KR890003946B1

KR890003946B1 - 리파제 정량방법

Info

Publication number: KR890003946B1
Application number: KR1019860003481A
Authority: KR
Inventors: 뉴만 울리히; 주니우스 마티나; 바쯔 한스-조르그
Original assignee: 뵈링거 만하임 게엠배하; 독트르.다움, 독토르.포우쿠에트
Priority date: 1985-05-03
Filing date: 1986-05-03
Publication date: 1989-10-13
Also published as: EP0207252A3; CA1285941C; EP0207252B1; US4988497A; ES8704470A1; AU5700186A; ES554600A0; JPS61254197A; SU1604167A3; EP0207252A2; DE3516001A1; ZA863303B; ATE78874T1; JPH0687800B2; DE3686212D1; US4847376A; AU564688B2; KR860008995A

Abstract

내용 없음.

Description

리파제 정량방법

본 발명은 신규한 리파제 기질 및 리파제의 광학적 정량 측정 방법 및 시약에 관한 것이다.

리파제(트리아실리글리세롤 아실 가수분해효소 EC 3.1.1.3)는 장쇄 지방산의유화된 트리글리세리드를 기름방울과 물과의 경계표면에서 가수분해 시킨다. 급성 췌장염 혹은 췌장암과 같은 질병이 발생했을때 정상적으로는 매우 낮은 농도로 혈청에 존재하는 리파제가 증가하기 때문에 리파제의 활성을 측정하는 것이 진단에 상당히 중요하다.결과적으로 리파제의 측정이 임상화확 뿐만아니라 생화학, 제약화학 그리고 식품화학 분야에서 상당히 중요하다.

여러가지 리파제 정량 방법이 이미 공지되어 있다, 즉, 유리된 산을 알칼리 용액으로 적정법으로 정량할 수 있으나 이 방법은 오차가 크며 특히 특징적이지 못하다. 또한 UV에 의해서 분광학적 정량 방법도 공지되어 있다. 즉, 독일연방공화국 특허명세서 제 33 42 106호는 비이온성 텐시드(tenside)와 더불어 고급지방산의 모노혹은 디글리세리드를 UV정량의 기질로서 이용하는 방법이 명시되어 있다. 그러나 UV 시험법은 측정장치가 복잡하여 장치의 결점이나 시약의 소모와 같은 오차를 쉽게 인식할 수 없다. 따라서 간단한 장치를 사용해서 직접 시각적으로 감지할 수 있는 색시험법이 필요하다.

색원체로서 디티오비스니트로 벤조산과 더불어 기질로서 디머캅토프로판을 트리에스테르와 에스테라제(esterase) 억제제 및 리파제 활성제를 이용하는 Kurooka 색시험법이 이미 공지되어 있다. 그러나 이 방법은 정확하지는 못하다(J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 20, 537-552/1982). 또한 기질로서 트리리놀레인과 보조계로서 리폭시게나아제(lipoxygenase)를 이용하는 방법은 그 다음 단계에서의 발색반응에서 지방산 과산화수소에 의하여 2가 철이 3가 철로 산화되어 티오시안산 철(III)으로 검출된다. 그러나 이 방법은 신뢰할만한 결과를 나타내지 못한다(J. Clin. Chem. Biochem. 20, 745-752/1982).

또한 혼탁도 정량 방법도 공지되어 있으나 정확성이 낮다.

따라서 본 발명의 목적은 공지된 색시험법의 결점을 나타내지 않고 정확한 결과를 제공하며 사용이 간단하고 높은 감도를 가지며 지체시간(lah phase)이 짧아 여러가지 자동분석계에 적용하는데 어려움이 없는 리파제 정량을 위한 색시험법을 제공하는데 있다.

따라서 본 발명에 의해 제공되는 리파제 기질의 일반식은 다음과 같다.

식중, A는 C₁₆까지의 알킬렌 혹은 알케닐렌기, R및 R₁은 동일하거나 다를 수도 있으며C₂₀까지를 포함하는 알킬, 알케닐 혹은 아실기 혹은 알킬부분이 C₈까지를 포함하는 임의적으로 알킬로 치환된 아릴 혹은 아르알킬기 및 R과R₁중 하나의 수소원자이고, X는 방향족 히드록시 혹은 티올 화합물의 잔기(棧其)이며,X및 Z는 각각 독립적으로-S- 혹은 -O이고, Z는 또한 VCH₂-이다.

리파제 작용에 의하여 본 발명에 따른 리파제 기질은 분할되어 X에 상응하는 방향족 히드록시 혹은 티올화합물을 방출하며 이 화합물은 직접 광학적으로 측정되거나 적당한 발색단과 결합하여 발생하는 색을 측정한다.

R및 R₁은 C₁₆니지C₁₈이 바람직하며 C₈내지 C₁₂가 가장 바람직하다. R 및 R₁는 가수분해에 대해 감도가 낮기 때문에 아실기 보다는 특히 알킬기가 가장 바람직하다. 놀랍게도 비록 천연의 트리글리세리드는 아실기를 표함하지만 R 및 R₁이 알킬, 알케닐 혹은 아르알킬기인 화합물이 리파제 기질로서 바람직하다고 밝혀졌다.

R 및 혹은 R₁의 예로는 알킬리로서 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실, 테트라테실, 부틸, 헥사데실 및 옥타데실기가 있고 상응하는 아실기로는 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 바레틸, 카프로닐, 카프틸, 카피티닐, 라우닐, 미리스틸, 팔미틸 및 스테아릴기와 올레닐, 크로토닐, 리놀ㄹ;ㄹ, 페닐, 벤질 및 옥틸페닐기등이 있다.

본 발명에 따른 리파제 기질은 일반식COOH-A-COOH을 갖는 디카복실산 잔기를 포함하며 이 식에서 A에서C₃내지C₇인 것이 바람직하다. A가 유도되는 산의 예로는 말론산, 숙신산, 글루타르산, 아디프산, 피멜산, 수베르산, 아젤라산, 세바스산, 노산-디카복실산, 데칸-디카복실산 및 운데칸-디카복실산 등이다. 글루타르산부터 아젤라산까지가 C₃내지 C₇에 해당하며 상기 한바 대로 바람직하다.

X는 방향족 히드록시 혹은 티올 화합물의 잔기이며 발색단을 나타내거나 그 다음의 연속적 반응에 의해 제일 먼저 착색물질로 전환된다. 이와 같은 방향성 히드록시 및 티올 화합물의 전형적인 예로는 페놀, 티오페놀, 나프톨, 티오나트톨 및 그 유도체뿐 아니라 레소루핀(resorufin), 크로로페놀 레드(chlorophend red), 인독실(indoxyl) 및 티오프루오르세인(thiofluorescein)과 같은 색원체 화합물을 포함한다. 적당한 히드록시 혹은 티올 화합물을 일일이 열거하는 것은 이들의 수가 많기 때문에 가능하지는 않으나 직접적인 발색단 방향족 히드록시 및 티올 화합물과 발색단으로 전환되는 것들이 잘 공지되어 있다.

극성이 거의 없으며 소수성인 발색단이 바람직하지만, 물에 대한 용해도는 유지되어야 한다.

발색단의 소수성은 예를들어 알킬기와 같은 적절한 치환에 의해서 긍정적인 영향을 받게 된다. 레소루핀 잔기에 대한 적당한 치환기로는 메틸, 디메틸 및 에틸군 뿐 아니라 브롬으로 치환하는 것도 포함된다.

본 발명에 따른 화합물은 신규한 것이다. 이들은 비대칭 중심이 존재하기 때문에 광학적 활성을 지니고 있다. 리파제 기질로서 통상적인 제조 방법으로 얻을 수 있는 라세미체(racemate)뿐 아니라 광학 이성질체도 이용 가능하다.

본 발명에 따른 라파제 기질의 제조는 공지된 방법에 의하여 행할 수 있다. 따라서 1,2-O-디에테르- 및 1,2-디아실-글리세를 화합물의 합성은 Methods in Enzymolgy, 98, 623/1983 및 Oleagineux 23, 185/1968에 기술되어 있다. 예를들어 알칸 디올 유도체의 합성은 Can. J. Biochem. 46(1968) 69에 기술되어 있다.

1,2-O-디에xp르- 및 1,2-디아실-글리세를 화합물로부터 zmf로로vh름/피리딘과 같은 무수 매개물 내에서 상응하는 디카복실산 무수물과의 반응에 의하여 상응하는 글리세로-디카복실산 모노에스테르를 얻을 수 있으며 디카복실산 무수물의 제조 방법은 Houbeen-Weyl-Muller "Methoden der organischen Chemie", Volume IV/4, page 786에 기술되어 있다.

잔기 X의 공급원인 방향족 히드록시 혹은 티올 화합물에 의한 모노에스테르의 에스테르화는 예를들어 디사이클로헥실카보디이미드와 같은 탈수제의 존재하에 방향족 알콜 혹은 티올과 디카복실산 모노에스테르를 직접반응시켜 수행될 수 있다. 다른 방법으로는 디카복실산 모노에스테르를 우선 활성화된 에스테르로 전환, 예를들어 하이드록시 숙신이미드 에스테르 혹은 이미다졸리드로 전환시킨 다음 활성화된 에스테르를 방향족 알콜 혹은 티올과 반응시킨다.

같은 방법으로 우선 방향족 알콜 혹은 티올로서 예를들어 아디프산 모노니트로페닐 에스테르 혹은 글루타르산 모노페닐 에스테르와 같은 디카복실산 모노에스테르를 제조한 후 산염화물, 무수물 혹은 활성화된 에스테르와 같은 중간체 생성을 거쳐 1,2-O-디알킬- 혹은 1,2-디아실-글리세롤으로써 에스테르화 한다. 예를들어 방향족 알콜 혹은 티올에 의한 디카복실산 모노에스테르의 제조는 산무수물과 방향족 화합물의 몰비 1 : 1로부터 혹은 디카복실산과 방향족 화합물의몰비 2 : 1로부터 혹은 쉽게 분할되는 보호기를 가진 디카복실산 모노에스테르와 방향족 화합물로부터 얻을 수 있다. 이에 대한 적절한 방법은 Arch. Pharm. 287. 514/1954에 기술되어 있다.

또 다른 방법으로 1,O-디알킬- 혹은 1,2-O-디아실-글리세로-디카복실산 모노에스테르는 우선 디카복실산 및 벤질 2,2,2-트리클로로에틸 알콜과 같이 쉽게 분할되는 알콜로부터 디카복실산 모노에스테르를 제조한 후 얻어진 산을 상기한 디알킬- 혹은 디아실-글리세롤으로써 에스테르화하여 제조할 수 있다. 그후 보호기를 제거하고 방향족 알콜 및 티올과 반응시켜 상기한 대로 수행할 수 있다.

또 다른 제조방법은 1,2-이소프로필리덴-글리세롤과 같은 보호된 글리세롤과 디카복실산 모노에스테를 먼저 반응시켜 사용하는 보호된 글리세로-3-디카복실산 디에스테르를 생성시킨 다음 글리세롤의 보호기를 제거하고 유리된 히드록실기를 알킬화 혹은 아실화시킨다. 마지막으로 원래 존재하고 있던 모노에스테르기(카복실 보호기)를 분할한 다음 방향족 알콕 및 티올과의 반응시키는 것이다.

본 발명에 따른 상기한 기질의 제조는 번거로운 것이 아니며 다수의 또 달리 그 자체가 공지된 것은 본 발명에 따라 쉽게 화합물을 제조할 수 있다. 상기의 공정에 의해 얻어질 수 있는 라세미 생성물로부터 필요에 따라서는 공지된 분리 공정으로 순수한 광학 이성질체를 얻을 수도 있다. 그러나 공지된 방법에 따라 입체 특이성 합성법에 의하여 이성질체를 얻을 수도 있다.

본 발명에 따른 리파제의 광학적 정량방법은 본 발명에 따라 리파제 기질을 리파제가 함유된 시료로 처리하여 유리된 방향족 히드록시 혹은 티올 화합물을 직접 광학적으로 정량측정하거나 혹은 적당한 색원체와 결하비킨 다음 그로부터 형성된 색을 광학적으로 정량 측정하는 것이다.

이 방법의 독특한 특징은 공지된 방법의 경우에 빈번히 요구되는 보조효소나 에스테라제 억제제를 필요로 하지 않는다는 점이다. 그러한 첨가제는 가격이 고가일 뿐 아니라 대개 안정하지 못하다. 따라서 본 발명의 특수한 장점은 본 발명에 따른 리파제 기질뿐 아니라 완충물질외에도 계면활성제 특히 담즙산염, 코리파제(colipase), 색원체결합제 혹은 염화나트륨과 같은 염을 함유하는 리파제 광학측정 정량용의 간단하고도 저장이 용이한 시약을 제공함에 있다. 이 시약은 바람직하게 우레아, 방부제 혹은 활성제도 함유한다. 시약의 바람직한 조성은 아래와 같다.

기질 : 0.5 내지 10mg/ml

데스옥시콜레이트(desozycholate) :2 내지 50mg/ml

콜리파제 : 0.001 내지 0.01mg/ml

우레아 : 1 내지 100mg/ml

염화나트륨 : 0.1 내지 10mg/ml

완충 물질 : 1내지 50mg/ml

각각의 경우 시험시에 용액으로 만들어 사용한다.

담즙산으로는 코올산(cholic acid), 타우로코올산(taurocholic acid), 데스옥시코올산, 타우로데스옥시코올산, 글리코-데스옥시코올산과 이들의 알칼리 금속염 및 특히 나트륨염등과 같은 계면-활성 담즙산을 사용할 수 있는데, 바람직한 양은 2내지 50mg/ml 이다.

또한 본 발명에 의한 시약의주요 성분은 코리파제이며 불순물이 없는 코리파제가 특히 바람직한데 바람직한 양은 0.001 내지 0.01mg/ml 이다.

또한 본 발명에 따른 시약에는 우레아를 함유하여 바람직한 양은 1 내지 100mg/ml이다.

완충물질로서는 본 발명에 의한 시약중에서 pH 값을 6.0내지 10.5로 조정할 수 있는 것이면 무엇이든 가능하며 7.0내지 9.5의 pH 범위가 바람직하다. 적당한 완충용액으로는 디에탄올아민 완충용액, 트리에탄올아민 완충용액, 트리스 완충용액, 헤페스(hepes) 완충용액(냉동건조 전에 첨가), 탭스(taps) 완충용액, CHES 완충용액(2-(싸이클로헥실아미노)-에탄설폰 산) 및 비신(bicine)과 같은 Good 완충용액이있는데 트리스 완충용액이 가장 바람직하며, 바람직한 완충 물질의 양은 1 내지 50mg/ml 이다.

사용된 염으로서는 알칼리금속, 알칼리토금속 및 암모니옴염이며 0.1 내지 10mg/ml의 농도가 바람직하다

본 발명의 범위내에서 사용된 방부제는 정량하고자하는 리파제의 효소활성을 손상시키지 않는 것을 사용하는데 특히 알칼리금속 아지드 및 특히 소듐아지드가 가장 바람직하다. 기타의 방부제로는 예를들어 티오지드(thiozide) 및 그밖의 황함유방부제들도 사용 가능하며 방부제의 사용량은 0.001 내지 2mg/ml가 바람직하다.

활성제로는 알칼리토금속 이온을 사용할 수 있는데 특히 칼슘이온이 바람직하다. 이들은 칼슘이 존재할 경우에는 데스옥시코올산과 불용성 화합물을 형성하기 때문에 1내지 5mMole의 높은 칼슘농도를 허용할때는 담즙산으로는 타우로-데스옥시콜올산이 바람직하다.

본 발명에 따른 시약을 건조된 상태 혹은 농축된 상태로 해서 사용시에 최종도로해서 사용할 경우 상기된 양을 상당하는 양으로 함유시키고 보호 클로이드의 이용도 바람직하다.

보호 클로이드로 이용할 수 있는 것은 폴리히드록시 화합물, 혈청 알부민, 폴리비닐피롤리돈, 고체 폴리에틸렌 옥사이드 및 이에 상응하는 것이다. 폴리히드록시 화합물이 바람직하며 특히 분자중에 펜토스(pentose)또는 헥소스(hexose) 단위가 10까지인 단량체 및 중량체 펜토스 혹은 헥소스 및/또는 상온에서 고체 상태로 있는 폴리에틸렌 글리콜이 바람직하다. 폴리히드록시 화합물 중 바람직한 것은 만니톨 및 그와 비슷한 당 알콜, 포도당, 올리고당류, 만노스, 말토헵토스, 평균분자량이 3500 내지 7000인 폴리에틸렌 글리콜과 같은 것들이다. 그밖의 보호 클로라이드로 이용되는 것은 예를들면 알라닌과 같은 아미노산, 아라비아고무(gumarabic)와 같은 식물성 검 등과 같은 것이다. 보호 클로라이드 혹은 보호 콜로이드의 혼합물 양은 20 내지 90%중량비가 바람직하다. 당알콜과 폴리알킬렌글리콜의 혼합물이 가장 바람직하다.

본 발명에 따른 시약은 적당한 당체 물질에 항침시킬 수도 있다. 이러한 목적으로 사용할 수 있는 흡수성 담체물질뿐 아니라 팽윤성이 있고 가용성이며 피막형성이 있는 담체물질도 이용할 수 있다. 이러한 형태에서 본 발명에 따른 시약에 사용해서 직접 육안으로 판단할 수 있거나 적당한 측정장치에 의해서 판단할 수 있는 시험지(test strip)를 제조할 수 있다.

본 발명에 따라 리파제를 정량할 수 있는 색시험법은 매우 정확한 결과를 제공하는 동시에 감도가 높다. 이 방법은 조작이 용이하여 시험지에 사용도 가능하다. 이 방법은 지체시간이 매우 짧던지 전혀 지체시간이 없기 때문에 여러가지 자동분석 장치가 쉽게 적용할 수 있다.

정량은 종말점 측정에 의해서 뿐만 아니라 역학적으로도 수행할 수 있다. 공지된 많은 공정과 비교하면 역학적 측정은 반응생성물의 생성을 정지시키거나 진탕시킬 필요가 없다는 장점을 제공한다.

다음의 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이다.

[실시예 1]

a) 1,2-O-디헥실-rac-글리세로-3-글루타르산 모노에스테르

1,2-디헥실글리세롤을 3.3g(11.5mM)을 클로로포름 30ml에 가해서된 용액에 계속하여 피리딘2.5ml, 소량의 4-디메틸아미노 피리딘 및 글루타르산 무수물2.6g(23mM)을 첨가한다. 이 혼합액을 10시간 동안 가열환류하고 식힌 후 200mM의 클로로포름으로 희석한다. 클로로포름상(相)을 1N 염산과 함께 진탕하여 혼합한 후 건조시킨다. 건조제를 여과하여 걸러낸 후 용매를 분리제거하고 잔사를 실리카겔 컬럼을 통하여 정제한다(용리제 : 에틸 아세테이트/석유 에테르 1 : 1 v/v).

TLC : R_f=0.45(에틸 아세테이트/석유 에테르 1 : 2+1% 아세트산).

1,2-O-디헥실-rac-글리세로-3-글루타르산 레소루핀 에스테르

b) 위의 (1a)에서 얻은 것 1,4-(3.7mM)을 20ml의 클로로포름에 녹이고 얼음으로 냉각하면서 2ml(23.3mM)의 염화옥살일을 적가하여 혼합한다. 얼음조를 제거하고 용액을 상온에서 12시간 교반시킨 다음 용매를 분리제거하고 잔사를 톨루엔에 넣은 다음 다시 증발시킨다. 이렇게하여 얻어진 오일을 더이상 정제하지 않고 사용한다.

c) 1.1ml의 피리딘 및 소량의 4-디메틸아미노피리딘을 첨가하면서 디메틸포름아미드 40ml중에 레소루핀 0.8g(3.7mM)을 가해 현탁액을 만든다. 1b)에서 얻은 것을 디메틸-포름아미드 20ml에 가해서 만든 용액을 적가한다. 상온에서 1일 내지 2일 동안 교반시킨 후 반응 혼합액을 여과하고 용매를 분리제거한다. 잔사를 에틸 아세테이트에 넣고 불용성 성분들을 여과하여 제거한 후 1N 염산을 가해 진탕한 다음 물을 가해 진탕한다. 유기상(相)을 건조시키고 용매를 증발시키고 남은 오일 잔사를 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그라피에 의해 정제한다. (용리제 : 에틸 아세테이트/석유 에테르 1 : 1 v/v)

TLC : R_f(에틸 아세테이트/헥산 1 : 1

[실시예 2]

a) 1,2-O-디옥틸-rac-글리세로-3-글루타르산 모노에스테르

실시예 1a)와 유사하게 13g(41mM)의 1,2-O-디옥틸글리세롤, 150ml의 클로로포름, 10ml의 피리딘 및 6.8g(59.5mM)의 글루타르산 무수물로부터 제조한다. 수율 : 6.5g(3.7%) TLC : : R_f=0.31(에틸 아세테이트/석유 에테르 1 : 1 v/v).

1,2-O-디옥틸-rac-글리세로-3-글루타르산 레소루핀 에스테르 :

b) 실시예 1b)와 유사한 방법을 사용하여 2g(4.5mM)의 실시예 2a)의 화합물로부터 제조한다.

c) 0.75ml(5mM)의 1,8-디아자비사이클로-(5,44,0)-운덱-엔 및 0.1g의 4-디메틸아미노피리딘을 첨가하면서 0.96%(4.5mM)으레소루핀을 50ml의 클로로포름에 용해시키고 여기에다 실시예 2b)의 홉합물을 20ml의 클로로포름에 가해서된 용액을 적가한다. 상온에서 1-2일간 교반한 후 반응 혼합액을 여과하고 용매를 분리제거한다. 실시예 1c)와 유사하게 처리한다.

TLC : R_f=(에탈 아세테이트/헥산 1 : 1 v/v).

[실시예 3]

a) 1,2-O-디옥틸-rac-글리세로-3-피멜산 모노에스테르

실시예 1a)와 유사하게 3.2g(10mM)의 1,2-O-글리세롤 및 2.1g(15mM)의 피멜산 무수물로부터 제조한다.

TLC : : R_f(에틸 아세테이트/석유 에테르 1 : 1 v/v).

IR(cm^-1) : (필름) : 1740, 1710

1,2-O-디옥틸-rac-글리세로-3-피멜산 레소루핀 에스테르

b) 실시예 1b와 유사하게 2.2g(4.7mm)의 실시예 3a)의 화합물로부터 제조한다.

c) 실시예 2c)와 유사한 방법을 사용하여 1g(4.7mM)의 레소루핀, 0.71ml)의 1,8-디아자비사이클로-(5,4,0)-운덱-7-엔 및 실시예 3b)의 화합물로부터 제조한다.

TLC : R_f=(에탈 아세테이트/헥산 1 : 2 v/v).

[실시예 4]

a) 1,2-O-디옥틸-rac-글리세로-3-아젤라산 모노에스테르

실시예 1a)와 유사하게 6.2g(20mM)의 1,2-O-디옥틸 글리세롤, 80ml의 클로로포름, 5ml의 피라딘 및 5.2g(30mM)의 아젤라산 무수물로부터 제조한다.

1,2-O-디옥틸-rac-글리세로-3-아젤라산 레소루핀 에스테르

b) 실시예 1b와 유사하게 실시예 4a)의 화합물을 3.2g(6.5mm) 및 3ml 염화옥살일 3ml로부터 제조한다.

c) 실시예 2c)와 유사하게 레소루핀 1.4g(6.5mM), 클로로포름 65ml, 1,8-디아자비사이클로-(5,4,0)-운덱-7-엔 1.1ml 및 실시예 4b)의 화합물로부터 제조한다.

TLC : : R_f=0.86(에틸 아세테이트/석유 에테르 1 : 2 v/v).

IR(cm^-1) : (필름) : 1762, 1736.

[실시예 5]

a) 1,2-O-디데실-rac-글리세로-3-글루타르산 모노에스테르

실시예 1a)와 유사하게 1,2-O-디데실- 글리세롤, 3.7ml의 클로로포름 40ml, 피라딘 2.5ml 및 글루타르 무수물 1.8g(15.8M)로부터 제조한다.

TLC : R_f=0.77(에틸 아세테이트/헥산 1 : 2 v/v).

1,2-O-디데실-rac-글리세로-3-글루타루산 레소루핀 에스테르

b) 실시예 1b와 유사하게 실시예 5a)의 화합물을 2.5g(5mM) 및 클포로포름 50ml 및 염화옥살일 2.2ml로부터 제조한다.

c) 실시예 2c)와 유사한 방법을 사용하여 레소루핀 1.1g(5mM), 1,8-디아자비사이클로-(5,4,0)-운덱-7-엔 1ml 및 실시예 5b)의 화합물로부터 제조한다.

TLC : : R_f=0.70(에틸 아세테이트/헥산 1 : 1 v/v).

[실시예 6]

a) 1,2-O-디운데실-rac-글리세로-3-글루타이산 모노에스테르

실시예 1a)와 유사하게 1,2-O-디운데실사이클로 2g(5mM), 클로로포름 25ml, 피라딘 1.4ml 및 글루타르산 무수물 0.9g(7.5mM)로부터 제조한다.

TLC : R_f=0.55(에틸 아세테이트/석유 에테르 1 : 2 v/v).

IR(cm^-1) : (필름) : 1740, 1710

1,2-O-디운데실-rac-글리세로-3-글루타르산 레소루핀 에스테르

b) 실시예 1b와 유사하게 실시예 6a)의 화합물을 2g(3.9mM), 및 클포로포름 5ml 및 염화옥살일 1.8ml로부터 제조한다.

c) 실시예 2c)와 유사하게 레소루핀 0.83g(3.9mM), 1,8-디아자비사이클로-5(5,4,0)-운덱-7-엔 0.61ml 및 실시예 6b)의 화합물로부터 제조한다.

TLC : R_f=0.47(PR 18, 에탄올/아세톤 2 : 1 v/v).

[실시예 7]

a) 1,2-O-디라우릴-rac-글리세로-3-글루타이산 모노에스테르

실시예 1a)와 유사하게 1,2-디아우릴 글리세롤 10.7g(25mM), 클로로포름, 70ml, 피라딘 5.5ml 및 글루타르산 무수물 3.3g(29mM)로 부터 제조한다.

TLC : R_f=0.33(에틸 아세테이트/석유 에테르 1 : 1 v/v).

IR(cm^-1) : (필름) : 1741, 1708

1,2-O-디아우릴-rac-글리세로-3-글루타르산 레소루핀 에스테르

b) 실시예 1b와 유사하게 실시예 7a)의 화합물 5.5g(10mM), 및 클포로포름 50ml 및 염화옥살일 4.3ml로부터 제조한다.

c) 실시예 2c)와 유사하게 레소루핀 2.2g(10mM), 클로로포름 100ml, 1,8-디아자비사이클로-(5,4,0)-운덱-7-엔 1.5ml 및 실시예 7b)의 화합물로부터 제조한다.

TLC : R_f=0.78(에틸 아세테이트/석유 에테르 1 : 1 v/v).

IR(cm^-1) : (필름) : 1765, 1720

[실시예 8]

a) 1,2-O-디라우릴-rac-글리세로-3-피멜산 모노에스테르

실시예 1a)와 유사하게 1,2-0-디아우릴 글리세롤 8.6g(20mM), 클로로포름, 50ml, 피라딘 15ml 및 피멜산 무수물 4.3g(30mM)로 부터 제조한다.

TLC : R_f=0.5(에틸 아세테이트/석유 에테르 1 : 2 v/v).

IR(cm^-1) : (필름) : 1740, 1710

1,2-O-디아우릴-rac-글리세로-3-피멜산 레소루핀 에스테르 :

b) 실시예 1b와 유사하게 실시예 8a)의 화합물 1.66g(3mM) 및 염화옥살일 1.3ml로부터 제조한다.

c) 실시예 2c)와 유사하게 레소루핀 0.66g(3mM) 클로로포름 30ml, 1,8-디아자비사이클로-(5,4,0)-운덱-7-엔 0.5ml 및 실시예 8b)의 화합물로부터 제조한다.

TLC : R_f=0.75(에틸 아세테이트/헥산 1 : 1 v/v).

IR(cm^-1) : (필름) : 1768, 1739.

[실시예 9]

a) 1,2-O 디테트라데실-rac-글리세로-3-글루타이산 모노에스테르

실시예 1a)와 유사하게 1,2-0-디테트라데실글리세롤 14.6g(30mM), 클로로포름, 150ml, 피라딘 8.2ml 및 글루타르산 무수물 5.1g(45mM)로 부터 제조한다.

TLC : R_f=0.42(에틸 아세테이트/석유 에테르 1 : 2 v/v).

IR(cm^-1) : (KBr) : 1740, 1710.

1,2-O-디테트라데실-rac-글리세로-3-글루타르산 레소루핀 에스테르

b) 실시예 1b)와 유사하게 실시예 9a)의 화합물 3g(5mM), 및 염화옥살일 2.2ml로부터 제조한다.

c) 실시예 2c)와 유사하게 레소루핀 1.06g(5mM), 클로로포름 50ml, 1,8-디아자비사이클로-(5,4,0)-운덱-7-엔 0.75ml 및 실시예 9b)의 화합물로부터 제조한다.

TLC : R_f=0.34(PR 18, 아세토니트릴/디클로로메탄 1 : 1 v/v).

IR(cm^-1) : (KBr) : 1763, 1735

[실시예 10]

a) 1,2-O-디테트라데실-rac-글리세로-3-피멜산 모노에스테르

실시예 9a)와 유사하게 피멜산 무수물 6.4g(45mM)로 부터 제조한다.

TLC : R_f=0.45(에틸 아세테이트/석유 에테르 1 : 2 v/v).

IR(cm^-1) : (필름) : 1740, 1708

1,2-O-디테트라데실-rac-글리세로-3-피멜산 레소루핀 에스테르 :

b) 실시예 2c)와 유사하게 실시예 10a)의 화합물 3.1g(5mM) 및 염화옥살일 2.2ml로부터 제조한다.

c) 실시예 2c)와 유사하게 레소루핀 1.06g(5mM), 클로로포름 5ml, 1,8-디아자비사이클로-(5,4,0)-운덱-7-엔 0.78ml 및 실시예 10b)의 화합물로부터 제조한다.

TLC : R_f=0.34(에틸 아세테이트/석유 에테르 1 : 2 v/v).

IR(cm^-1) : (필름) : 1755, 1734

[실시예 11]

a) 1,2-O-디헥사데실-sn-글리세로-3-글루타르산 모노에스테르

실시예 1a)와 유사하게 1,2-0-디헥사데실-sn-글리세롤 2.7g(5mM), 클로로포름 50ml, 피라딘 3ml 및 글루타르산 무수물 1.5g(13mM)로 부터 제조한다.

TLC : R_f=0.65(에틸 아세테이트/석유 에테르 1 : 1 v/v).

IR(cm^-1) : (KBr) : 1740, 1710

1,2-O-디헥사데실-sn-글리세로-3-글루타르산 테소루핀 에스테르 :

b) 실시예 1b와 유사하게 실시예 11a)의 화합물 2.2g(33mM) 및 염화옥살일 1ml로부터 제조한다.

c) 실시예 1c)와 유사하게 레소루핀 0.71g(3.3mM), 디메포름아미드 20ml, 피라딘 50ml 및 실시예 11b)의 화합물로부터 제조한다.

TLC : R_f=0.72(에틸 아세테이트/석유 에테르 1 : 2v/v).

[실시예 12]

a) 1,2-O-디벤질-rac-글리세로-3-글루타그산 모노에스테르

실시예 1a)와 유사하게 1,2-디벤질글리세롤 3g(11mM), 클로로포름 30ml, 피라딘 2.5ml 및 글루타르산 무수물 1.8g(16mM)로 부터 제조한다.

TLC : R_f=0.39(에틸 아세테이트/석유 에테르 1 : 1 v/v+1% 빙초산)

1,2-O-디벤질-rac-글리세로-3-글루타르산 레소루핀 에스테르

b) 실시예 1b)와 유사하게 실시예 12a)의 화합물 2.9g(7.5mM), 클로로포름 30ml 및 염화옥살일 3.3ml로부터 제조한다.

c) 실시예 2c)와 유사하게 레소루핀 1.6g(7.5mM), 클로로포름 75ml, 1,8-디아자비사이클로-(5,4-0)-운덱-7-엔 1.2ml 및 실시예 12b)의 화합물로부터 제조한다.

TLC : R_f=0.48(에틸 아세테이트/헥산 1 : 1 v/v).

[실시예 13]

a) 1-O-옥타메실-2-0-벤질-sn-글리세로-3-글루타르산 모노에스테르

실시예 1a)와 유사하게 1-0-옥타데실-2-0-벤질-sn-글리세롤 2.2g(5Mole), 클로로포름, 50ml, 피라딘 3ml 및 글루타르산 무수물 1.5g(13mM)로 부터 제조한다.

IR(cm^-1) : (필름) : 1730, 1700

1-O-옥타메실-2-0-벤질-sn-글리세로-3-글루타르산 제소루핀 모노에스테르 :

b) 실시예 1b)와 유사하게 실시예 13a)의 화합물 1.7g(3.1mM) 및 염화옥살일 1.3ml로부터 제조한다.

c) 실시예 1c)와 유사하게 레소루핀 0.8g(37mM), 디메틸포름아미드 20ml, 피리딘 0.7ml 및 실시예 13b)의 화합물로부터 제조한다.

TLC : R_f=0.68(에틸 아세테이트/헥산 1 : 1 v/v).

IR(cm^-1) : (KBr) : 1768, 1739.

[실시예 14]

a) 1,2-디옥타노일-sn-글리세로-3-글루타르산 모노에스테르

실시예 1a)와 유사하게 1,2-디옥타노일-sn-글리세롤 6.8g(20mM), 클로로포름 100ml, 피라딘 12.5ml 및 글루타르산 무수물 5.8g(50mM)로 부터 제조한다.

TLC : R_f=0.68(에틸 아세테이트/석유 에테르 1 : 1 v/v)

1,2-디옥타노닐-sn-글리세로-3-글루타르산 레소루핀 에스테르

b) 실시예 1b와 유사하게 실시예 14a)의 화합물 2.2g(5mM) 및 염화옥살일 2.2ml로부터 제조한다.

c) 실시예 1c)와 유사하게 레소루핀 1.05g(5mM), 디메틸포름아미드 30ml, 피리딘 0.75ml 및 14b로 제조한다.

TLC : R_f=0.86(PR 18, 아세토니트릴/디클로로메탄 1 : 2 v/v).

[실시예 15]

a) 1,2-O-디올레일-rac-글리세로-3-글루타르산 모노에스테르

실시예 1a)와 유사하게 디오레인 3.1g(5mMole), 클로로포름 40ml, 피라딘 3ml 및 글루타르산 무수물 1.5g(13mM)로 부터 제조한다.

TLC : R_f=0.32(에틸 아세테이트/석유 에테르 1 : 1 v/v).

IR(cm^-1) : (필름) : 1740, 1706.

1,2-O-디올레일-rac-글리세로-3-글루타르산 레소루핀 에스테르

디올레인(diolein)은 에틸 아세테이트/석유에테르(1:3v/v)를 용리제로 사용하여 실리카 겔상에서 특수 디올레인으로부터 정제된 형태로 얻을 수 있다.

a) 실시예 1b)와 유사하게 실시예 15a)의 화합물 3.5g(4.8mM) 및 염화옥살일 1.3ml로부터 제조한다.

b) 실시예 1c)와 유사하게 레소루핀 0.9g(4.2mM), 디메포름아미드 20ml, 피라딘 1ml 및 실시예 15b)의 화합물로부터 제조한다.

TLC : R_f=0.78(에틸 아세테이트/석유 에테르 1 : 1v/v).

[실시예 16]

1,2-0-디테트라데실-rac-글리세로피멜산 나프틸 에스테르

실시예 10b) 및 c)와 유사하게 0.72g(5mM)의 1-나프톨로부터 제조한다. 용리제로서 에틸 아세테이트/헥산(1 : 3v/v)를 사용하여 실리카 겔상에서 플래쉬(flash)크로마토그라피에 의하여 정제한다.

TLC : R_f=0.89(에틸 아세테이트/석유 에테르 1 : 5v/v)

[실시예 17]

1,2-디올레일-rac-글리세로-3-글루타르산레소루핀 에스테르

실시예 15a)에 따른 1,2-디올레일-3-글리세로 글루타르산 모노에스테르 10.3g(14.2mM), 래소루핀 3.2g(15mM), 디사이클로헥실카보디이미드 6.2g(30mM) 및 소량의 4-디메틸아미노피리딘을 디메틸포름아미드 75㎖내에서 상온에서 2 내지 3일동안 교반한다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고 침전물을 여과한다. 에틸 아세테이트 상(相)에 1N 염산을 가하여 교반하고 무수 황화나트륨으로 건조한다. 용매를 증류한후 오일 잔사는 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 얻는다. (용리제 : 에틸 아세테이트/석유 에테르 1 : 1v/v).

이와 동일한 방법으로 클로로페놀 레드에 상응하는 유도체를 제조한다.

TLC : R_f=0.69(RP 18, 이소프로판올/메탄올 1 : 2v/v)

[실시예 18]

1,2-0-디옥틸-3-피멜산 모노에스테르의 제조

1단계 : 문헌 : J.H.Short, U. Biermacher, Chim. Ther., 1966, 456 ; 피멜산 모노벤질 에스테르의 합성.

2단계 : 실시예 1b)와 유사하게 피멜산 모노벤질 에스테르 2.5g(10mM)로부터 제조한다. 얻어진 오일에 1,2-0-디옥틸글리세롤 3.2g(10mM)을 피리딘 7㎖에 용해한 용액을 적가한다. 실시예 1c)와 유사하게 처리한다.

3단계 : 위의 생성물을 테트라히드로푸란 20㎖에 용해하고 팔라듐/활성탄 0.4g을 첨가한후 수소로 처리한다. 조(粗)생성물을 실리카 겔상에서 정제한다. 용리제 : 에틸 아세테이트/석유 에테르(1 : 1v/v).

TLC : R_f=0.61(에틸 아세테이트/석유 에테르 1 : 1v/v)

IR(㎝^-1) : (필름) : 1740,1710.

[실시예 19]

1,2-디올레일글리세로-3-글루타르산 모노에스테르의 합성

a) 1,2-0-이소프로필리덴글리세로-3-글루타르산 트리클로로에틸 에스테르

1단계 : 이소프로필리덴글리세롤 5.55g(42mM) 및 2,2,2-트리클로로에틸 글루타르산 수소 12g(45.3mM)를 에틸렌 글리콜디메틸 에테르에 용해시키고 디사이클로헥실카보디이미드 10.5g(51mM)와 함께 혼합한다. 2일간 교반한후 반응 혼합액을 여과하고 여과된 것을 증류한다 : b.p. 170℃/0.1mm Hg, 무색오일

TLC : R_f=0.82(아세톤/클로로포름 1 : 8v/v).

2단계 : 얻어진 오일을 디에틸에테르 11㎖에 용해시키고 메탄올 3㎖ 및 3N 염산 3㎖과 혼합하여 상온에서 12시간 교반한다. 유기상(相)을 탄산수소나트륨 포화용액과 교반한 다음 염화나트륨 포화용액과 교반한후 건조시킨다. 용매를 스트립한후 오일 잔사를 얻는다.

TLC : R_f=0.23(에틸 아세테이트/석유 에테르 1 : 1v/v).

b) 1,2-디올레일그리세로-3-글루타르산 트리클로로에틸 에스테르

3단계 : 6.1g(mM)의 상기 생성물 및 올레인산 7.84g(38mM)을 에틸렌글리콜 디메틸 에테르 100㎖에 용해하고 에틸렌 글리콜 디메틸 에테르 50㎖에 디사이클로헥실카보디이미드 10.5g(35mM)를 용해한 용액을 적가한다. 상온에서 12시간 교반한후 반응 혼합액을 여과하고 계속해서 차례로 3N 염산, 탄산수소 나트륨 용액 및 물로 교반한다. 유기상을 건조 및 증발시키고 잔사를 실리카겔상에서 크로마토그라피 한다.

4단계 : 1,2-디올레일글리세로-3-글루타르산 모노에스테르

트리클로로에틸 보호기는 문헌(Juste, Synthesis, 1976, 457)에 기술된 방법으로 분리한다.

[실시예 20]

a) 1,2-0-디데실-rac-글리세로-3-피멜산 모노에스테르

실시예 1a)와 유사하게 1,2-0-디데실글리세롤 5.6g(15mM), 클로로포름 100㎖, 피리딘 3.2㎖ 및 피멜린산 무수물 4.0g(28mM)로부터 제조한다.

TLC : R_f=0.36(에틸 아세테이트/헥산 1 : 1v/v)

IR(cm^-1) : (필름) : 1735, 1710.

b) 1,2-0-디네실-rac-글리세로-3-피멜산 레소루핀 에스테르

실시예 1b)와 유사하게 실시예 20a)의 화합물 3g(5.8mM), 클로로포름 50㎖ 및 염화옥살일 2.2㎖로부터 제조한다.

c) 실시예 2c)와 유사하게 레소푸핀 1.1g(5mM), 1.8-디아자비사이클로-(5,4,0)-운덱-7-엔 1㎖(6.4mM) 및 실시예 20b)의 화합물로부터 제조함

TLC : R_f=0.71(에틸 아세테이트/헥산 1 : 1v/v).

IR(cm^-1) : (필름) : 1755, 1720.

[실시예 21]

a) 1,2-0-디라우릴-rac-글리세로-3-아젤라산 모노에스테르

실시예 1a)와 유사하게 1,2-0-디라우릴글리세롤 6.7g(15.6mM), 클로로포름 100㎖, 피리딘 3.2㎖ 및 아젤라산 무수물 4.0g(23mM)로부터 제조함.

TLC : R_f=0.22(에틸 아세테이트/헥산 1 : 1v/v).

IR(cm^-1) : (필름) : 1738, 1710.

b) 1,2-0-디라우릴-rac-글리세로-3-아젤라산 레소루핀에스테르

실시예 1b)와 유사하게 실시예 21a)의 화합물 1.5g(2.5mM), 클로로포름 30㎖ 및 염화 옥살일 1.5㎖로부터 제조한다.

c) 실시예 2c)와 유사한 방법을 사용하여 레소루핀 0.55g(2.5mM), 클로로포름 25㎖, 1,8-디아자비사이클로-(5,4,0)-운덱-7-엔 0.5㎖(3.3mM) 및 실시예 21b)의 화합물로부터 제조한다.

TLC : R_f=0.78(에틸 아세테이트/헥산 1 : 1v/v).

IR(cm^-1) : (필름) : 1762, 1740.

[실시예 22]

데스옥시코올산 나트륨 1.2g 및 코리파제(돼지로 부터의) 0.15㎎를 60㎖의 증류수에 교반하면서 용해시킨다. 1.7㎖의 n-프로판올에 용해된 70㎎의 리파제 기질 1,2-0-디옥틸-rac-글리세로-3-아젤라인산 레소루핀 에스테르(실시예 4)용액을 격렬히 교반하면서 가압하에서 가능한한 좁은 유동물이되게 주입시킨다. 200㎖의 증류수에 우레아 1.5g, 데스옥시코올산 나트륨 1g, 염화나트륨 200㎎, TRIS 800㎎ 및 TRIS.HCL 107㎎을 포함하는 용액을 앞서 제조한 에멀젼과 잘 혼합한다.

이렇게 해서 제조한 용액 2.5㎖를 100μℓ의 시료(혈청)과 혼합한다. 반응을 578nm Hg에서 측광법(測光法)으로 모니터링한다.

리파제 활성이 공지된 표준치를 사용하여 평가할 경우 시료의 리파제 활성을 다음식에 의하여 계산한다.

활성(시료) =

시료의 리파제 활성은 다음식에 의해서고 계산할 수 있다.

활성(시료)[U/1]=1000·

E/min

Vges=시험 배치(batch)의 총부피[㎤]

V시료=시료의 부피[㎤]

ε=578nm에서 색원체의 흡광율

d=흡수관(cuvette)의 두께[㎝]

=E/min=578nm에서 분당 흡광율변화

상기의 반응 조건일 경우 흡광율은 ε=60.65㎝.μmo1^-1이다.

[실시예 23]

여러가지 리파제 기질에 대해 블랭크(blank)변화, 에스테라제 감도, 리파제 감도 및 탁도계와 혼탁도 시험과의 상호관계를 측정했다.

블랭크 변화는 실시예 1에 따른 시약 및 여러가지 리파제 기질에 의해 결정되었다. 시료대신 100μℓ의 물을 첨가하고 578nm에서 광도계에 의해 흡광율 변화를 측정했다(

mE/min).

에스터라제 감도는 시료대신 100μℓ의 카복실 에스터라제(EC 3.1.1.1 ; 약 20.000 U/1. Boehringer Mannheim GmbH, Order No. 10 46 98)를 첨가하여 위와같은 방법으로 흡광율변화를 측정했다.

리파제 감도는 시료대신 100μℓ의 리파제(EC 3.1.1.3 ; 약 100 U/1, Boehringer Mannheim. GmbH, Orber No. 41 45 90)를 첨가하여 위와 같은 방법으로 흡광율 변화를 측정했다.

탁도계와 혼탁도 시험과의 상호관계를 리파제의 양을 점차 증가시키면서(0-1000 U/1) 혼탁도 시험을 함으로써 실시예 22에 따른 색 시험법과 비교하여 상관계수를 결정하였다.

다음의 표1은 얻어진 결과를 요약한 것이다 :

[표 1]

[실시예 24]

데스옥시코올산 나트륨 8.5%로, 코리파제 0.05g, 만니톨 20g, 염화칼슘 0.05g, 염화 나트륨 0.82g, TRIS 2.7g 및 TRIS.HCI 0.4g을 200㎖의 증류수에 용해시킨다. 프로판올 7㎖에 1,2-O-디에트라아실-rac-글리세로-3-피멜산 나프톨 에스테르 0.35g가 포함된 용액을 격렬히 교반하면서 분출시킨다. 이렇게 얻어진 에멀젼을 -40℃에서 냉각하고 냉동건조시킨다.

70㎎의 냉동건조물을 증류수 2㎖에 용해시키고 100μℓ의 True Red용액과 혼합한다(True Red=4-클로로-3-메틸벤젠디 아조늄-나프탈렌-1,5-디술포네이트)(231㎎을 10㎖증류수에 용해).

100μℓ의 시료(혈청)를 첨가한후 반응을 405nm에서 광도계에 의해 측정한다.

리파제 농도는 실시예 22와 유사하게 보정곡선을 통하여 측정한다.

[실시예 25]

증류수 120㎖에 타우로데스 옥시콜레이트 3.04g, 2.7g의 폴리왁스 4000, 염화칼슘 7㎎, 코리파제(돼지로부터의)0.2㎎을 용해한 용액에 150㎎의 리파제 기질 1,2-O-디데실-rac-글리세로-3-글루타르산 레소루핀 에스테르롤 n-프로판올 3.5㎖에 용해시킨 용액을 교반시키면서 주입시킨다. 얻어진 에멀젼에 다음의 용액을 첨가하고 잘 혼합한다.

300㎖의 증류수에 타우로데스옥시 콜레이트 10g, 폴리왁스 6.4g, 만니톨 50g,우레아 14g, 염화나트륨 800㎎ 및 Tris 15g을 용해시키고 염산을 사용하여 pH 7.5가 되도록 한다음 이 용액을 증류수를 가해 400㎖되도록 한다.

이렇게 해서 제조한 반응혼합물 2.5㎖와 시료(혈청) 10μℓ를 혼합하고 578nm에서 광도계에 의하여 반응을 모니터링한다. 평가는 실시예 22와 같이 수행한다.

[실시예 26]

120㎖의 증류수에 타우로데스 옥시콜레이트 3.04g, 2.7g의 폴리왁스 4000, 염화칼슘 7㎎ 및 코리파제(돼지로부터의) 0.2㎎을 용해시킨 용액에다 3.5㎖의n-프로판올에 150㎎의 리파제 기질 1,2-O-디데실-rac-글리세로-3-글루타르산 레소루핀 에스테르를 용해시킨 용액을 교반하면서 주입시킨다. 이렇게 해서 제조한 에멀젼에다 다음의 용액을 첨가하고 잘 혼합한다.

300㎖의 증류수에 타우로데스 옥시콜레이트 10g, 폴리왁스 6.4g, 만니톨 50g, 우레아 14g, 염화나트륨 800㎎ 및 CHES 28g을 용해시키고 염산을 사용해서 pH 8.5되게 한다음 용액을 증류수를 가해 400㎖가 되도록 한다.

이렇게 해서 제조한 반응혼합액 2.5㎖에 100μℓ의 시료(혈청)를 혼합하고 반응을 578nm에서 광도계에 의해 측정한다. 평가는 실시예 22와 같이 수행한다.

[실시예 27]

증류수 100㎖타우로데스 옥시코올산나트륨 4.0g, 염화칼슘 0.06g, 코리파제(돼지로부터의)0.2㎎, 만니톨 5.0g 및 2.0g의 폴리왁스 4000을 용해하고 여기에 4㎖n-프로판올에 150㎖의 1,2-O-디테트라데실-rac-글리세로-3-피멜산 나프톨 에스테르를 용해한 용액을 교반하면서 주입시킨다. 여기서 얻어진 에멀젼을 수분동안 충분한 냉각과 함께 초음파 처리한다.

두번째 용액은 100㎖내에 타우로-데스옥시코올산 나트륨 2.4g, TRIS 2.0g, 만니톨 12.0g, 우레아 3.5g 및 염화나트륨 0.5g이 포함되도록 제조하고 이 용액의 pH값은 염산으로 8.3이 되게 한다.

세번째 용액은 증류수 40㎖에 1g의 True Red(True Red=4-클로로-3-메틸벤젠디아조늄 나프탈렌-1, 5-디술포네이트)가 포함되도록 제조한다.

6부의 용액 1과 6부의 용액 2를 1부의 용액 3과 혼합한다. 여기서 얻어진 용액을 사용하여 시험지 생산에 적당한 흡수지, 예를들어 type VS 532(Schleicher 및 Schull사 제품)에 함침시켜 30 내지 65℃의 공기 순환식 캐비냇에서 온화하게 건조시킨다.

다시 사용할때까지 함침된 종이를 탈수제 존재하에 저장한다. 시료중의 리파제 함량을 시험하고자 할때 소량의 시료물질을 시험지에 바른다. 황색의 정도에 따라 리파제 활성을 평가할 수 있다.

[실시예 28]

a) 1,2-O-디라우릴-rac-글리세로-3-테트라데칸 디아시드 모노에스테르 :

실시예 1a)와 유사하게 1,2-O-디라우릴 글리세롤 8.6g(20mM), 클로로포름 100㎖, 피리딘 4㎖, 디메틸아미노피리딘 0.4g, 테트라데칸디아시드 무수물 9.6g(40mM)로부터 제조한다.

TLC : R_f=0.45(에틸 아세테이트/석유 에테르 1 : 5)

1,2-O-디라우릴-rac-글리세로-3-테트라데칸디아시드(6-메틸-레소루핀)에스테르

b) 실시예 1b)와 유사하게 실시예 28a)의 화합물 3.35g(5mM) 및 염화옥살일 2.2㎖로부터 제조한다.

c) 실시예 2c)와 유사하게 4-메틸 레소루핀 1.2g(5mM), 클로로포름 20㎖, 1,8-디아자비사이클로-(5,4,0)-운덱-7-엔 0.75㎖, 디메틸아미노피리딘 0.1g 및 실시예 28b)의 화합물로 부터 제조한다.

TLC : R_f=0.63(에틸 아세테이트/헥산 1 : 4)

d) 실시예 22에 설명한 바와같이 실시예 22에서 사용한 리파제기질대신에 1.7㎖의n-프로판올에 70㎎의 1,2-O-디라우릴-rac-글리세로-3-테트라데칸-디아시드-(6-메틸 레소루핀)-에스테르를 용해시킨 용액을 사용하여 에멀젼을 제조한다.

이와같이 해서 다음의 시험 특성이 얻어졌다(실시예 23 및 표 1참조):

블랭크 : 0.2 mE/min

에스터라제 감도 : 0.7mE/min

리파제 감도 : 100U/1당 23.6mE/min

상당계수 : 0.09509

[실시예 29]

1,2-O-디라우릴-rac-글리세로-3-글루타르-(6-메틸-레소루핀)에스테르:

a) 실시예 7a-c와 유사하게 2.3g(10mM) 4-메틸 레소루핀으로 부터 제조한다.

TLC : R_f=0.68(에틸 아세테이트/헥산 1 : 2)

b) 60㎖의 증류수에 타우로데스 옥시코올산 나트륨 0.9% 및 코리파제(돼지로부터의) 0.3g을 교반시키면서 용해한다. 이 용액에 1.7㎖의n-프로판올에 70㎎의 1,2-O-디라우릴-rac-글리세로-3-글루타르산-(6-메틸 레소루핀)-에스테르를 용해시킨 용액을 격렬히 교반하면서 주입시킨다. 이 용액 200㎖에 우레아 0.5g, 타우로데스 옥시코올산 나트륨 1g, 염화나트륨 200㎎ 및 TRIS 2.9g가 포함된 용액 200㎖을 첨가하고 pH값을 7.5되게한다. 효과적으로 혼합한후 이 용액 2.5㎖에 시료(혈청) 100μℓ을 첨가한다.

반응은 578nm Hg에서 광도계에 의해 측정하고 실시예 22에서 기술한 바와 같이 평가한다.

시험특성(실시예 23 및 표 1참조) :

블랭크 : 0.4 mE/min

리파제 감도 : 100mE/min당 28mE/min

상관계수 : 0.988

[실시예 30]

4-메틸레소루핀 :

DE-PS 34 11 574에 기술된 바와같이 2-메틸-4-니트로소레소르신 7.5g, 레소르신 4.2g, 갈색석 3.6g, 황산 4.3㎖, 메탄올 75㎖, 아연분 4g 및 18㎖의 25% 암모니아로부터 제조한다.

TLC : R_f=0.70(에탄올/아세톤 2 : 1)

UV/VIS(0.1M 인산칼륨-완충용액 pH 8.5) : 최대=579nm

2-메틸-니트로소레소르신은 DE-A-34 11 574에 따라서 수행할 수 있다.

[실시예 31]

1,2-O-디라우릴-rac-글리세로-3-글루타르산-(4-메틸움벨리페릴)-에스테르 :

a) 테트라히드로푸란 30㎖에 2.75g(5mM)의 실시예 7a)의 화합물 및 4-메틸움 벨리페론 1g(5mM)을 용해시키고 2g(10mM)의 디사이클로헥실카보디이미드 및 0.15g의 디메틸아미노피리딘을 첨가한다. 상온에서 24시간 교반한후 여과 및 농축한다. 조(粗)생성물을 플래쉬 크로마토그라피에 의해서 정제한다.

TLC : R_f=0.40(에틸 아세테이트/석유 에테르 1 : 3)

b) 에멀젼의 조제는 실시예 22에 기술된 바와같이 수행하며 본 실시예에서 사용한 리파제 기질 대신 1.7㎖의n-프로판올에 35㎎의 1,2-디라우릴-rac-글리세로-3-글루타르산-(4-메틸움벨리페리)-에스테르를 용해한 것을 사용하였다.

반응은 25℃에서 형광계로 모니터링하며, 자국파장은 364nm이고 슬릿(slit)의 폭은 5nm이며 방출파장은 448nm이고 슬릿의 폭은 10nm이다.

시험특성(실시예 23 및 표 1 참조) :

블랭크 : 0.4mE/min

리파제 감도 : 100U/1당 28mE/min

상관계수 : 0.9942

[실시예 32]

1,2-O-디라우릴-rac-글리세로-3-글루타르산-(p-니트로티오페닐)-에스테르 :

실시예 32 a-b)의 제조는 실시예 7a-b와 유사하다.

c) 실시예 1c)와 유사하게 p-니트로티오페놀 1.4g(10mM), 디메틸포름아미드 100㎖, 피리딘 2.4㎖, 디메틸아미노피리딘 0.2g 및 실시예 32 b)의 화합물로부터 제조한다.

TLC : R_f=0.76(에틸 아세테이트/헥산 1 : 4).

d) 다음의 화합물을 27㎖의 증류수에 격렬히 교반하면서 용해시킨다 : 데스옥시코올산 나트륨 4.83㎎ : CHES(=2-(사이클로헥실 아미노)-메탄 술폰산 28.00㎎ : 우레아 17.50g : 염화나트륨 2.13㎎ : 돼지의 코리파제 0.16㎎ : 염화칼슘 0.33㎎ : 타우로 데스옥시코올산 나트륨 152.00㎎ : 이 용액의 pH값을 pH=8.3이 되게 한다. 이 용액을 격렬히 교반하면서 여기에 1,2-O-디라우릴-rac-글리세로-3-글루타르산-(p-니트로피오페닐)-에스테르 용액을 주입시킨다. 이 용액을 초음파(중간세기)처리한후 2분동안 냉각시킨다.

제조된 에멀젼 1㎖에 시료(리파제를 포함하는 사람 혈청) 50μℓ을 첨가하고 혼합한다. 반응을 광도계에 의해 405nm Hg에서 모니터링하고 평가는 실시예 22에 기술된 바와같이 한다.

시험특성 :

블랭크 : 0.3mE/min

리파제 감도 : 100U/1당 12.2mE/min

상관계수 : 0.998

[실시예 33]

a) 1-O-(2-메톡시-옥타데실)-2-O-메틸-rac-글리세로-3-글루타르산 모노에스테르 :

실시예 1a)와 유사하게 1-O-(2-메톡시-옥타데실)-2-O-메틸-글리세롤 3g(7.7mM), 클로로포름 25㎖, 피리딘 1.8㎖, 디메틸 아미노피리딘 0.1g 및 글루타르산 무수물 1.75g(15mM)로 부터 제조한다.

수율 : 1.5g(39%)

TLC : R_f=0.68(RP/18, 아세톤/에탄올 1 : 2)

1-O-(2-메톡시-옥타데실)-2-O-메틸-rac-글리세로-3-글루타르산-(6-메틸 레소루핀)에스테르 :

b) 실시예 1b)와 유사하게 실시예 33a)의 화합물 1.5g(3mM) 및 염화 옥살일 1.5㎖로 부터 제조한다.

c) 실시예 2c)와 유사하게 4-메틸 레소루핀 0.68g(3mM), 1,8-디아자비사이클로-(5,4,0)-운데센-7-엔 0.45㎖ 및 실시예 33b)의 화합물로 제조함.

TLC : R_f=0.86(에틸 아세테이트)

d) 시험 에멀젼의 제조는 실시예 22에 기술된 바와같이 수행할 수 있는데 리파제 기질로는 1-O-(2-메톡시-옥타데실)-2-O-메틸-rac-글리세로-3-글루타르산(6-메틸 레소루핀)을 사용하였다.

리파제 농도의 측정은 리파제 농도가 다른 두개의 표준물로 부터 얻어진 표준 직선을 이용하여, 이 직선은 단위 분당 흡광율 변화 대(對) 흡광율 변화를 그라프화한 것이다.

블랭크 : 8.4mE/min

에스터라제 감도 : 25.3mE/min

리파제 감도 : 100U/1당 19.0mE/min

상관계수 : 0.9483

[실시예 34]

a) 1,2-O-디라우릴-rac-글리세로-3-숙신산 모노에스테르 :

실시예 1a)와 유사하게 1,2-O-디라우릴-글리세롤 8.56g(20mM), 숙신산 무수물 4g(40mM), 클로로포름 60㎖, 피리딘 4.6㎖ 및 디메틸아미노 피리딘 0.24g으로부터 제조한다. 생성물을 헥산으로 결정화한다.

Fp : 41 내지 43℃

TLC : R_f=0.26(에틸 아세테이트/헥산 1 : 4)

1,2-0-디라우릴-rac-글리세로-3-숙신산 레소루핀 에스테르 :

b) 실시예 17)과 유사하게 2.65g(5mM)의 실시예 34a)의 화합물, 레소루핀 1.06g(5mM), 디사이클로카보디이미드 6.18g(30mM), 디메틸 아미노피리딘 0.1g 및 디메틸포름아미드 50㎖로부터 제조한다.

TLC : R_f=0.47(에틸 아세테이트/석유 에테르 1 : 3)

c) 에멀젼 또한 실시예 22에 기술한 바와같이 제조한다. 그러나 이 경우에는 리파제 기질로서 1.7㎖의 프로판올에 70㎎의 1,2-O-디라우릴-rac-글리세로-3-숙신산 레소루핀 에스테르를 용해한 것을 사용한다. 이렇게 해서 다음과 같은 시험특성이 얻어졌다(실시예 23 및 표 1참조).

블랭크 : 3.8 내지 4.0mE/min

에스터라제 감도 : 평가되지 않음

리파제 감도 : 100U/1당 8.7mE/min

상관계수 : 0.8793

[실시예 35]

a) 2-O-라우릴-옥타데칸디올-(1,2)-1-글루타르산 에스테르 :

실시예 1a)와 유사하게 2-O-라우릴-옥타데칸디올-(1,2) 4.6g(10mM), 클로로포름 29㎖, 피리딘 2.3㎖, 디메틸아미노 피리딘 0.12g, 글루타르산 무수물 2.3g(20mM)으로부터 제조한다.

TLC : R_f=0.54(석유 에테르/에틸 아세테이트 4 : 1)

2-O-라우릴-옥탄디올-(1,2)-1-글루타르산-(6-메틸-레소루핀)-에스테르 :

b) 실시예 1b)와 유사하게 1.15g(2mM)의 실시예 35a)의 화합물 및 염화옥살일 0.88㎖로 부터 제조한다.

c) 실시예 2c)와 유사하게 4-메틸레소루핀 0.45g(2mM), 클로로포름 20㎖, 1,8-디아자비사이클로-(5,4,0)-운덱-7-엔 0.3㎖, 디메틸아미노피리딘 40㎎ 및 실시예 35b)의 화합물로 부터 제조한다.

TLC : R_f=0.37(석유 에테르/에틸 아세테이트 5 : 1)

d) 에멀젼을 실시예 22에 기술한 바와같이 제조하는데 리파제기질로는 1.7㎖의 n-프로판올에 70㎎의 2-O-라우릴-옥타데칸디올-(1,2)-1-글루타르산(6-메틸레소루핀)에스테르를 용해한 것을 사용했다.

실시예 23의 표 1에 따라서 다음의 시험특성을 얻었다.

블랭크 : 0.3 내지 1.0mE/min

에스터라제 감도 : 1.0mE/min

리파제 감도 : 100U/1당 25.5mE/min

상관계수 : 0.996

[실시예 36]

a) 1,2-O-디라우릴-rac-3-티오글리세로-3-S-글루타르산 모노에스테르 :

실시예 1a)와 유사하게 1,2-O-디라우릴-rac-3-티오글리세롤 2.5g(4.8mM), 클로로포름 14㎖, 피리딘 1.1㎖ 및 글루타르산 무수물 1.1g(9.6mM)으로부터 제조한다.

TLC : R_f=0.5(헥산/테트라히드로푸란 1 : 4)

1,2-O-디라우릴-rac-3-티오글리세로-3-S-글루타르산(6-메틸레소루핀)에스테르 :

b) 실시예 1b)와 유사하게 0.74g(1.3mM)의 실시예 36a)의 화합물 및 염화옥살일 0.6㎖로 부터 제조한다.

c) 실시예 2c)와 유사하게 4-메틸 레소루핀 0.3g(1.3mM), 클로로포름 13㎖, 1.8-디아자비사이클로-(5,4,0)-운덱-7-엔 0.2㎖, 디메틸 아미노피리딘 27㎎ 및 실시예 36b)의 화합물로 부터 제조한다.

TLC : R_f=0.38(석유 에테르/에틸 아세테이트 17 : 3)

출발물질로 쓰여진 1,2-O-디라우릴-rac-3-티오글리세롤은 Organic Synthesis Ⅲ, page 366 및 page 363에 기술된 다음 방법과 유사하게 얻어졌다.

1,2-O-디라우릴글리세롤 및 염화 톨루올 술폰산이 반응시켜 디라우릴-글리세로-3-톨루올술포네이트를 얻은 다음 이소티우로늄염에 상응하는 티오우레아와 반응시킨후, 염산으로 가수분해한다.

TLC : R_f=0.52(석유 에테르/에틸 아세테이트 49 : 1)

d) 에멀젼을 실시예 22에 따라서 제조한다, 그러나 본 실시예에서 사용한 리파제 기질 대신 1.7㎖의 n-프로판올에 70㎎의 1,2-O-디라우릴-rac-3-티오글리세로-3-S-글루타르산(6-메틸레소루핀)에스테르를 용해한 용액을 이용하였다.

시험특성 :

블랭크 : 0.2 내지 0.9mE/min

에스터라제 감도 : 1.3mE/min

리파제 감도 : 100U/1당 4.1mE/min

상관계수 : 0.857

[실시예 37]

a) 1,2-S-디라우릴-rac-1,2-디티오글리세로-3-글루타르산 모노에스테르 :

실시예 1a)와 유사하게 1,2-S-디라우릴-1,2-디티오글리세롤 3g(6.5mM), 피리딘 30㎖ 및 글루타르산 무수물 1.5g(13mM)으로부터 제조한다.

TLC : R_f=0.43(석유에테르/에틸 아세테이트 1 : 1)

1,2-S-디라우릴-rac-1,2-디티오글리세로-3-글루타르산(6-메틸레소루핀)에스테르 :

b) 실시예 1b)와 유사하게 1.2g(2mM)의 실시예 37a)의 화합물 및 염화옥살일 1㎖로 부터 제조한다.

c) 실시예 2c)와 유사하게 4-메틸레소루핀 0.46g(2mM), 클로로포름 20㎖, 1.8-디아자비사이클로-(5,4,0)-운덱-7-엔 0.3㎖ 및 실시예 37b)의 화합물로부터 제조한다.

TLC : R_f=0.37(석유 에테르/에틸 아세테이트 4 : 1)

출발물질로 이용한 1,2-S-디라우릴-rac-1,2-디티오글리세롤은 다음 방법으로 제조한다.

250㎖의 에탄올에 9g(160mM)의 수산화나트륨이 용해된 100㎖의 에탄올에 10g(80mM)의 2,3-디머르캅토프로판올이 용해된 용액을 상온에서 적가한다. 1시간 동안 교반한후 100㎖의 에탄올에 도데실브로마이드 40g(160mM)을 용해시킨 용액을 적가한다. 2일 이상 계속 교반시켜 완전히 반응시키고 여과한후 여과액은 얼음과 혼합한다. 2N염산으로 산성화시킨후 에테르로 3회 추출하고 유기상을 건조 및 농축한다. 잔사는 실리카겔 컬럼 상에서 정제한다(용리제 : 에틸 아세테이트/석유 에테르 1 : 10).

TLC : R_f=0.54(에틸 아세테이트/석유 에테르 1 : 10).

d) 에멀젼을 실시예 22에 기술된 바 대로 제조한다. 본 실시예에서 사용한 리파제 기질 대신 1,2-S-디라우릴-rac-1,2-디티오글리세로-3-S-글루타르산(6-메틸레소루핀) 에스테르 70㎎을 1.7㎖의 n-프로판올에 용해시킨 용액을 사용하였다.

블랭크 : 3mE/min

에스터라제 감도 : 3.4mE/min

리파제 감도 : 24mE/min

상관계수 : 0.9943

Claims

다음 일반식의 리파제 기질을

식중, A는 C₁₆까지의 알킬렌 혹은 알케닐렌기, R 및 R₁은 동일하거나 다를 수도 있으며 C₂₀까지를 포함하는 알킬, 알케닐 혹은 아실기 혹은 알킬부분이 C₈까지를 포함하는 임의적으로 알킬로 치환된 아릴 혹은 아르알킬기 및 R과 R₁중 하나의 수소원자이고, X는 방향족 히드록시 혹은 티올 화합물의 잔기(殘基)이며, Y 및 Z는 각각 독립적으로 -S- 혹은 -O-이고, Z는 또한 -CH₂-이다. 리파제를 함유하는 시료로 처리하고 방출되는 방향족 히드록시 또는 티올 화합물의 량을 직접 광학적으로 정량 측정하거나 적당한 색원체와 결합시킨 다음 여기서 발생되는 색을 광학적으로 정량 측정하는 리파제의 광학적 정량측정 방법.
제1항에 있어서, R 또는 R₁의 탄소원자수가 8-12인 리파제 기질을 사용하는 측정방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, A의 탄소원자수가 3-7인 리파제 기질을 사용하는 측정방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, X가 비치환 또는 치환된 레소루핀, 클로로페놀 레드, 인독실, 나프톨, 티오페놀, 티오플루오레세인 또는 페놀라디칼인 리파제 기질을 사용하는 측정방법.
제1항에 있어서, 리파제 기질이 1,2-O-디옥틸-rac-글리세로-3-아젤라산 레소루핀에스테르인 측정방법.
제1항에 있어서, 리파제 기질이 1,2-O-디데실-rac-글리세로-3-피멜산레소루핀 에스테르인 측정방법.
제1항에 있어서, 리파제 기질이 1,2-O-디데실-rac-글리세로-3-글루타르산 레소루핀 에스테르인 측정방법.
제1항에 있어서, 리파제 기질이 1,2-O-디도데실-rac-글리세로-3-글루타르산 레소루핀 에스테르인 측정방법.
제1항에 있어서, 시험시에 0.1-10㎎/㎖의 염 농도에서 측정을 실시하는 측정방법.