Ｘは芳香族ヒドロキシ−又はチオー
    ル化合物を表わし、かつそれぞれＹ及びＺは相互に独立
    して−Ｓ−又は−Ｏ−を表わし、Ｚは−CH2−も表わ
    す］のリパーゼ基質。
  2. 【請求項２】Ｒ及び／又はR1は炭素原子数８〜12を示す
    特許請求の範囲第１項記載のリパーゼ基質。
  3. 【請求項３】Ａが炭素原子数３〜７を示す特許請求の範
    囲第１項又は第２項記載のリパーゼ基質。
  4. 【請求項４】Ｘは置換されていてよいレゾルフィン基、
    クロルフェノールレッド基、インドキシル基、ナフトー
    ル基、チオフェノール基、チオフルオレシイン基又はフ
    ェノール基である特許請求の範囲第１項から第３項まで
    のいずれか１項記載のリパーゼ基質。
  5. 【請求項５】1,2−Ｏ−ジオクチル−rac−グリセロ−３
    −アゼライン酸−レゾルフィンエステルである特許請求
    の範囲第１項記載のリパーゼ基質。
  6. 【請求項６】1,2−Ｏ−ジデシル−rac−グリセロ−３−
    ピメリン酸−レゾルフィンエステルである特許請求の範
    囲第１項記載のリパーゼ基質。
  7. 【請求項７】1,2−Ｏ−ジデシル−rac−グリセロ−３−
    グルタル酸−レゾルフィンエステルである特許請求の範
    囲第１項記載のリパーゼ基質。
  8. 【請求項８】1,2−Ｏ−ジドデシル−rac−グリセロ−３
    −グルタル酸−レゾルフェンエステルである特許請求の
    範囲第１項記載のリパーゼ基質。
  9. 【請求項９】一般式 ［式中、Ａは炭素原子数１〜16のアルキレン基又は炭素
    原子数２〜16のアルケニレン基を表わし、Ｒ及びR1は同
    一又は異なっていてよく、それぞれ炭素原子数１〜20の
    アルキル基又はアシル基、又は炭素原子数２〜20のアル
    ケニル基を表わすか、又はC1〜8−アルキル置換してい
    てよいアリール基又はアルキル基中の炭素原子数１〜８
    のアルアルキル基を表わし、基Ｒ及びR1の一方は水素原
    子であってもよく、Ｘは芳香族ヒドロキシ−又はチオー
    ル化合物を表わし、かつそれぞれＹ及びＺは相互に独立
    して−Ｓ−又は−Ｏ−を表わし、Ｚは−CH2−も表わ
    す］のリパーゼ基質にリパーゼ含有試料を作用させ、遊
    離する芳香族ヒドロキシ化合物又はチオール化合物の量
    を直接視覚的に測定するか、又は好適な色原体とのカッ
    プリングにより、これから生じた色素を視覚的に測定す
    ることを特徴とするリパーゼの視覚的測定法。
  10. 【請求項１０】試験中の塩濃度0.1〜10mg/mlで測定を行
    う特許請求の範囲第９項記載の方法。
  11. 【請求項１１】一般式 ［式中、Ａは炭素原子数１〜16のアルキレン基又は炭素
    原子数２〜16のアルケニレン基を表わし、Ｒ及びR1は同
    一又は異なっていてよく、それぞれ炭素原子数１〜20の
    アルキル基又はアシル基、又は炭素原子数２〜20のアル
    ケニル基を表わすか、又はC1〜8−アルキル置換してい
    てよいアリール基又はアルキル基中の炭素原子数１〜８
    のアルアルキル基を表わし、基Ｒ及びR1の一方は水素原
    子であってもよく、Ｘは芳香族ヒドロキシ−又はチオー
    ル化合物を表わし、かつそれぞれＹ及びＺは相互に独立
    して−Ｓ−又は−Ｏ−を表わし、Ｚは−CH2−も表わ
    す］の基質少なくとも１種及び緩衝物質、並びに胆汁酸
    アルカリ塩、コリパーゼ、塩、尿素及び／又は発色性カ
    ップラーを含有することを特徴とするリパーゼの視覚的
    測定試薬。
  12. 【請求項１２】試験における調合剤溶液に関してそれぞ
    れ、 基質 0.05〜10mg/ml、 デソキシコール酸塩 ２〜50mg/ml、 コリパーゼ 0.001〜0.01mg/ml、 尿素 １〜100mg/ml、 NaCl 0.1〜10mg/ml、 緩衝物質 １〜50mg/ml、 を含有している特許請求の範囲第11項記載の試薬。
  13. 【請求項１３】担体材料中に含浸されて存在する特許請
    求の範囲第11項又は第12項記載の試薬。
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