SU1604167A3 - Способ определени липазы - Google Patents

Способ определени липазы Download PDF

Info

Publication number
SU1604167A3
SU1604167A3 SU864027411A SU4027411A SU1604167A3 SU 1604167 A3 SU1604167 A3 SU 1604167A3 SU 864027411 A SU864027411 A SU 864027411A SU 4027411 A SU4027411 A SU 4027411A SU 1604167 A3 SU1604167 A3 SU 1604167A3
Authority
SU
USSR - Soviet Union
Prior art keywords
mmol
ester
preparation
acid
glycero
Prior art date
Application number
SU864027411A
Other languages
English (en)
Inventor
Нойманн Ульрих
Юниус Мартина
Батц Ханс-Георг
Original Assignee
Берингер Маннхайм Гмбх (Фирма)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Берингер Маннхайм Гмбх (Фирма) filed Critical Берингер Маннхайм Гмбх (Фирма)
Application granted granted Critical
Publication of SU1604167A3 publication Critical patent/SU1604167A3/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D265/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom and one oxygen atom as the only ring hetero atoms
    • C07D265/28—1,4-Oxazines; Hydrogenated 1,4-oxazines
    • C07D265/34—1,4-Oxazines; Hydrogenated 1,4-oxazines condensed with carbocyclic rings
    • C07D265/38—[b, e]-condensed with two six-membered rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Indole Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относитс  к аналитической химии. Цель изобретени  - повышение чувствительности. Способ определени  липазы посредством воздействи  на субстрат липазы с образованием хромогена предусматривает использование субстрата общей формулы X-CO-A-CO-Y-CH2-CH(Y-R)-CH2-Z-R1, где A - алкильна  или алкиленова  группа с 2 - 12 C-атомами, R и R1, которые могут быть одинаковыми или разными, каждый обозначают алкильную группу с 6 - 18 C-атомами, один из остатков R и R1 также обозначает атом водорода. X - резоруфин, 6-метилрезоруфин, 4,6-диметилрезоруфин, 1,6-диметилрезоруфин, 8-этилрезоруфин и 8-бромрезоруфин и каждый Y и Z, независимо друг от друга обозначают -S- или -О-, Z также обозначает -CH2-. Количество освобожденного ароматического гидроксильного или тиолового соединени  непосредственно или после сочетани  с подход щим хромогеном оптически определ ют по получившейс  окраске. 3 табл.

Description

Йзобретение относитс  к аналитической химии и имеет огромное значение дл  клинической химии, биохимии , фармацевтической химии и химии пищевых продуктов.
Цель изобретени  - повышение чувствительности определени .
. Изобретение предусматривает использование в качестве субстрата липазы соединение общей формулы
00
и ti HjC-Y-C-A-C-X
HC-Y-R
I
H C-Z-KI
где A - алкильна  или алкиленова  группа с 2-12 атомами углерода;
о g
Ot) SI
ы
R и
R - одинаковые или разные, каждый означает алкильную группу с 6-18 атомами углерода, один из остатков R и R также атом водорода;
X - резоруфин, 6-метилрезоруфин, I,6-диметилрезоруфин, 8 этил- резоруфин, 8-бромрезоруфин; Y и Z - каждый независимо друг от друга означают -S- или
-О-, Z также -СН- , и оптическое определение по окраске количества освобожденного аромати- ческого гидроксильного или тиолово- го соединени  непосредственно, или после сочетани  с подход щим хромогеном .
Дл  R и R предпочитают алкильные группы в противоположность ацильным группам, так как они не чувствительны к гидролизу.
Примерами дл  R и/или R,  вл ютс  остатки метила, этила, пропила, бутила, пентила, гексила, гептила, октила, нонила, деДила, ундецила, до децила, тетрадецила, гексадецила и октадецила как алкильные группы, а также соответствующие ацильные труп- пы, как грзшпы ацетила, пропионила, бутирила, валерила, капронила, кап- рила, капринила, лаурила, миристила, пальмитила и стеарила, олеила, крото- нила, линолила, фенила, бензила или октилфенила.
Далее предлагаемый субстрат липазы содержит остаток дикарбоновой кислоты СООН-А-СООН, в которой А имеет предпочтительно 3-7 С-атомов. Кислотами, образующими А,  вл ютс  малонова ,  нтарна , глутарова , адипинова , пимелинова , пробкова  азелаинова , себацинова , нонандикар- бонова , декандикарбонова  к ундекан дикарбонова  кислоты. Предпочитают кислоты от глутаровой кислоты до азелаиновой кислоты, которые соответствуют А с 3-7 С-атомами.
X может быть ароматическим окси- или тиолсоединением, которое представ л ет хромофор или может быть переведено в крас щее вещество лишь после- довате.пьной реакцией. Типичными при-. мерами  вл ютс  фенол, тиофенол, нафтол , тионафтол и их производные,а также хромогенные соединени , как остаток резоруфина, 6-метилрезоруфин, | 4,б-дикетилрезоруфин, 1,6-диметилре-
Q
15
jQ
25 Q 35
5
зоруфин и 8-зтилрезоруфин, и 8-бромрезоруфин , хлорфенолового красного, индоксила или тиофлуоресцеина.
Предпочитают хромофоры, которые имеют небольшую пол рность и  вл ютс  жирорастворимь ми. Однако при этом должна быть.гарантирована еще водо- растворимость.
Жирорастворению названных хромофоров способствует подход щее замещение с алкильными группами, Так, дл  остатка резоруфина оказались группы метила, диметила и этила, а та1сже замещение с бромом.
Соединени  по изобретению  вл ютс  новыми. Они имеют асимметрический центр и поэтому оптически активны . В качестве субстрата липазы можно примен ть как образующиес  при, обычных методах получени  рацематы, так и оптические изомеры.
Субстраты липаэы по изобретению можно получать известными методами.
Способ предусматривает использование в составе аналита реактива, предпочтительно содержащего, мг/мл: субст- рат 0,05-10, дезоксихолат 2-50, коли- паза 0,001-0,01, мочевина 1-100, NaCl 0,1-10, буфер 1-50, устанавливающие рН от 6 до 10,5 соответственно в пересчете на годный к употреблению раствор.
Приведенные примеры иллюстрируют как получение субстратов, так и способы определени  липазы с их использованием
Пример 1. а) Сложный моноэфир 1,2-0-дигексил-рац-глицеро-З- глутаровой кислоты.
В раствор 3,3 г (11,5 ммоль) 1,2- О-дигексил-глицерина в 30 мл хлороформа добавл ют последовательно 2,5 МП пиридина, на кончике шпател  4-диметш1аминопиридин и 2,6 г (23 ммоль) ангидрида глутаровой гис- лоты. Смесь нагревают IО ч при флегме и после охлаждени  разбавл ют 200 мл хлороформа. Фазу хлороформа взбалтывают с J н. сол ной кислотой и сушат. После отфильтровывани  высушивающего вещества растворитель удал ют и остаток очищают на колонне с силикагелем (элюент: уксусный эфир - петролейный эфир 1:1).
ДС: Rf 0,45 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:2 + % лед ной уксусной кислоты).
Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0- дигексил-рац-глицеро-3-глутаровой кислоты.
Ь) 1,4 г (3,7 ммоль)раствора по способу 1а раствор ют в 20 мл хлороформа и при охлаждении льдом закапывают 2 мл (23,3 ммоль) хлористого оксалила. Лед ную ванну удал ют и перемешивают раствор 12 ч при комнатной температуре. Затем сливают растворитель , остаток поглощают в толуоле и снова выпаривают. Полученное таким путем масло примен ют без дальнейшей очистки.
с) О,8 г (3,7 ммоль) резоруфина суспендируют в 40 мл диметилформами- да при добавке 1,1 мл пиридина и на кончике шпател  4-диметиламинопир дина. Туда закапывают раствор по способу 1Ь в 20 мл диметилформамида. После одно - и двухсуточного перемешивани  при комнатной температуре фильтруют и сливают растворитель. Остаток поглощают в уксусном эфире, отфильтровывают нерастворимые компоненты и взбалтывают фильтрат с 1 н. сол ной кислотой, затем с водой. После сушки органической фазы и отгонки растворител  получают масл нистый остаток, который очищают хроматографией на колонне с силикаге- лем (элюент: уксусный эфир - петро- лейный эфир 1:1)
ДС: Rf 0,70 (уксусный эфир - гексан 1:1).
Пример 2. а). Сложный моноэфир 1,2-0-диоктил-рац-глицеро-З- глутаровой кислоты.
Получение аналогично примеру 1а из 13 г (41 ммоль) 1,2 0-диоктил-гли церина, 150 мл хлороформа, 10 мл пиридина и 6,8 г (59,5 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты. Выход 6,5 г (37%).
ДС: Rf 0,31 (уксусный эфир - пе ролейный эфир 1:1).
Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0- диоктил-рац-глицеро-3-глутаровой кислоты.
b). Получение аналогично примеру Ib из 2 г (4,5 ммоль) по примеру 2а. с). 0,96 г (4,5 ммоль) резоруфина раствор ют в 50 мл хлороформа при добавке 0,75 мл (5 ммоль) 1,8-диаза- бицикло-(5,4,0)-ундец-7-ена и 0,1 г 4-диметиламинопиридина. Туда закапывают раствор по примеру 2Ь в 20 мл хлороформа. После одно- и двухднев04167
- 10
ного перемешивани  при комнатной температуре фильтруют и удал ют растворитель . Переработка аналогична примеру 1с.
ДС: Rf 0,66 (уксусньп эфир гексан 1:1).
Примерз, а). Сложный моноэфир 1,2-0-диоктил-рац-глицеро-З-пи- мелиновой кислоты.
Получение аналогично примеру 1а из 3,2 г (10 ммоль) 1,2-0-диоктил- глицерина и 2,1 г (15 ммоль) ангидрида пимелиновой кислоты.
ДС: Rf 0,61 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:1).
IR (см-):(пленка):1740; 1710.
Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0- диоктил-рац-глицеро-3-пимелиновой
кислоты.
Ъ). Получение аналогично примеру 1Ь из 2,2 г (4,7 ммоль) За.
с). Получение аналогично примеру 2с из 1 г (4,7 ммоль) резоруфина, 25 0,7 мл 1,8-диазабицикло-(5,4.0)-ун- дец-7-ена и ЗЬ.
ДС: Rf 0,78 (уксусный эфир - гексан 1:2).
Пример4. а). Сложньй моноэфир 1,2-0-диоктил-рац-глицеро-З-азе- лаиновой кислоты.
15
20
30
0
5
Получение аналогично примеру 1а из 6,3 г (20 ммоль) 1,2-0-диоктил- глицерина, 80 мл хлороформа, 5 мл пиридина и 5,2 г (30 ммоль) ангидрида азелаиновой кислоты.
Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0- диоктил-рац-глицеро-3-азелаиновой
кислоты.
Ь). Получение аналогично примеру Ь из 3,2 г (6,5 ммоль) 4а и 3 мл хлористого оксалила.
с). Получение аналогично примеру 2с из 1,4 г (6,5 ммоль) резоруфина , 65 мл хлороформа, 1,1 мл 1,8- диазабицикло-(5,4,0)-ундец-7-ена и 4Ь.
ДС: Rf 0,86 (уксусный эфир - гексан 1:2).
IR (см- ): (пленка) 1762; 1736.
Пример5. а). Сложный моноэфир 1,2-0-дидецил-рац-глицеро-З- глутаровой кислоты.
Получение аналогично примеру 1 а из 3,7 г (10 ммоль) 1,2-0-дидецил- глицерина, 40 мл хлороформа, 2,5 мл пиридина и 1,8 г (15,8 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты.
0
5
ДС: Rf 0,77 (уксусньш эфир - гексан 1:2),
Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0 дидецил-рац-глицеро-3-глутаровой кислоты,
b). Получение аналогично примеру 1Ьиз 2,5 г (Зммоль) 5а, 50 мл хлорформа и 2,2 мл хлористого оксалила.
с). Попучение аналогично приме- ру 2с из 1,1 г (5 ммоль) резоруфи- на, 1 мл 1,8-диазабицикло-(5,4,0)- ундец-7-ена и 5Ь.
ДС: Rf 0,70 (уксусный эфир - гексан 1:1).
П р и м е р б. а). Сложный моноэфир 1,2-0 диундецил-рац-глицеро З- глутаровой кислоты.
Получение аналогично примеру 1а. из 2 г Г 5 ммоль ) 1,2-0-диундецш1- глицерина, 25 мл хлороформа, 1,4 мл пиридина и 0,9 г (7,5 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты.
ДС: Rf 0,55 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:2).
IR (см ):(пленка) 1740; 1710.
Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0 диундецил-рац-глицеро-3-глутаровой кислоты.
Ь). Получение аналогично приме- pyjb из 2 г (3,9 ммоль) 6а 5 мл хлороформа и 1,8 хлористого оксалил
с). Получение аналогично примеру 2с из 0,83 г (3,9 ммоль) резору- фина, 0,61 мл 1,8-диазабицикло-(5,4 0)-ундец-7-ена и 6Ъ.
ДС: Rf 0,47 (RP 18, этанол - ацетон 2:1).
П р и м е р 7. а). Сложный моноэфир ,2-0 -дилаурШ1-рац-глицеро-3- глутаровой кислоты.
Получение аналогично примеру 1 а из 10,7 г (25 ммоль) 1,2-0-дилаурил- глицерина, 70 мл хлороформа, 5,5 пиридина и 3,3 г (29 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты.
ДС: Rf 0,33 (уксусный эфир - перолейный эфир 1:1).
IR()(пленка): 1741; 1708.
Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0- дилаурил-рац-глидеро-З-глутаровой кислоты
Ь)„ Получение аналогично примеру 1Ь из 5,5 г (10 1чмоль) 7а, 50 мл хлороформа и 4,3мл хлористого оксалил
сТ Иолучение аналогично примеру 2с из 2,2 г (10 ммоль) резоруфина, 100 мл хлороформа и 1,5 ил 1,8-диaз бициклo-(5 94,0)-ундец-7-ена и 7Ь.
8
ДС: Rf 0,78 (уксусный эфир/петр лейный эфир 1:1).
IR (см-О(пленка): 1765; 1720.
П р и м е р 8. а). Сложный моноэфир 1,2-0-дилаурШ1-рац-глицеро-3- пимелиновой кислоты.
Получение аналогично примеру 1а и 8,6 г (20 ммоль) 1,2-0-дилаурил-гли- церина, 50 мл хлороформа, 15 мл пиридина и 4,3 г (30 ммоль) ангидрида пимелиновой кислоты.
ДС: Rf 0,5 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:2).
IR ()(пленка): 1740; 1710. Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0дилаурил-рац-глицеро-З-пимелиновой кислоты.
Ь). Получение аналогично примеру Ib из 1,66 г (3 ммоль) 8а и 1,3 мл хлористого оксалила.
с). Получение аналогично примеру 2с из 0,65 г (3 ммоль) резоруфина, 30 мл хлороформа, 0,5 мл 1,8-диаза- бицикло-(5,4,0)-ундец-7-ена и &Ь.
ДС: Rf 0,75 (уксусный эфир - Iгексан 1:1).
IR (см- )(пленка): 1768; 1739.
П р им 8 р 9. а). Сложный моноэфир 1,2-0-дитетрадецш1-рац-глицеро- 3-глутаровой кислоты.
Получение аналогично примеру 1а из 14,6 г (30 .ммоль) 1,2-0-дитетра- децил-глицерина, 150 мл хлороформа, 8,2 мл пиридина и 5,1 г (45 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты.
ДС: Rf 0,42 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:2).
IR ()(КВг): 1740;. 1710.
Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0- дитетрадецил-рац-глицеро-3-глутарово кислоты.
Ь). Получение аналогично примеру 1Ь из 3 г (5 ммоль) 9а и 2,2 мл хлористого оксалила.
с). Получение аналогично примеру 2с из 1,06 г (5 ммоль) резоруфина, 50 мл хлороформа, 0,75 мл 1,8-диаза- Iбицикло-(5,4,0)-ундец-7-ена и 9Ь. ДС: Rf 0,34 (RP18, ацетонитрил дихлорметан 1:1).
IR (см ИкВг): 1763, 1735.
П р и м е р 10. а). Сложный моноэфир 1 ,2-0-дитетрадецнл-рац-глицеро3-пимелиновой кислоты .
Получение аналогично примеру 9а из 6,4 г (45 ммоль) ангидрида пимелиновой кислоты.
ДС: Rf 0,45 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:2).
IR ()(пленка): 1740; 1708.
Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0- дитетрадецил-рац-глицеро-З-пимелино- вой кислоты.
Ь). Получение аналогично примеру 1Ь из 3,1 г (5 ммоль) 10а и 2,2 мл хлористого оксалила.
с). Получение аналогично примеру 2с из 1,06 г (5 ммоль) резоруфи- на, 50 мл хлороформа и 0,78 мл 1,8- диазабицикло-(5,4,0)-ундец-7-ена
и lOb,
ДС: Rf 0,71 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:2)
IR (см-)(пленка): 1755; 1734.
Пример 11. а). Сложный моноэфир 1,2-0-дигексадецил-8п-глицероглутаровой кислоты.
Получение аналогично примеру 1а из 2,7 г (5 ммоль) 1,2-0-дигек- садецил-Зп-глицерина, 50 мл хлорофома , 3 мл пиридина и 1,5 г (13 ммоль ангидрида глутаровой кислоты.
ДС: Rf 0,65 (уксусный эфир - петролейный эфир 151)
IR (см- )(КВг) :.1740; 1710.
Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0 дигексадецил-8п-глицеро-3-глутарово
кислоты.
Ь). Получение аналогично примеру 1Ь из 2,2 г (3,3 ммоль) Па и 1 мл хлористого оксалила.
с). Получение аналогично примеру 1с из 0,71 г (3,3 ммоль) резору- фина, 20 мл диметилформамида, 0,5 мл пиридина и ПЬ.
ДС: Rf 0,72 (уксусньш эфир - петролейный эфир 1:2).
Пример 12. а). Сложный моноэфир 1,2-0-дибензил-рац-глицеро-З- глутаровой кислоты
Получение аналогично примеру 1а из 3 г (11 ммоль) 1,2-0-дибензш1- глицерина, 30 мл хлороформа, 2,5 мл пиридина и 1,8 г (16 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты.
ДС: Rf 0,39 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:Г+ 1% лед ной уксусной кислоты).t
Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0- дибензил-рац-глицеро-3-глутаровой
кислоты.
Ь). Получение аналогично примеру 1Ь из 2,9 г (7,5 ммоль 12а), 30 мп хлороформа и 3,3 мл хлористого оксалила .
5
0
5
с) . Получение аналогично примеру , 2с из 1,6 г (7,5 ммоль) резоруфииа, 75 МП хлороформа, 1,2 мл 1,8 диазаби- цикло-(5,4,0)-ундец-7-ена и 12Ь.
ДС: Rf 0,48 (уксусньш эфир - гексан 1:1).
Пример 13. а). Сложный моноэфир 1-0-октадещш-2-0-бензил-5п- глицеро-3-глутаровой кислоты.
Получение аналогично примеру 1а из 2,2 г (15 ммоль 1-0-октадецил-2- О-бензил-Зп-глицерина, 50 мл хлороформа , 3 МП пиридина и 1,5 г (13 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты.
IR ()(пленка): 1730; 1700.
Сложный резоруфиновый эфир 1-0- октадецил-2-0-бензил-8п-глицеро-3глутаровой кислоты.
Ь). Получение аналогично примеру 1Ь из 1,7 г (3,1 ммоль) 1 За и 1,3 мл хлористого оксалила.
с). Получение аналогично примеру 1с из 0,8 г (37 ммоль) резоруфина, 20 мл диметилформамида, 0,7 мл пиридина и 1ЗЬ.
ДС: Rf 0,68 (уксусный эфир - петролейньш эЛир 1:1).
IR ()(КВг): 1768; 1739.
П р и м е р 14.а). Сложньш моно- . эфир 1,2-диоктаноил-5п-глицеро-3-глу- таровой кислоты.
Получение аналогично примеру 1а из 6,8 г (20 ммоль) 1,2-диоктаноил- , Sn-глицерина, 100 мл хлороформа, 12,5 мл пиридина и 5,8 г (50 ммоль) ан1:идрида глутаровой кислоты.
ДС: Rf 0,49 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:1).
Сложный резоруфиновый эфир 1,2- диоктанош1-8п-глицеро-3-глутаровой кислоты.
Ь). Получение аналогично примеру 1Ь из 2,2 г (5 ммоль) 14а и 2,2 мл д5 хлористого оксалила.
с). Получение аналогично примеру 1с из 1,05 г (5 ммоль) резоруфина, 30 мл диметилформамида, 0,75 мл пиридина и 14Ь.
ДС: Rf 0,86 (RP18, ацетонитрил - дихлорметан 1:2).
Пример 15. а). Сложный моноэфир 1,2-диолеил-рац-глицеро-З-глута- ровой кислоты.
Получение аналогично примеру 1а из 3,1 г (5.ммоль) диолеина, 40 мл хлороформа, 3 мл пиридина и 1,5 г (13 ммоль) ангидрида глутаровой кис- лоты.
0
40
50
55
11
ДС: Rf 0,32 (уксусный эфир - п ролейный эфир 1:1).
IR () (пленка): 1740; 1706. Диолеин можно получать в чистой форме из технического диолеина хроматографией на колонне с силикаге- лем при использовании уксусного эфира - петролейного эфира 1:3 в качестве растворител .
Сложный резоруфиновый эфир 1,2- диолеил-рац-глицеро-3-глутаровой кислоты.
Ь). Получение аналогично примеру 1Ь из 3,5 г (4,8 ммоль) 15а и 1,3 м хлористого оксалила.
с). Получение аналогично примеру 1с иэ 0,9 г (4,2 ммоль) резоруфина, 20 мл диметилформамида, 1 мл пиридина 15Ь.
ДС: Rf 0,78 (уксусный эфир - петролейньй эфир 1:1).
Пример 16. Сложный нафтило- вый эфир 1,2-0-дитетрадецил-рац- глицеропимелиновой кислоты.
Получение осзпцествл ют аналогично примеру 1 Ob и с из 0,72 г (5 ммоль) 1-нафтола. Очистка Flash- хроматографией на силикагеле с растворителем уксусным эфиром - гекса- ном 1I3.
ДС: Rf 0,89 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:5).
Пример 17. Сложный реэсруфи- новый эфир 1,2-диолеш1-рац-глидеро- 3-глутаровой кислоты.
10,3 г (14,2 ммоль) сложного мо- нозфира 1,2-диолеил-З-глицеро-глу- таровой кислоты по примеру 15а, 3,2 г (15 ммоль) резоруфина, 6,2 г (30 ммоль) дициклогексилкарбодиими- да и на кончике шпател  4-диметил- аминопиридин перемешивают в 75 мл диметилформамида 2-3 дн  при комнатной температуре. Затем разбавл ют уксусным эфиром и осадок отфильтровывают . Фазу уксусного эфира взбалтывают с 1 н. сол ной кислотой и сушат над сульфатом натри . После отгонки растворител  остаетс  масл нис тый остаток, который очищают хроматографией на колонне с силикагелем (растворитель:уксусный эфир - петролейный эфир 1:1).
Таким образом получают соответст- вующее производное хлорфенолового красного.
ДС: Rf 0,69 (RP18; изопропанол метанол 1:2).
)
041
0
15
20
25
30
,,
Q j л
5
6712
Пример 18. Получение сложного моноэфира 1,2-0-диоктил-З-пимелино- вой кислоты.
Стади  I:. синтез сложного бензило- вого моноэфира пимелиновой кислоты.
Стади  2: аналогично примеру 1Ь из 2,5 г (10 ммоль) сложного бензи- лового эфира пимелиновой кислоты; полученное масло закапывают в раствор 3,2 г (10 ммоль) 1,2-0-диoктшl- глицepинa, 7 мл пиридина; обработка аналогично приме. 1с.
Стади  3: указанный продукт раствор ют в 20 мл тетрагидрофурана и после добавки 0,4 г паллади  - активированного угл  гидрируют. Сырой продукт очищают на колонне с силикагелем; растворитель уксусный эфир - петролейньй эфир 1:1.
ДС: Rf 0,61 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:1)
IR ( ) (пленка): 1740; 1710.
Пример 19. Синтез сложного моноэфира 1,2-диолеил-глицеро-3-глутаровой кислоты.
а). Сложный трихлорзтиловьш эфир 1,2-0-изопропилиден-глидеро-З-глута- ровой кислоты.
Стади  1: 5,55 г (42 ммоль) изопро- пилиденглидерина и 12 г (45,3 ммоль) 2,2,2-трихлорэтш1-гидро-глутарата раствор ют в простом диметиловом эфире этиленгликол  и смев1ивают с 10,5 г (51 ммоль)дидиклогексилкар- бодиимида, после двухдневного перемешивани  фильтруют и подвергают перегонке; т.кип, ; (0,1 торр), бесцветное масло.
ДС: Rf 0,82 (адетон - хлороформ 1:1).
Стади  2: полученное масло раствор ют в П мл простого эфира, смешивают с 3 мл метанола и 3 мл 3 н. сол ной кислоты и перемешивают 12 ч при комнатной температуре; органическую фазу встр хивают с нacьш eнным раствором бикарбоната натри , затем с насыщенным раствором хлористого натри  и сзппат; после удалени  растворител  остаетс  масл нистый остаток.
ДС: Rf 0,23 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:1).
Ь). Сложный трихлорэтиловый эфир 1,2-диолеш1-глидеро-3-глутаровой кислоты.
Стади  3: 6,1 г (18 ммоль) полученного продукта и 7,84 г (38 ммоль) олеиновой кислоты раствор ют в
100 мл простого диметилового эфира ч этиленгликол  и закапывают раствор 10,5 г (37 ммоль)дициклогексилкар- бодиимида в 50 мл простого диметилового эфира этиленгликол ; после 12-часового перемешивани  при комнатной температуре фильтруют и последовательно встр хивают с 3 н. сол ной кислотой с раствором бикарбоната натри , затем с водой. После сушки и концентрировани  органической фазы остаток хроматсграфируют на силика- геле.
Стади  4: слохньш моноэфир 1,2- диолеш1-глицеро-3-глутаровой кислоты отщепление защитной группы трихлор- этила осуществл ют известным методом . .
П р и м е р 20. а). Сложный моноэфир I,2-0-дидецил-рац-глицеро-З- пимелиновой кислоты.
Получение аналогично примеру 1а из 5,6 г (15 ммоль) 1,2-0-дидецил- глицерина, 100 мл хлороформа, 3,2 мл .пиридина и 4,0 г (28 ммоль) ангидрида пимелиновой кислоты.
ДС: Rf 0,36 (уксусный эфир - гексан 1:1).
IR (см-)(пленка): 1735; 1710.
Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0- дидецил-рац-глидеро-3-пимелиновой кислоты.
Ь). Получение аналогично примеру 1Ь из 3 т (5,8 ммоль) 20а, 50 мл хлороформа и 2,2 мл хлористого оксалила
с). Получение аналогично примеру 2с из 1,1 г (5 ммоль) резоруфи- на, 1 мл (6,4 ммоль) 1,8-диазаби- цикло-(5,4,0)-ундец-7-ена и 20Ь.
ДС; Rf 0,71 (уксусный эфир - гексан 1:1).
IR (см - )(пленка): 1755; 1720.
П р и м е р 21. а). Сложный моно- эфир 1,2-0-дилаурил-рац-глицеро-З- азелаиновой кислоты.
;
.
10
15
-
604167
Получение аналогично примеру 1 а из 6,7 г (15,6 ммоль) 1,2-0-дилаурил- глицерина, 100 мл хлороформа, 3,2 мл пиридина и 4,0 г (23 ммоль) ангкдри- i да азелаиновой кислоты.
ДС: Rf 0,22 (уксусный эфир - гексан 1:1)
IR ()(пленка): 1738; 1710.
Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0- дилаурил-рац-глицеро-3-азелаиновой кислотыо
Ь). Получение аналогично примеру 1Ь из 1,5 г (2,5 ммоль) 21а 30 мл . хлороформа и 1,5 мл хлористого оксалила .
с). Получение аналогично примеру 2с из 0,55 г (2,5 ммоль) резоруфи- на, 25 мл хлороформа, 0,5 мл 20 (3,2 ммоль) 1,8-диaзaбициклo-(5,4,0)- yндeц-7-eнa и 21Ь.
ДС: Rf 0,78 (уксусный эфир - гексан 1:1).
IR () (пленка):, 1762; 1740.
П р и м е р 22. 60 мл дистиллированной воды раствор ют при перемешивании 1. ,2 г дезоксихолата натри  и 0,15 мл колипазы (от свиньи). При сильном перемешивании впрыскивают туда по возможности тонкой струей 70 мг субстрата липазы сложного ре- зоруфинового эфира 1,2-0 -диоктил- рац-глицеро-3-азелаиновой кислоты (пример 4) в 1,7 мл п-пропанола при давлении. Раствор, который в 200 мл дистиллированной воды содержит в растворенном виде 1,5 г мочевины, 1 г дезоксихолата натри , 200 мг хлористого натри , 800 мг TRIS и 107 мг TRIS - НС1 буфера, хорошо смешивают с полученной Bbmie эмульсией.
2,5 мл изготовленного таким путем раствора смешивают с 100 мл пробы (сыворотка). Реакцию провод т при 578 мм рт.ст. с показани ми на фотометре .
При известной по стандарту активности липазы вычисл ют активность липазы пробы следующим образом:
25
30
35
40
45
активность
активность
Д Е/мин.
(пробы
активписмл/ V-U .-,,
,i Z§SB§2l2- iE ° b 2.
л .«г«
Д Е/мин
Вычисление активности липазы пробы возможно также по следующей формуле:
активность
(пробы)
(ед./1)
lOOO - V-n1kr ««V
Д Е/мин.
U
л .«г«
Д Е/мин
(стандарт)
где V
ges
5
- общий подъем испытывае- мой исходной смеси, см ;
I
гЗ.
V пробы- объем пробы, см ,
- коэффициент экстинкции
хромогена при 578 нм; d - толщина сло  кюветы,см;
АЕ/мин изменение экстинкции за 1 мин при 578 им.
При названных услови х реакции коэффициент экстинкции составл ет 60,65 см.мкмоль
Пример 23. Дл  различных субстратов липазы определены изменени  величины холостого опыта, чувствительность эстеразы и липазы и коррел ци  к нефелометрическому тесту с помутнением.
Изменение величины холостого опыта определено с реактивом по примеру 1 и различными субстратами липазы Вместо пробы добавл ли 100 мл воды и наблюдали по фотометру изменение зкстинкции при 578 (мЕ/мин).
Дп  определени  чувствительности эстеразы добавл ли вместо пробы 100 мл карбоксилэстеразы (ЕС 3.1.1.1 около 20000 ед/л Берингер Маннхайм ГмбХ, номер определени  10 46 98) и наблюдали, как описано вьше, изменние экстинкциио
Дл  определени  чувствительности липазы вместо пробы добавл ли 100 мл липазы (ЕС 3.1.1.3, около 100 ед/л., Берингер Маннхайм ГмбХ, номер определени  .41 45 90) и наблюдали , как описано вьше, изменение экстинкции,
Дл  определени  коррел ции к фелометрическому тесту с помутнением проводили с возрастающими количествами липазы (0-1000 ед/л) тест с помутнением (Берингер Маннхайм ГмбХ, номер определени  26 23 58), сравнивали с цветным тестом по примеру 22 и определ ли коэффициент коррел ции,.
Результаты показаны в табл.1.
При мер 24. 8,5 г дезоксихола та натри , 0,05 г колипазы, 20 г ман нита, 0,05 г хлористого кальци  , Оэ82 г хлористого натри , 2,7 г TRIS и 0,4 г TRIS-HC1 раствор ют в 200 мл дистиллированной воды. При перемешивании впрыскивают раствор, который содержит в растворенной форме 0,35 г сложного нафтолового эфира 1,2-0 ДИтетрадецш1-рац-глицеро-3- пимелиновой кислоты в 7 мл пропано- ла. Полученную таким путем эмульсию замораживают при -40°С и подвергают лиофилизации.
70 г полученного лиофилизата раствор ют в 2 мл дистиллированной воды
0
5
0
5
0
5
0
5
и смешивают с 100 мл TR-раствора красного паранитроанилина (красный паранитроанилин-4-хлор-З-метилбен- золдиазоний-нафталин-1,5-дисульфо- нат) (231 мг в 10 мл дистиллированной воды).
После добавки 100 мл сыворотки наблюдают за реакцией при 405 нм по фотометру с
Определение концентрации липазы провод т по калибровочной кривой аналогично примеру 22.
Пример 25. В раствор 3,04 г тауродезоксихолата, 2,7 г поливоска 4000, 7 мг хлористого кальци , 0,2 мг колипазы (от свиньи) в 120 дистиллированной воды впрыскивают при перемешивании 150 мг субстрата липазы сложного резоруфинового эфира 1,2-0- дидецил-рац-глицеро-3-глутаровой кислоты в 3,5 мл п-пропанола.
К полученной таким путем эмульсии добавл ют следую ций раствор и хорошо смешивают
10 г тауродезоксихолата, 6,4 г поливоска, 50 г маннита, 14 г мочевины , 800 мг хлористого натри  и 15 г ТР.ИС раствор ют в 300 мл дистиллированной воды. При помощи раствора ной кислоты устанавливают рН 7,5 о После этого раствор дополн ют до 400 мл дистиллированной водой.
2,5 мл полученной таким путем реакционной смеси смешивают с 100 мл сыворотки. Реакцию наблюдают при 578 нм по фотометру.
Оценку провод т, как в примере 22.
П р и м е р 26. В раствор 3,04 г тауродезоксихолата, 2,7 г поливоска 4000, 7 мг хлористого кальци , 0,2 мг колипазы (от свиньи) в 120 мл дистиллированной воды впрыскивают при перемешивании 150 мг субстрата липазы сложного резоруфинового эфира 1,2-0-дидецил-рац-глицеро-З-глу- таровой кислоты в 3,5 мл п-пропанола.
К полученной таким путем эмуль- сии добавл ют и хорошо перемешивают следующий раствор.
10 г тауродезоксихолата, 6,4 поливоска , 50 г маннита, 14 г мочевины, 800 мг хлористого натри , 28 г буфер- ного раствора CHES в 300 мл дистиллированной воды. При помощи раствора сол ной кислоты устанавливают рН 8,5. После этого дополн ют раствор до 400 мл дистиллированной водой.
1716041
2,5 мл полученной таким путем реакционной смеси смешивают с 100 мл сыворотки . Реакцию наблюдают при 578 им по фотометру.
Оценку производ т, как указано в примере 22.
П р и м е р 27, В раствор из 4,0 г тауродезоксихолата Na, 0,06 г хлористого кальци , 0,2 мг колипазы (от Q свиньи), 5,0 г маннита и 2,0 г поливоска 4000 в 100 мл дистиллированной воды впрыскивают при перемешивании 150 мл сложного нафтолового эфира 1,2-0-дитетрадецш1-рац-глицеро-3-пи- 5 мелиновой кислоты, который растворен в 4 мл п-пропанола. При хорошем охлаждении полученную таким путем эмульсию обрабатывают несколько минут ультразвуком 20
Второй раствор содержит в 100 мл 2,4 г тауродезоксихолата Na, 2,0 г TRIS, 12,0 г маннита, 3,5 г мочевины и 0,5 г хлористого натри . При помо- пщ сол ной кислоты устанавливают рН 25 8,3.
Третий раствор содержит 1 г красного паранитроаналина TR (красный па- ранитроаналин TR 4-хлор-метил-бензол-, диазоний-нафталин-1,5-дисульфонат) в ЗО 40 мл дистиллированной зоды в растворенной форме,
5 ч. раствора 1 и 6 ч. раствора 2 смешивают с I ч. раствора 3. Полученным раствором пропитывают пригодную дл  получени  тест-полоски всасывающую бумагу, например, сорта, VS532 фирмы Шл йхер унд Шулл и о сто- рожно сушат в камерной сушилке с цир- кул цией воздуха при температуре от 30 до 654.
До дальнейшего применени  рекомендуетс  хранение в присутствии средства дегидратации.
35
Дл  испытани  на липазу сыворотк
небольшое количество (несколько капель ) ее нанос т на полоску.
На основании кривой окрашивани  в желтый цвет по времени можно еде- лать вывод об активности липазы исследуемой пробы,
П р и м е р 28. а). Сложный моноэфир 1,2-0-дилаурил-рац-глицеро-З- тетрадекандикислоты.
Получение аналогично примеру 1а из 8,6 г (20 ммоль) 1,2-0-дилаурил-. глицерина, 100 мл хлороформа, 4 мл пиридина, 0,4 г диметиламинопириди
Q 5 0
5
О
5
5
на, 9,6 г (40 ммоль) ангидрида двухосновной тетрадекановой кислоты.
ДС: R 0,45 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:5).
Сложный (6-метилрезоруфиновый) эфир 1,2-0-дилаурип-рац-глицеро-З- тетрадекановой дикислоты.
Ь). Получение аналогично примеру 1Ь из 3,35 г (5 ммоль) 28а и 2,2 мл хлористого оксалила.
с). Получение аналогично примеру 2с из 1,2 г (5 ммоль) 4-метш1резору- фина, 20 мл хлороформа, 0,75 мл 1,8- диазабицикло-(5,4,0)-ундец-7-ена, 0,1 г диметиламинопиридина и 28Ь. ДС: R 0,63 (уксусный эфир - гексал 1:4).
d). Получают эмульсию, как указано в примере 22„ Однако вместо названного субстрата липазы примен ют раствор 70 мг субстрата липазы сложного (6-метилрезоруфинового) эфира 1,2-0-дилаурил-рац-глицеро-З-тетра- декановой дикислоты, растворенного в 1,7 мл п-пропанола.
При этом получены следукщие тест- специфические параметры (ср. пример 23 и табл.1): величина холостого опыта 0,2 мЕ/мин; активность эстеразы 0,7 мЕ/мин; чyвcтвитeльнofeть липазы 23,6 мЕ/мин на 100 ед/л; коэффициент коррел ции 0,09509.
П р и м е р 29. Сложный (6-метил- резоруфиновый) эфир 1,2-0-дш1аурил- рац-глицеро-3-глутаровой кислоты,
а). Получение аналогично примерам 7d,-c 2,3 г (10 ммоль). 4-метш1резо - руфина.
ДС: R, 0,68 (уксусный эфир - гексан 1:2).
Ь). Б 60 мл дистиллированной воды раствор ют при перемешивании 0,9 г тауродезоксихолата натри  и 0,3 г кол1тазы (от свиньи). При хорошем перемешивании впрыскивают туда раствор сложного (6-метилрезоруфинового) эфира 1,2-0-дилаурил-рац-гл1щеро-3-глу- таровой кислоты, 70 мг в 1,7 мл п- пропанола. Затем добавл ют.раствор (200 мл), которьй содержит в 200 мл 0,5 г мочевины, 1 г тауродезоксихолата натри , 200 мл хлористого натри  и 2,9 г TRIS и устанавливают его величину рН до 7,5. После хорошего перемешивани  2,5 мл полученного таким путем раствора смешивают с 100 мл пробы (сыворотка). Реакцию наблюдают при 578 нм рт.ст. по фото19 оценку,
16 как указаметру , производ т
но в примере 22,
Тестоспецифические параметры (ср. пример 23 и табл.1): величина холостого опыта П,4 мЕ/мин; чувствительность липазы 28 мЕ/мин на 100 мЕ/мин; коэффициент коррел ции 0,988.
Пример 30. 4-Метилрезоруфин. Получают из 7,5 г 2-метш1-4-нитро- зорезорцина, 4,2 г резорцина, 3,6 г пиролюзита, 4,3 МП серной кислоты, 75 мл метанола, 4 г цинкового порошка и 18 мл 25%-ного аммиака.
ДС: R, 0,70 (этанол - ацетон 2:1).
UY/YIS (0,1 М буферный раствор фосфата кали , рН 8,5),(о,кс 579 нм.
2-Метил-нитрозорезорцин получают по немецкому патенту 23 11 574, AI.
Пример 31. Сложньй (4-метил- умбиллифериловьй) эфир 1,2-0-дш1ау- p IЛ-paц-глицepo-3-глyтapoвoй кислоты,
а). 2,75 г (5 ммоль) 7а и 1 г (5 ммоль) 4-метилумбеллиферона раст- вор юТ в 30 мл тетрагидрофурана и затем добавл ют 2 г (10 ммоль) ди- циклогексилкарбодиимида и 0,15 г диметиламино-пиридина. После 24-часо- вого перемешивани  при комнатной температуре фильтруют и сгущают. Сырой продукт очип ают Flash-хроматографией .
ДС: R 0,40 (уксусньй эфир - петролейный эфир 1:3).
Ь). Эмульсию получают, как указано в примере 22, но вместо использованного там субстрата липазы примен ют 35 мг сложного (4-метилумбеллиферило- вого) эфира 1,2-дш1аурил-рац-глицеро 3-глутаровой кислоты, растворенного в 1,7 мл п-пропанола о
Реакцию наблюдают по флуорометру при 25°С, а именно при длине волны возбуждени  364 нм, ширине щели 5 нм и длине волны излучени  448 нм и ширине щели 10 нмс
Тест-специфические параметры (ср пример 23 и табл.1): величина холостого опыта 0,4 мЕ/мин; чувствительность липазы 28 мЕ/мин на 100 единиц/л; коэффициент коррел ции 0,9942
П р и м е р 32. Сложньй (р-нитро- тиофениловый) эфир 1,2-0-дилaVpил-paц- глицepo-3-rлyтapoвoй кислоты.
Получение 32 -Ь аналогично примерам 7а-Ъ.
5 О
5
0
20
с). Получение аналогично 1 с из 1,4 г (10 ммоль) р-нитротиофенола, 100 мл диметилформамида, 2,4 мл пиридина , 0,2 г диметиламинопиридина и 32Ь.
ДС: R 0,76 (уксусный эфир - гексан 1:4).
d) . В 27 МП дистиллированной воды раствор ют при хорошем перемешивании следующие соединени : 4,83 мг. деоксихолата натри ; 28,00 мг CHES-2- (циклогексиламино)-этан-сульфокисло- та, 17,50 г мочевины, 2,13 мг хлористого натри , 0,16 мг колипазы свиньи, 0,33 мг хлористого кальци , 152,00мг тауродезоксихолата натри ,
рН раствора 8,3. В этот раствор при хорошем перемешивании впрыскивают раствор сложного (р-нитротиофени- лового) эфира 1,2-0-дилаурил-рац-гли- церо-3-глутаровой кислоты. Затем раствор обрабатывали при охлаждении 2 мин ультразвуком (средней интенсивности ) .
В 1 МП полученного таким путем эмульсионного раствора добавл ли 50 мл пробы (содержащей липазу человеческой сыворотки) и смешивали. Реакцию наблюдали при 405 нм рт.ст. по фотометру и проводили вычисление, как указано в примере 22.
Тестоспецифические параметры: величина холостого опыта 0,3 мЕ/мин; чувствительность липазы 12,2 мЕ/мин на 100 ед/л; коэффициент коррел ции 0,998.
П р и м е р 33. а). Сложньй моноэфир 1-О-(2-метокси-октадецил)-2-0- метйл-рац-глицеро-3-глутаровой кислоты .
Получение аналогично примеру 1а из 3 г (7,7 ммоль) 1-0-(2-метокси-окта- децил)-2-0-метил-глицерина, 25 мл хлороформа, 1,8 мл пиридина, 0,1 г диметиламинопиридина и 1,75 (15 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты. Выход 1,5 г (39%).
ДС: R, 0,68 (RP18, ацетон - этанол 1:2).
Сложньй (6-метилрезоруфиновьй) эфир 1-0-(2-метокси-октадецш1)-2-оме- тил-рац-глицеро-3-глутаровой кислоты.
Ь). Получение аналогично примеру 1Ь из 1,5 г (3 ммоль) ЗЗа и 1,5 мл хлористого оксалила.
с). Получение аналогично примеру 2с из 0,68 г (3 ммоль) 4-метилр г
1
зоруфина, 0,45 мл 1 ,8-диазабицикло (5,4,0)-ундец-7-ена и ЗЗЬ .
ДС: R 0,86 (уксусный эфир), d), Тест-эмульсию получают, как указано в примере 22, однако в качес ве субстрата липазы используют сложный (6-метил-резоруфиновый J эфир 1 (2-метокси-октадецил)-2-0-метил-рац глицеро 3-глутаровой кислоты.
Спределение концентрации липазы производ т через калибровочную пр мую из двух стандартов различной концентрации липазы, при которой изменение экстинкции за 1 мин нанос т относительно изменени  экстинкции.
Величина холостого опыта 8,4 мЕ/ми чувствительность эстеразы 25,3 мЕ/ми чувстбительность липазы 19,0 мЕ/мин на 100 ед/л; коэффициент коррел ции 0,9483.
П р и м е р 34. а). Сложный моноэфир 1,2-0-дилаурил-рац-глицеро-З-  нтарной кислоты.
Получение аналогично примеру 1а из 8,56 г (20 ммоль) I,2-0-дилаурШ1- глицерина, 4 г (40 ммоль) ангидрида  нтарной кислоты, 60 мп хлороформа, 4,6 мл пиридина и 0,24 г диметилами- нопиридина. Продукт кристаллизуют из гексана. Т.пл. 41-43°С.
ДС: R, 0,26 (уксусный эфир - гексан 1:4).
Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0-
дилаурил-рац-глицеро-3- нтарной кислоты .
Ь). Получение аналогично примеру 17 из 2,65 г (5 ммоль) 34а, 1,06 г (5 ммоль) резоруфина, 6,18 г (30 ммол дициклогексилкарбодиимида, 0,1 г ди- метиламинопиридина и 50 мл диметил- формамида
ДС: R 0,47 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:3).
с). Получают эмульсию как указано в примере 22, однако в качестбе субстрата липазы в этом случае примен ют 70 мг сложного резоруфинового эфира 1,2-0-дш1аурил-рац-глицеро-3-  нтарной кислоты, растворенного в 1,7 мл п-пропанола.
При этом следующие тест- специфические параметры (ср,пример 23 и табл.1): величина холостого опыта 3,8-4,0 мЕ/мин; чувствительность эс- теразы не определена; чувствительность липазы 8,7 мЕ/мин на 100 ед/л; коэффициент коррел ции 0,8793.
6722
П р и м е р 35. а). Сложный моноэфир 2-0-лаурил-октадекандиол (1,2)глутаровой кислоты.,
Получение аналогично примеру 1а из 4,6 г (10 ммоль) 2-0-лаурил-окта- декандиола (1,2), 29 мл хлороформа, 2,3 мл пиридина, 0,12 г диметлламино пиридина, 2,3 г (20 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты.
ДС: R 0,54 (петролейный эфир - уксусный эфир 4:1)
Сложный (f-метилрезоруфиновый) эфир 2-0-лаурил-октадекандиол (1,2)глутаровой кислоты.
Ь). Получение аналогично примеру 1Ь.из 1,15 г (2 мноль) 35а и 0,88 мл хлористого рксалила.
с). Получение аналогично примеру 2с из 0,45 мл (2 ммоль) 4-метилрезо- руфина, 20 мл хлороформа, 0,3 мл 1,8-диазабицикло-(5,4,0)-ундец-7- ена, 40 мг диметиламинопиридина и 35Ь„
ДС: R, 0,37 (петролейный эфир - уксусный эфир 5:1).
d). Получают эмульсию, как указано в примере 22, однако в качестве субстрата липазы используют 70 мг сложного (б-метил-резоруфинового) эфира 2-0-лаурШ1-октадекандиол-1,2- 1-глутаровой кислоты растворенного .в 1,7 мл п-пропанолао
В соответствии с примером 23, табл.1 получают следующие тест-специфические параметры: величина холостого опыта 0,3-1,0 мЕ/мин; чувствительность эстеразы 1,0 мЕ/мин; чувствительность липазы 25,5 мЕ/минк хна 100 ед/ло, коэффициент коррел ции 0,996с
П р и м е р 36„ а). Сложный моноэфир 1,2-0-дилаурил-рац-З-тиоглицеро- 3-глутаровой кислоты.
Получение аналогично примеру 1а из 2,5 г (4,8 ммоль)1,2-0-дилаурил- рац-З-тиоглицерина 14 мл хлороформа 1 МП. пиридина и 1,1 г (9,6 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты.
ДС: RI 0,5 (гексан - тетрагидро- фуран 1:4).
Сложный (6-метилрезоруфиновый) эфир 1,2-0-дилаурш1-рац-3-тиоглице- ро-3-5-глутаровой кислоты.
Ь). Получение аналогично примеру 1Ь из 0s 74 г (1,3 ммоль) Зба и 0,6 мл хлористого оксалила.
с). Получение аналогично примеру 2с из 0,3 г (1,3 ммоль) 4-метилрезо23
руфина, 13 мл хлороформа, 0,2 мл
1,8-диазобицикло-(5,4,0)-ундец-7-ена
27 мг диметиламинопиридина и ЗбЬ.
ДС: R 0,38 (петролейный эфир
уксусньш эфир 17:3).
Использованньй в качестве исходного вещества 1,2-0-дилаурил-рац-З- тиоглицерин получают известным способом следующим образом.
Превращение 1,2-0-дилаурилглицерина с хлорангидридом толуолсульфо- кислоты до дилаурил-глицеро-3-толуол сульфоната, затем реакци  с тиомочев ной до соответствующей соли изотиоур ни , последующий гидролиз с сол ной кислотой с
ДС: R 0,52 (петролейный эфир - уксусный эфир 49:1).
d). Получают эмульсию, как указано в примере 22. Однако вместо примененного там субстрата липазы используют раствор 70 мг сложного (б-метил резоруфинового) эфира 1,2-0-дш1аурил рац-3-тиоглицеро-3-5-глутаровой кислоты в 1,7 мл п-пропанола
Тестоспецифические параметры: величина холостого опыта 0,2 - 0,9 мЕ/мин; чувствительность эстара- зы 1,3 мЕ/мин; чувствительность ли- паз.ы 4,1 мЕ/мин на 100 ед/л., коэффициент коррел ции 0,857.
П р и м е р 37. а). Сложный моноэфир 1,2-8-дилаурил-рац-1,2-дитио- глицеро-3-глутаровой кислоты.
Получение аналогично примеру 1а из 3 г (6,5 ммоль) 1,2-8-дилаурил- 1,2-дитиоглицерина, 30 мл пиридина и 1,5 г (13 ммоль) ангидрида глу- таровой кислоты.
ДС: Rf 0,43 (петролейный эфир - уксусный эфир 1:1).
ДС: Rf 0,37 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:4).
Сложный (6-метилрезоруфиновьш) эфир 1,2-8-дилаурил-рац-1,2-дитио- глицеро-3-глутаровой кислоты.
Ь). Ползгчение аналогично примеру 1Ь из 1,2 г (2 ммоль) 37а и 1 мл хлористого оксалила.
с). Получение аналогично примеру 2с из 0,46 г (2 ммоль) 4-метилрезо- руфина, 20 мл хлороформа, 0,3 мл 1, диазабицикло-(5,4,0)-ундец-7-ена и 37Ь.
Примененный в качестве исходного вещества 1,2-8-дилаурил-рац-1,2-ди- тиоглицерин получают следующим образом .
24
В раствор 9 г (160 ммоль)гидроокиси кали  в 250 мл этанола закапывают
0
5
10).
при комнатной температуре 10 г (80 ммоль) 2,3-димеркаптопропано- ла в 100 мл этанола. После одночасового перемешивани  закапывают раствор 40 г (160 ммоль) додецилбромида в 100 мл этанола. Дл  дополнени  реакции перемещивают еще два дн , затем фильтруют и фильтрат смешивают со льдом. После подкислени  2 н. сол ной кислотой трижды экстрагируют простым эфиром, органическую фазу сушат и сгущают. Остаток очищают на колонне с силикагелем (растворитель: уксусный эфир - петролейный эфир 1: ДС: Rf 0,54 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:10).
d). Получают эмульсию , как указано в примере 22. Вместо использованного там субстрата липазы примен ют в этом случае сложный (6-метилрезоруфиновый) эфир 1,2-5-дш1аурил-рац-1,2-дитио- 5 глицеро-3-5-глутаровой кислоты, 70 мг, растворенные в 1,7 мл п-пропанола.
Холостой опыт 3 мЕ/мин; чувствительность эстеразы 3,4 мЕ/мин; чувствительность липазы 24 мЕ/мин; коэффициент коррел ции 0,9943.
П р и м е р 38. 4,6-Диметилрезору- финовый эфир 1j 2-0-дилаурил-рац-гли- церо-3-глутаровой кислоты.
Указанное соединение получают аналогично примерам 7а-с, использу  в качестве исходного материала 2,4 г (Ю ммоль) 4,6-диметилрезофурина. Тонкослойна  хроматографи : Rf 0,63 (смесь уксусноэтилового эфира и гексана в соотношении 1:2).
30
35
40
5
0
5
П р и м е р 39. 8-Бром-резоруфи- новый эфир 1,2-0-дилаурил-рац-глице- ро-3-глутаровой кислоты.
Указанное соединение получают аналогично примерам 7а-с, использу  в качестве исходного материала 2,7 г (5 ммоль) 2-бромрезофурина.
Тонкослойна  хроматографи : Rf 0,6 (смесь уксусноэтилового эфира и гексана в соотношении 1:2)
П р и м е р 40. 8-Этш1резоруфино- вый эфир 1,2-0-дилаурил-рац-глицеро- 3-глутаровой кислоты.
Указанное соединение получают аналогично примерам 7а-с, использу  в качестве исходного материала 1,2 г (5 ммоль) 2-этилрезоруфина.
10
20
25
Тонкослойна  хроматографи : Rf 0,51 (смесь уксуснаэтилового эфира и петролейного эфира в соотнррении .1:3)
П р и м е р 41. 1-,6-Диметилреэору- финовый эфир 1,2-0-дилаурил-рац.-гли- церо-3-глутаровой кислоты.
Указанное соединение получают аналогично примерам 7а-с, использу  в качестве исходного материала 1,2 (5 ммоль) 1,6 диметилрезоруфина.
Тонкослойна  хроматографи : Rf 0,73 (смесь уксусноэтилового и петролейного эфиров в соотношении 1:2),
П р и м е р 42. 4,6-Диметилрезору- jj фин.
Указанное соединение получают таким же образом, как Это описано в примере 30, использу  в качестве исходных материалов 60 г 2-метил- 4-нитрсзорезорцина, 43,5 г 2-метил- резорцина, 34 г двуокиси марганца, 40 мл серной кислоты, 400 мл 25%-но- го раствора аммиака и 40 г цинковой пыли.
УФ/VIS . (О, 1 М калийфосфатный буфер с рН 8,5)(сс 585 нм.
П р им е р 43. 2-Бромрезоруфин.
Указанное соединение получают таким же образом, как это описано в примере 30, использу  в качестве исходных материалов 19 г 4-бромрезор- цина, И г 4-нитрозорезорцина, 9,7 г двуокиси марганца, 11,5 мл серной КИСЛОТЫ, 115 мл 25%-ного раствора аммиака и 1,5 г цинковой пыли.
УФ/VIS (0,1 М калийнофосфатный буфер с рН 8,5),акс 576 нм.
П р и м е р 44. 2-Этилрезоруфин.
Указанное соединение ползгчают таким же образом, как это описано в примере 30, использу  в качестве исходных материалов 5 г 4-ЗТИЛ-6-НИТ- розорезорцина, 3,3 г резорцина, 3 г двуокиси марганца, 3,4 мл серной кислоты, 50 мл 25%-ного раствора аммиака и 4 г цинковой пьши.
УФ/VIS (О,. М калийфосфатный буфер с рН 8,5); Л„о(Кс 573 нм.
П р и м е р 45. 1,6-Диметилрезору- фин.
Ука,занное соединение получают таким же образом, как это описано в . примере 30, использу  в качестве исходных материалов 7,2 г 3,5-диокси- толуола, 7,7 г нитрозорезорцина, 4,9 г двуокиси марганца, 6,8 мл сер30
35
40
45
50
55
10
20
25
jj
30
ной кислоты, 60 мл 25%-ного раствора серной кислоты и 6 г цинковой пыли.
УФ/VIS (О,1 М калийфосфатный буфер с рН 8,5) ц.р 574 нм. Цветной тест на липазы (Р 2711.
Результаты определени  активности липазы с замещенными резоруфино- вымк производными по примерам 38-41 представлены в табл.2.
Сравнение коррел ции способа по изобретению и известного по Курсо- ка показано в табл.3.
I

Claims (1)

  1. Формула изобретени 
    Способ определени  липазы, пре- дусматривающий взаимодействие знали- , та с субстратом липазы, привод щее к образованию хромогена, с последующим определением результата оптическим методом, отличающийс  тем, что, с целью повышени  чувстви- -тельности, в качестве субстрата используют грзшпу вег еств общей формулы
    00
    н 1}
    HjC-y- C-A-C-X
    где
    35
    40
    45
    50
    HC-Y-R
    I
    HjC-z-Ki
    R и R X 5
    - алкИльна  или алкилено- ва  группы с 2-12 атомами углерода; одинаковые или различные , каждый обозначает алкильную группу с 6-18 атомами углерода, причем один из R и R обозначает водород;
    резоруфин, б-метилрезору финовый остаток, 4,6-ди- метилрезоруфин, 1,6-ди- метилрезоруфин, 8-этидре : зоруфин и 8-бромрезору фин;
    Уи Z - каждый независимо друг от друга означают -Sили -0-;
    Z -CHji-,
    а оптическим методом определ ют количество высвобожденного гидроксиль- ного или тиолового соединега  непосредственно изда после сочетани  с соответствующим хромогеном.
    Коррел ци  с эталонным Способспособом (коэффициент
    коррел ции)
    ТаблицаЗ
SU864027411A 1985-05-03 1986-04-30 Способ определени липазы SU1604167A3 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19853516001 DE3516001A1 (de) 1985-05-03 1985-05-03 Lipasefarbtest

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SU1604167A3 true SU1604167A3 (ru) 1990-10-30

Family

ID=6269789

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU864027411A SU1604167A3 (ru) 1985-05-03 1986-04-30 Способ определени липазы

Country Status (11)

Country Link
US (2) US4847376A (ru)
EP (1) EP0207252B1 (ru)
JP (1) JPH0687800B2 (ru)
KR (1) KR890003946B1 (ru)
AT (1) ATE78874T1 (ru)
AU (1) AU564688B2 (ru)
CA (1) CA1285941C (ru)
DE (2) DE3516001A1 (ru)
ES (1) ES8704470A1 (ru)
SU (1) SU1604167A3 (ru)
ZA (1) ZA863303B (ru)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2620231B1 (fr) * 1987-09-04 1992-03-27 Strasbourg I Universite Procede de calibration de l'activite lipasique d'origine pancreatique d'un echantillon biologique, mesuree par une methode indirecte
DE3842657A1 (de) * 1988-12-19 1990-06-21 Merck Patent Gmbh Verfahren und mittel zur bestimmung von maleimidgruppen
DE3807123A1 (de) * 1988-03-04 1989-09-14 Boehringer Mannheim Gmbh Substrate fuer phospholipasen
US5248598A (en) * 1989-05-25 1993-09-28 Ivan E. Modrovich Lipase single reagent system
US5378609A (en) * 1988-12-28 1995-01-03 Ivan E. Modrovich Lipase single reagent system
WO1991003544A1 (en) * 1989-08-29 1991-03-21 The Regents Of The University Of California Novel hydrolytic enzyme inhibitors and substrates and assays, methods and kits embodying same
US5352673A (en) * 1989-08-29 1994-10-04 Dennis Edward A Prodrugs
US5308766A (en) * 1989-08-29 1994-05-03 The Regents Of The University Of California Hydrolytic enzyme inhibitors/inactivators and methods for using same
DE4029845A1 (de) * 1990-09-20 1992-03-26 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur bestimmung von phospholipase in koerperfluessigkeiten
TW442570B (en) * 1996-09-19 2001-06-23 Roche Diagnostics Gmbh Improved colour test for the detection of activity of lipase
JP4018237B2 (ja) * 1998-05-11 2007-12-05 株式会社タウンズ 酵素活性測定用リパーゼ基質溶液およびリパーゼ活性測定用試薬キット
US20070122862A1 (en) * 2003-10-29 2007-05-31 Novozymes A/S Screening for lipolytic enzymes or amidase activity
US7514255B2 (en) * 2004-12-03 2009-04-07 Idexx Laboratories, Inc. Methods and devices for detecting pancreatic lipase
US9056085B2 (en) 2009-02-03 2015-06-16 Children's Medical Center Corporation Methods for enhancing hematopoietic stem/progenitor cell engraftment
US9051548B2 (en) 2009-02-03 2015-06-09 Children's Medical Center Corporation Methods for enhancing hematopoietic stem/progenitor cell engraftment
CA2786255A1 (en) * 2009-12-31 2011-07-07 Organomed Corporation Formulations from natural products, turmeric, and aspirin
CN103983626B (zh) * 2014-05-21 2017-08-29 北京安生绿源科技有限公司 一种脂肪酶检测试剂的脂肪酶快速检测方法
WO2016024549A1 (ja) * 2014-08-12 2016-02-18 株式会社シノテスト リパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法及び製造の簡略化方法
CN104198474A (zh) * 2014-08-14 2014-12-10 上海睿康生物科技有限公司 比色法测定血清中脂肪酶含量的检测试剂盒
US10633687B2 (en) 2015-06-19 2020-04-28 Shino-Test Corporation Substrate solution for measuring lipase activity, and method and reagent for measuring lipase activity in sample
JP6947409B2 (ja) * 2016-09-20 2021-10-13 株式会社シノテスト リパーゼ活性の測定方法及び測定試薬並びにリパーゼ活性測定用基質溶液

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH506792A (de) * 1968-09-20 1971-04-30 Merck Ag E Neues Mittel und Verfahren zur Lipasebestimmung
US3986930A (en) * 1974-05-28 1976-10-19 Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. Lipase activity determining method and reagent
DE2904305C2 (de) * 1979-02-05 1981-07-02 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Reagens zur Lipasebestimmung und Verfahren zu seiner Herstellung
JPS5991898A (ja) * 1982-11-19 1984-05-26 Toyo Jozo Co Ltd リパ−ゼ活性測定用組成物
NZ206795A (en) * 1983-01-21 1987-08-31 Merck Frosst Canada Inc Phenothiazines, analogues and pharmaceutical compositions
US4667032A (en) * 1983-01-21 1987-05-19 Merck Frosst Canada, Inc. Phenothiazone derivatives and analogs
DE3329394A1 (de) * 1983-08-13 1985-02-28 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Chromogene und fluorogene carbonsaeureester, verfahren zu deren herstellung sowie verfahren und mittel zum nachweis und zur bestimmung von hydrolasen

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
.Henning F. Proelss and Billy W. Wright Lipoxygenic Micromethod for Specific Determination of Lipase Activity in Serum . and Duodenal Fluid. Clinical Chemistry v. 23, W 3, 1977, p. 522-531. Shigeru Kurooka, et al. A. Novel and Simple Colorimetric Assay for Human Serum Lipase. J. Biochem., v. 81, № 2, 1977, p. 361-369. *

Also Published As

Publication number Publication date
KR890003946B1 (ko) 1989-10-13
EP0207252B1 (de) 1992-07-29
AU564688B2 (en) 1987-08-20
ES554600A0 (es) 1987-04-16
CA1285941C (en) 1991-07-09
JPH0687800B2 (ja) 1994-11-09
ZA863303B (en) 1987-01-28
EP0207252A2 (de) 1987-01-07
ES8704470A1 (es) 1987-04-16
ATE78874T1 (de) 1992-08-15
AU5700186A (en) 1986-11-06
DE3686212D1 (en) 1992-09-03
JPS61254197A (ja) 1986-11-11
DE3516001A1 (de) 1986-11-06
KR860008995A (ko) 1986-12-19
US4988497A (en) 1991-01-29
EP0207252A3 (en) 1990-04-25
US4847376A (en) 1989-07-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SU1604167A3 (ru) Способ определени липазы
FI85989C (fi) Komposition och anordning foer bestaemning av leukocyter, esteras och proteas i ett prov.
FI85990C (fi) Sammansaettning innehaollande zwitterjonkopplingsmedel och testanordning foer bestaemning av leukocyter.
US6068988A (en) Detection of microbial metabolites with a 3-indoxyl-myo-inositol-1-phosphate compound
EP0039880A1 (de) Mittel zum Nachweis esterolytischer und/oder proteolytischer Enzyme und dafür als Substrate geeignete Phenoxy-Aminosäure- und Phenoxy-Peptidester, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung zur Herstellung der erfindungsgemässen Mittel
US5091527A (en) Substrate for phospholipase
JPH02502916A (ja) １，２‐ジオキセタン類およびその中間体の合成
DE3412939A1 (de) Substrate fuer hydrolasen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
EP0274700B1 (de) Neue Hydrolase-Substrate
US4331760A (en) Diagnostic agent for the detection of leukocytes and chromogens useful therein
EP0423632A1 (de) Hydrolase-Substrate
US4209459A (en) Novel L-leucyl-4-hydroxyanilide derivatives
EP0137177B1 (de) Chromogene und fluorogene Carbonsäureester, Verfahren zu deren Herstellung sowie Verfahren und Mittel zum Nachweis und zur Bestimmung von Hydrolasen
EP0247373B1 (de) 7-(Phenylacetamido)-4-alkylcumarine, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung in Verfahren zur fluorometrischen Bestimmung der Aktivität von Hydrolasen, insbesondere von Penicillin-G-Acylase
US6955921B2 (en) Trypsin substrate and diagnostic device, and method of using same
US6770764B2 (en) Trypsin substrate and diagnostic device, and method of using same
US4716236A (en) Method for synthesizing esters
US4507232A (en) Peptide derivatives
DE68928496T2 (de) Zuckerester-Derivate, Reagenzien zur Messung der Hydrolase-Aktivität und Verfahren zur Messung der Hydrolase-Aktivität
DD244826A5 (de) Verfahren zur optischen Bestimmung der Lipase