DD244826A5 - Verfahren zur optischen Bestimmung der Lipase - Google Patents
Verfahren zur optischen Bestimmung der LipaseInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren und das Reagenz zur optischen Bestimmung der Lipase. Mit der Erfindung wird ein Verfahren zur Lipasebestimmung zur Verfuegung gestellt, das sehr einfach in der Handhabung ist und auf die verschiedenen Analysenautomatensysteme ohne weiteres adaptiert werden. Aufgabe der Erfindung ist es, einen Farbtest zur Bestimmung der Lipase zu schaffen, der die Nachteile der bekannten Farbtests nicht aufweist. Ein neues Lipasesubstrat weist die allgemeine Formel H2CYOAO H2CYCACX HCYR H2CZR1worin die Substituenten, die in der Beschreibung angegebene Bedeutung aufweisen. Dieses Substrat eignet sich insbesondere zur optischen Bestimmung der Lipase, indem man es der Entwicklung der lipasehaltigen Probe unterwirft und die Menge der freigesetzten aromatischen Hydroxy- oder Thiolverbindung direkt oder, nach Kopplung mit einem geeigneten Chromogen die daraus gebildete Farbe, optisch bestimmt.
Description
H2C -
worin -j .j,
A eine Alkylen- oder Alkenylengruppe mit 1 bis 16 C-Atomen,
R und R1 die gleich oder verschieden sein können, je eine Alkyl-, Alkenyl- oder Acylgruppe mit 1 bis 20 C-Atomen oder eine gegebenenfalls alkylsubstituierte Aryl- oder Aralkylgruppe mit 1 bis 8 C-Atomen in Alkylrest, einer der Reste R und Ri auch ein Wasserstoffatom,
X den Rest einer atomatischen Hydroxy- oderThiolverbindung und jedes Y und Z unabhängig voneinander-S-oder-O-, Z auch-CO2-, bedeuten,
der Einwirkung der lipasehaltigen Probe unterwirft und die Menge der freigesetzten aromatischen Hydroxy- oder Thiolverbindung direkt oder nach Kopplung mit geeigneten Chromogen die daraus gebildete Farbe, optisch bestimmt.
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man ein Lipasesubstrat einsetzt, worin R oder/und R-i 8 bis 12 C-Atome aufweist.
3. Verfahren nach Punkt !,gekennzeichnet dadurch, daß man ein Lipasesubstrat einsetzt, worin A3 bis7 C-Atome aufweist.
4. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man ein Lipasesubstrat einsetzt, worin X ein gegebenenfalls substituierter Resorufin-, ein Chlorphenolrot-, Indoxyl-, Naphthol-, Thiophenole Thiofluoreszein- oder Phenolrest ist.
5. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man als Lipasesubstrat i^-O-Dioctyl-rac-glycero-S-azelainsäureresorufinester einsetzt.
6. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man als Lipasesubstrat i^-O-Didecyl-rac-glycero-S-üimelinsäureresorfinester einsetzt.
7. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man als Lipasesubstrat 1,2-0-Didecyl-rac-glycero-3-glutarsäureresorufinester einsetzt.
8. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man als Lipasesubstrat i^-O-Didodecyl-rac-glycero-S-glutarsäureresorufinester einsetzt.
9. Verfahren nach Punkt !,gekennzeichnet dadurch, daß man die Bestimmung bei einer Salzkonzentration im Test von 0,1 bis 10mg/ml vornimmt.
10. Reagenz zur optischen Bestimmung der Lipase, gekennzeichnet dadurch, daß es wenigstens eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und Puffersubstanz, sowie Gallensäurealkalisalz, Colipase, Salz, Harnstoff oder/und chromogenen Kuppler enthält.
11. Reagenz nach Punkt'1, gekennzeichnet dadurch, daß es 0,05 bis .10 mg/ml Substrat, 2 bis 50 mg/ml Desoxycholat, 0,001 bis 0,01 mg/ml Colipase, 1 bis 100 mg/ml Harnstoff, 0,1 bis 10mg/ml NaCI, 1 bis 50mg/ml Puffersubstanz, jeweils bezogen auf gebrauchsfertige Lösung, im Test enthält.
12. Reagenz nach Punkt 10 oder 11, gekennzeichnet dadurch, daß es auf einem Trägermaterial imprägniert vorliegt.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur optischen Bestimmung der Lipase und das Reagenz zur optischen Bestimmung der Lipase.
Lipase (Triacyglycerinacylhydrolase EC 3.1.1.3) hydrolysiert emulgierte Triglyceride langkettiger Fettsäuren an der Grenzfläche zwischen Öltröpfchen und wäßriger Phase. Bei bestimmten Erkrankungen, wie akuter Pankreatitis oder Pankreaskarzinom wird die normalerweise sehr niedrige Lipasekonzentration im Serum erhöht und die Bestimmung der Lipaseaktivität hat daher diagnostisch beträchtliche Bedeutung. Die Lipasebestimmung ist daher für die klinische Chemie, aber auch für die Biochemie, die pharmazeutische Chemie und die Lebensmittelchemie von erheblicher Bedeutung.
Es sind bereits eine Reihe von Lipasemeßmethoden bekannt. So wird titrimetisch mit Lauge die freigesetzte Säure bestimmt. Die Methode ist störanfällig und nicht besonders spezifisch. Weiter ist bekannt die photometrische Bestimmung im UV. So wird in der DE-OS 3342106 die Verwendung eines Mono-oder Diglycerids einer höheren Fettsäure in Kombination mit einem
nichtionischen Tensid als Substrat für die UV-Bestimmung beschrieben. UV-Tests benötigen jedoch eine relativ aufwendige Meßapparatur und lassen mögliche Störungen wie Gerätedefekte, Erschöpfung des Reagenz, oft nicht ohne weiteres erkennen. Daher besteht Bedarf an einem Farbtest, der mit einer einfachen Apparatur durchgeführt und direkt visuell kontrolliert werden kann. Bekannt ist bereits der Farbtest von Kurooka unter Verwendung eines Dimerkaptopropanol-Triesters als Substrat zusammen mit einer Dithiobisnitrobenzoesäure als Chromogen, einem Esteraseninhibitor und einem Lipasenaktivator. Dieses Verfahren weist jedoch eine unbefriedigende Genauigkeit auf (J. CMn. Chem. Cliri. Biochem. 20, 537-552 [1982]). Weiter ist bekannt ein Verfahren mitTrilinolein als Substrat, Lipoxygenase als Hilfssystem, wobei in einer anschließenden Farbreaktion durch Fettsäurehydroperoxid Eisen-Il zu Eisen-Ill oxydiert und als Eisen-lll-thiocyanat nachgewiesen wird. Diese Methode ergibt keine zuverlässigen Ergebnisse (J. C. Chem. Biochem. 20,745-752 [1982])
Bekannt ist auch eine Trübungsbestimmung, die jedoch eine relativ geringe Empfindlichkeit aufweist.
Mit der Erfindung wird ein Verfahren zur optischen Bestimmung der Lipase zur Verfugung geteilt, das sehr genaue Ergebnisse bei hoher Empfindlichkeit liefert. Es ist sehr einfach in der Handhabung und eignet sich sogar für Teststreifen. Da es nur eine sehr geringe oder gar keine lag-Phase aufweist, kann es auf die verschieden Analysenautomatensysteme ohne weiteres adaptiert werden.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, einen Farbtest zur Bestimmung der Lipase zu schaffen, der die Nachteile der bekannten Farbtests nicht aufweist, genaue Ergebnisse liefert, einfach in der Handhabung ist, hohe Empfindlichkeit besitzt und nur eine geringe Lag-Phase aufweist, so daß die Adaption an die verschiedenen Analysenautomatensysteme unschwierig ist. Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Lipasesubstrat der allgemeinen Formel
2C -Y-C-A-C-X HC-Y-R
H2C-Z-
A eine Alkylen- oder Alkenylengruppe mit 1 bis 16 C-Atomen, R und Ri die gleich oder verschieden sein können, je eine Alkyl-, Alkenyl- oder Acylgruppe mit 1 bis 20 C-Atomen oder eine gegebenenfalls alkylsubstituierte Aryl- oder Aralkylgruppe mit 1 bis 8 C-Atomen in Alkylrest, einer der Reste R und R1 auch ein Wasserstoffatom,
X den Rest einer aromatischen Hydroxy- oderThiolverbindung und jedes Y und Z unabhängig voneinander-S-oder-O-, Z auch -CH2-, bedeuten.
Unter der Einwirkung der Lipase wird das erfindungsgemäße Lipasesubstrat gespalten unter Freisetzung der dem Rest X entsprechenden aromatischen Hydroxy- oder Thiolverbindung, die man entweder direkt optisch bestimmt oder mit einem geeigneten Chromophor oder Fluorphor kuppelt und das Kupplungsprodukt mißt.
R oder/und R-i weisen vorzugsweise 6 bis 18 C-Atome, besonders bevorzugt 8 bis 12 C-Atome auf. Aufgrund ihrer Hydrolyseunempfindlichkeit werden dabei für R und R1 die Alkylgruppen gegenüber den Acylgruppen besonders bevorzugt.
Überraschenderweise erweisen sich die Verbindungen mit R und R, = Alkyl, Alkenyl oder Aralkyl als gute Lipasesubstrate, obwohl die natürlichen Triglyceride Acylgruppen tragen.
Beispiele für R oder/und R1 sind Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Heptyl-, Octyl-, Nonyl-, Decyl-, Undecyl, Dodecyl-, Tetradecyl-, Hexadecyl- und Octadecylreste als Alkylgruppen sowie die entsprechenden Acylgruppen wie die Acetyl-, Propionyl-, Butyryl-, Valeryl-, Copronyl-, Capryl-, Caprinyl-, Lauryl-, Myristyl-, Palmityl- und Stearylgruppe, die Oleyl-, Crotonyl-, Linolylgruppe, Phenyl-, Benzyl- oder Octylphenylgruppe.
Das erfindungsgemäße Lipasesubstrat enthält weiter den Rest einer Dicarbonsäure COOH-A-COOH, in der A vorzugsweise 3 bis 7 C-Atome aufweist. Beispiele für Säuren, von denen sich A ableitet, sind Malonsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Pimelinsäure, Korksäure, Azelainsäure, Sebacinsäure, Nonandicarbonsäure, Decandicarbonsäure und Undecandicarbonsäure.
Die Säuren von Glutarsäure bis Azelainsäure, die A mit 3 bis 7 C-Atomen entsprechen, werden wie oben erwähnt, bevorzugt.
X kann eine aromatische Hydroxy- oder Thiolverbindung sein, die ein Chromophor darstellt oder erst durch eine Folgereaktion in einen Farbstoff überführt werden kann. Typische Beispiele sind Phenol, Thiophenol, Naphthol, Thionaphthol und deren Derivate sowie die an sich chromogenen Verbindungen wie der Resorufin-, Chlorphenolrot-, Indoxyl- oder Thiofluoreszeinrest.
Eine erschöpfende Aufzählung der geeigneten Hydroxy- oder Thiolverbindungen ist aufgrund ihrer großen Zahl nicht möglich, die direkt chromophoren oder in Chromophore überführbaren aromatischen Hydroxy- oder Thiolverbindungen sind dem Fachmann jedoch bekannt.
Bevorzugt sind Chromophore, die eine geringe Polarität aufweisen und lipophil sind. Dabei sollte jedoch die Wasserlöslichkeit noch gewährleistet sein.
Der lipophile Charakter der o. g. Chromophore kann durch geeignete Substitution, wie z. B. mit Alkylgruppen, positiv beeinflußt werden. Als geeignete Substituentenfür den Resorfinrest haben sich u.a. die Methyl-, Dimethyl- und Äthylgruppe sowie die Substitution mit Brom als geeignet erwiesen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind neu. Sie besitzen ein Asymmetriezentrum und sind daher optisch aktiv. Als Lipasesubstrat können sowohl die bei den üblichen Herstellungsmethoden anfallenden Racemtate als auch die optischen Isomeren verwendet werden.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Lipasesubstrate kann nach an sich bekannten Methoden erfolgen. So finden sich geeignete Verfahren zur Synthese der 1.2-0-Diehter- und 1 ^-Diacylglycerinverbindungen beispielsweise beschrieben in Methods in Enzymology, 98,623 (1983) und Oleagineux 23,185 (1968). Die Synthese von Alkandiolderivaten ist beispielsweise in Can. J. Biochem. 46, 69 (1968) beschrieben.
Aus den 1.2-0-Diether-und 1.2-Diacyl-glyverinverbindungen werden dann durch Umsetzung mit den entsprechenden Dicarbonsäureanhydriden in wasserfreiem Medium wie Chloroform/Pyridin die entsprechenden Glycerodicarbonsäure-Monoester erhalten. Geeignete Methoden zur Herstellung der Dicarbonsäureanhydride sind in Houben-Weyl-Müller „Methoden der organischen Chemie", Band IV/4, Seite 786 beschrieben.
Die Veresterung des Monoesters mit der aromatischen Hydroxy-oder Thiolverbindung, von der sich der Rest X ableitet, kann beispielsweise durch direkte Umsetzung des Dicarbonsäuremonoesters mit dem aromatischen Alkohol oderThiol in Gegenwart eines Wassers entziehenden Mittels wie Dicyclohexylcarbodiimid, durchgeführt werden. Alternativ wird der Dicarbonsäuremonoester zuerst in einen aktivierten Ester überführt, beispielsweise in den Hydroxysuccinimidester oder das Imidazolid und der aktivierte Ester wird dann mit dem aromatischen Alkohol oderThiol umgesetzt.
Ebenso ist es auch möglich, zuerst einen Monoester der Dicarbonsäure mit dem aromatischen Alkohol oderThiol herzustellen, beispielsweise den Adipinsäure-Mononitrophenylester oder Glutarsäuremonophenylester, und diesen dann mit dem 1.2-0-Dialkyl- bzw. Diacylglycerin zu verestern, beispielsweise über intermediäre Bildung eines Säurechlorids anhydride oder aktivierten Esters. Die Herstellung der Dicarbonsäuremonoester mit dem aromatischen Alkohol oder Thiol kann beispielsweise aus Säureanhydrid und aromatischer Verbindung im Molverhältnis 1:1 oder aus Dicarbonsäure und aromatischer Verbindung im Molverhältnis 2:1 oder aus einem Dicarbonsäuremonoester mit leicht abspaltbarer Schutzgruppe und der aromatischen Verbindung erfolgen. Eine geeignete Methode ist beispielsweise in Arch. Pharm. 287, 514 (1954) beschrieben.
Alternativ kann der 1.2-0-Dialkyl- bzw. 1.2-0-Diacylglycero-dicarbonsäure-monoesterauch hergestellt werden, indem man zunächst einen Dicarbonsäuremonoester aus der Dicarbonsäure und einem leicht abspaltbaren Alkohol, wie z. B. Benzylalkohol oder 2,2,2-Trichlorethylalkohol herstellt und die so erhaltene Säure dann mit dem erwähnten Dialkyl- bzw. Diacyl-Glycerin verestert. Anschließend wird die Schutzgruppe entfernt und die Umsetzung mit dem aromatischen Alkohol oderThiol, wie oben beschrieben, vorgenommen.
Eine weitere Hertellungsrr jthode besteht darin, daß man zuerst ein geschütztes Glycerin wie 1,2-lsopropylidenglycerin mit einem Dicarbonsäuremonoester umsetzt unter Bildung des entsprechenden geschützten Glycero-3-dicarbonsäure-diesters, dann die Schutzgruppe des Glycerins entfernt und die freigewordenen OH-Gruppen alkyliert bzw. acyliert. Schließlich wird die ursprünglich vorhandene Monoestergruppe (Carboxylschutzgruppe) abgespalten und mit dem aromatischen Alkohol oderThiol umgesetzt.
Die oben beschriebene Herstellung der erfindungsgemäßen Substrate ist nicht erschöpfend und dem Fachmann stehen eine Reihe weiterer an sich bekannter Methoden zur Verfugung, die es ihm ermöglichen, jede der erfindungsgemäßen Verbindungen ohne weiteres herzustellen. Aus den nach den oben erläuterten Verfahren erhaltenen racemischen Produkten können gewünschtenfalls die reinen optischen Isomeren nach bekannten Trennverfahren gewonnen werden. Ebenso lassen sich die Isomeren aber auch durch stereospezifisch ablaufende Synthese nach ebenfalls an sich bekannten Verfahren gewinnen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur optischen Bestimmung der Lipase ist dadurch gekennzeichnet, daß man ein erfindungsgemäßes Lipasesubstrat der Einwirkung der lipasehaltigen Probe unterwirft und die Menge der freigesetzten aromatischen Hydroxy- oder Thiolverbindung direkt oder nach Kopplung mit einem geeigneten Chromogen die daraus gebildete Farbe optisch bestimmt.
Ein besonderes Merkmal dieses Verfahrens besteht darin, daß es keine Hilfsenzyme oder Esterasehemmstoffe erfordert, wie sie bei den bekannten Methoden vielfach benötigt werden. Derartige Zusätze sind nicht nur teuer, sondern vielfach auch wenig stabil. Ein besonderer Vorzug der Erfindung liegt daher darin, daß sie auch ein einfaches und gut haltbares Reagenz zur optischen Bestimmung der Lipase möglich macht, welches neben einem erfindungsgemäßen Lipasesubstrat und Puffersubstanz auch ein oberflächenaktives Mittel, wie insbesondere Gallensäuresalz, Colipase, einen chromogenen Kuppler oder/und ein Salz wie Natriumchlorid enthält. Außerdem kann das Reagenz zweckmäßig auch Harnstoff, Konservierungsmittel oder/und Aktivator enthalten. In einer bevorzugten Zusammensetzung enthält dieses Reagenz
0,05 bis 10mg/ml Substrat,
2 bis 50 mg/ml Desoxycholat,
0,001 bis 0>01 mg/ml Colipase,
1 bis 100mg/ml Harnstoff,
0,1 bis10mg/ml NaCI,
1 bis 50mg/ml Puffersubstanz,
jeweils bezogen auf gebrauchsfertige Lösung im Test.
Als Gallensäure kommen die bekannten oberflächenaktiven Gallensäuren, wie Cholsäure, Taurocholsäure, Desoxycholsäure, Taurodesoxycholsäure, Glycodesoxycholsäure bzw. deren Alkalisalze, insbesondere das Natriumsalz, in Betracht. Die bevorzugte Menge beträgt 2 bis 50 mg/ml.
Ein weiterer wesentlicher Bestandteil des erfindungsgemäßen Reagenz ist Colipase. Besonders geeignet ist eine von Verunreinigungen freie Colipase. Die bevorzugte Menge beträgt 0,001 bis 0,01 mg/ml.
Das erfindungsgemäße Reagenz kann ferner Harnstoff, bevorzugt 1 bis 100mg/ml, enthalten.
Als Puffersubstanz eignen sich alle bekannten Puffer, welche in der Lage sind, im Rahmen des erfindungsgemäßen Reagenz einen pH-Wert zwischen 6,0 und 10,5 einzustellen. Der bevorzugte pH-Wertbereich liegt zwischen 7,0 und 9,5. Beispiele für geeignete Puffer sind Diethanolaminpuffer, Triethanolaminpuffer, Tris-Puffer und Goodpuffer, wie Hepes-Puffer (gut geeignet zum Zusatz vor der Lyophilisation), Taps-Puffer, CHES-Puffer (2-(Cyclohexylamino)-ethansulfonsäure) und Bicine. Besonders bevorzugt wird Tris-Puffer. Die bevorzugte Puffersubstanzmenge liegt zwischen 1 und 50 mg/ml.
Als Salze sind Alkali-, Erdalkali- und Ammoniumsalze geeignet und werden bevorzugt in Konzentrationen von 0,1 bis 10mg/ml eingesetzt.
Als Konservierungsmittel werden im Rahmen der Erfindung solche eingesetzt, die die enzymatische Aktivität der zu bestimmenden Lipase nicht beeinträchtigen. Besonders geeignet sind Alkaliazide, insbesondere Natriumazid. Auch andere Konservierungsmittel, wie z. B-. Thiozid und andere schwefelhaltige Konservierungsmittel sind jedoch ebenfalls geeignet. Die bevorzugte Menge an Konservierungsmittel beträgt 0,001 bis 2mg/ml.
Als Aktivatoren sind Erdalkaliionen, bevorzugt Calciumionen, geeignet. Da diese mit Desoxycholsäure unlösliche Verbindungen eingehen, wird bei Gegenwart von Calcium als Gallensäure Taurodesoxycholsäure bevorzugt, da diese höhere Calciumkonzentrationen im Bereich von 1 bis 5mMol zuläßt.
Wird das erfindungsgemäße Reagenz in trockener oder konzentrierter, zur Verdünnung auf die endgültige Zusammensetzung bestimmter Form eingesetzt, so enthält es die genannten Substanzen in entsprechenden Mengenverhältnissen, sowie vorzugsweise Schutzkolloid.
Als Schutzkolloid kommen die dem Chemiker hierfür bekannten Substanzen in Betracht, wie Polyhydroxyverbindungen, Serumalbumin, Polyvinylpyrrolidon, feste Polyethylenoxide und dergleichen. Bevorzugt werden Polyhydroxyverbindungen, insbesondere monomere oder polymere Pentose oder Hexose mit 1 bis 10 Pentose- bzw. Hexose-Einheiten im Molekül oder/und bei Zimmertemperatur fester Polyethylenglykol. Bevorzugte Beispiele von geeigneten Polyhydroxyverbindungen sind Mannit und ähnliche Zuckeralkohole, Oligosaccharid der Glucose, Mannose, Maltoheptaose, Polyethylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht zwischen 3500 und 7000 u.a. Andere verwendbare Schutzkolloide sind z. B. Aminosäuren, wie Alanin, Pflanzengummis, wie Gummi arabicum usw. Die bevorzugte Menge an Schutzkolloid bzw. einer Mischung von Schutzkolloiden beträgt 20 bis 90Gew.-%. Als besonders geeignet erwies sich eine Mischung von Zuckeralkohol und Polyalkylenglykol.
Das erfindungsgemäße Reagenz kann auch auf einem geeigneten Trägermaterial imprägniert vorliegen. In Betracht kommen sowohl ein saugfähiges Trägermaterial, als auch ein quellfähiges, lösliches filmbildendes Trägermaterial. In dieser Form ermöglicht das erfindungsgemäße Reagenz die Herstellung von Teststreifen, welche direkt visuell oder mittels geeigneter Meßgeräte ausgewertet werden können.
Der erfindungsgemäße Farbtest zur Bestimmung der Lipase liefert sehr genaue Ergebnisse bei hoher Empfindlichkeit. Er ist sehr einfach in der Handhabung und eignet sich sogarfür Teststreifen. Da er nur eine sehr geringe oder gar keine lag-Phase aufweist, kann er auf die verschiedenen Analysenautomatensysteme ohne weiteres adaptiert werden.
Die Bestimmung selbst kann sowohl als Endpunktbestimmung als auch kinetisch durchgeführt werden. Gegenüber vielen bekannten Verfahren liegt in der kinetischen Durchführbarkeit der Vorteil, daß weder ein Abstoppen, noch ein Ausschütteln des gebildeten Reaktionsproduktes durchgeführt werden muß.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
a) i^-O-Dihexyl-rac-glycero-S-glutarsäure-monoester
Zu einer Lösung von 3,3g (11,5mM) 1,2-0-Dihexylglycerin in 30 ml Chloroform werden nacheinander 2,5ml Pyridin, eine Spatelspitze 4-Dimethylaminopyridin und 2,6g (23 mM) Glutarsäureanhydrid zugeführt. Das Gemisch wird 10 Stunden unter Rückfluß erhitzt und nach dem Abkühlen mit 200 ml Chloroform verdünnt. Die Chloroformphase wird mit 1 N Salzsäure geschüttelt und getrocknet. Nach Abfiitrieren des Trockenmittels wird das Lösungsmittel abgezogen und der Rückstand über eine Kieselgelsäule (Eluens:Essigester/Petrolether 1:1) gereinigt
DC: Rf: 0,45 (Essigester/Petrolether 1:2+1 % Eisessig) i^-O-Dihexyl-rac-glycero-S-glutarsäure-resorufinester:
b) 1,4g (3,7mM) werden in 20ml Chloroform gelöst und unter Eiskühlung mit 2ml (23,3mM) Oxalylchlorid zugetropft. Das Eisbad wird entfernt und die Lösung 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel abgezogen, der Rückstand in Toluol aufgenommen und wieder eingedampft. Das so erhaltene Öl wird ohne weitere Reinigung eingesetzt.
c) 0,8g (3,7 mM) Resorufin werden in 40 ml Dimethylformamid unter Zusatz von .1,1 ml Pyridin und einer Spatelspitze 4-Dimethylaminopyridin aufgeschlämmt. Hierzu wird eine Lösung von 1 b) in 20 ml Dimethylformamid getropft. Nach ein- bis zweitägigem Rühren bei Raumtemperatur filtriert und das Lösungsmittel abgezogen. Der Rückstand wird im Essigester aufgenommmen, unlösliche Bestandteile abfiltriert und das Filtrat mit 1 N Salzsäure, dann mit Wasser geschüttelt. Nach dem Trocknen der organischen Phase und Abdestillieren des Lösungsmittels erhält man einen öligen Rückstand, der über Säulenchromatographie an Kieselgel gereinigt wird (Eluens:Essigester/Petrolether 1:1).
DC: Rf: 0,70 (Essigester/Hexan 1:1).
a) i^-O-Dioctyl-rac-glycero-S-glutarsäure-monoester
Herstellung analog Beispiel 1 a) aus 13g (41 mM) 1,2-0-Dioctyl-glycerin, 150ml Chloroform, 10ml Pyridin und 6,8g (59,5mM) Glutarsäureanhydrid. Ausbeute: 6,5g (37%) DC: Rf: 0,31 (Essigester/Petrolether 1:1)
i^-O-Dioctyl-rac-glycero-S-glutarsäure-resorufinester:
b) Herstellung analog Beispiel 1 b) aus 2g (4,5mM) 2a)
c) 0,96g (4,5mM) Resorufin werden in 50ml Chloroform unter Zusatz von 0,75ml (5mM) 1,8-Diazabicyclo-(5,4,0)-undec-7-en und 0,1 g 4-Dimethylaminopyridin gelöst. Hierzu wird eine Lösung von 2b) in 20ml Chloroform getropft. Nach ein- bis zweitägigem Rühren bei Raumtemperatur wird filtriert und das Lösungsmittel abgezogen. Aufarbeitung analog Beispiel 1c).
DC: Rf: 0,66 (Essigester/Hexan 1:1).
a) i^-O-Dioctyl-rac-glycero-S-pimelinsäure-monoester
Herstellung analog Beispiel 1 a) aus 3,2g (1OmM) 1,2-0-Dioctyl-glycerin und 2,1 g (15mM) Pimelinsäureanhydrid, DC: Rf: 0,61 (Essigester/Petrolether 1:1) IR (cm"1): (Film): 1 740,1 710 i^-O-Dioctyl-rac-glycero-S-pimelinsäure-resorufinester:
b) Herstellung analog Beispiel 1 b) aus 2,2g (4,7mM) 3a)
c) Herstellung analog Beispiel 2c) aus 1 g (4,7mM) Resorufin, 0,7 rhi 1,8-Diazabicyclo-(5,4,0)-undec-7-en und 3b). DC: Rf = 0,78 (Essigester/Hexan 1:2)
Beispiel 4
a) i^-O-Dioctyl-rac-glycero-S-azelainsäure-monoester
Herstellung analog Beispiel 1 a) aus 6,3g (2OmM) 1,2-0-Dioctyl-glycerin, 80ml Chloroform, 5miPyridin und 5,2g (3OmM) Azelainsäureanhydrid. i^-O-Dioctyl-rac-glycero-S-azelainsäure-resorufinester:
b) Herstellung analog Beispiel 1 b) aus 3,2g (6,5mM) 4a) und 3ml Oxalylchlorid.
c) Herstellung analog Beispiel 2c) aus 1,4g (6,5rtiM) Resorufin, 65ml Chloroform 1,1 ml 1,8-Diazabicyclo-(5,4,0)-undec-7-en und 4b).
DC: Rf = 0,86 (Essigester/Hexan 1:2) IR (cm"1): (Film) 1762,1736
a) i^-O-Didecyl-rac-glycero-S-glutarsäure-monoester
Herstellung analog Beispiel 1 a) aus 3,7g (1OmM) 1,2-0-Didecyl-glycerin,40ml Chloroform, 2,5ml Pyridinund 1,8g (15,8mM) Glutarsäureanhydrid.
DC: Rf: 0,77 (Essigester/Hexan 1:2).
i^-O-Didecyl-rac-glycero-S-glutarsäure-resorufinester:
b) Herstellung analog Beispiel 1 b) aus 2,5g (5mM) 5a) 50ml Chloroform und 2,2ml Oxalylchlorid.
c) Herstellung analog Beispiel 2c) aus 1,1 g (5mM) Resorufin, 1 ml 1,8-Diazabicyclo-(5,4,0)-undec-7-en und 5b). DC: Rf = 0,70 (Essigester/Hexan 1:1)
a) i^-O-Diundecyl-rac-glycero-S-glutarsäure-monoester
Herstellung analog Beispiel 1 a) aus 2g (5mM) 1,2-0-Diundecyl-glycerin, 25ml Chloroform, 1,4ml Pyridin und 0,9ml (7,5mM) Glutarsäureanhydrid.
DC: Rf: 0,55 (Essigester/Petrolether 1:2)
IR (cm"1): (Film) 1740,1710 '
i^-O-Diundecyl-rac-glycero-S-glutarsäure-resorufinester:
b) Herstellung analog Beispiel! b) aus 2g (3,9mM) 6a), 5ml Chloroform und 1,8ml Oxalylchlorid.
c) Herstellung analog Beispiel 2c) aus 0,83g (3,9mM) Resorufin, 0,61 ml 1,8-Diazabicyclo-(5,4,0)-undec-7-en und 6b). DC: Rf = 0,47 (RP 18, Ethanol/Aceton 2:1) _
a) i^-O-Dilauryl-rac-glycero-S-glutarsäure-monoester
Herstellung analog Beispiel 1 a) aus 10,7g (25mM) 1,2-0-Dilauryl-glycerin, 70ml Chloroform, 5,5ml Pyridin und 3,3g (29mM) Glutarsäureanhydrid.
DC: Rf: 0,33 (Essigester/Petrolether 1:1).
IR(Cm-1Ji(FiIm): 1741,1708
1 ^-O-Dilauryl-rac-glycero-S-glutarsäure-resorufinester
b) Herstellung analog Beispiel 1 b) aus 5,5g (1OmM) 7a), 50ml Chloroform und 4,3ml Oxalylchlorid.
c) Herstellung analog Beispiel 2c) aus 2,2g (1OmM) Resorufin, 100ml Chloroform und 1,5ml 1,8-Diazabicyclo-(5,4,0)-undec-7-en und7b).
DC: Rf = 0,78 (Essigester/Petrolether 1:1) IR (cm~1): (Film) 1765, 1720
a) i^-O-Dilauryl-rac-glycero-S-pimelinsäure-monoester
' Herstellung analog Beispiel 1 a) aus 8,6g (2OmM) 1,2-0-Dilauryl-glycerin, 50ml Chloroform, 15ml Pyridin und 4,3g (3OmM) Pimelinsäureanhydrid
DC: Rf: 0,5 (Essigester/Petrolether 1:2)
IR (cm"1): (Film): 1740,1710 i^-O-Dilauryl-rac-glycero-S-pimelinsäure-resorufinester:
b) Herstellung analog Beispiel 1 b) aus 1,66g (3mM) 8a) und 1,3ml Oxalylchlorid.
c) Herstellung analog Beispiel 2c) aus 0,65g (3mM) Resorufin, 30ml Chloroform 0,5ml 1,8-Diazabicyclo-(5,4,0)-undec-7-en und 8b).
DC: Rf = 0,75 (Essigester/Hexan 1:1) IR (cm"1): (Film): 1786,1739
- e —
a) i^-O-Ditetradecyl-rac-glycero-S-glutarsäure-monoester
Herstellung analog Beispiel 1 a) aus 14,6g (3OmM) i^-O-Ditetradecyl-glycerin, 150ml Chloroform, 8,2ml Pyridin und 5,1 g (45mM) Glutarsäureanhydrid.
DC: Rf: 0,42 (Essigester/Petrolether 1:2)
IR (cm"1): (KBr) 1740,1710 . .
i^-O-Ditetradecyl-rac-glycero-S-glutarsäure-resorufinester:
b) Herstellung analog Beispiel 1 b) aus 3g (5mM) 9a) und 2,2 ml Oxalylchlorid.
c) Herstellung analog Beispiel 2c) aus 1,06g (5mM) Resorufin, 50ml Chloroform, 0,75ml !,S-Diazabicyclo-föAOl-undec^-en und 9b).
DC: Rf = 0,34(RP18, Acetonitril/Dichlormethan 1:1) IR (cm"1): (KBr): 1763,1735
a) i^-O-Ditetradecyl-rac-glycero-S-pimelinsäuremonoester Herstellung analog Beispiel 9a) aus 6,4g (45mM) Pimelinsäureanhydrid DC: Rf:0,45 {Essigester/Petrolether 1:2) IR (cm"1): (Film) 1740,1708 i^-O-Ditetradecyl-rac-glycero-S-pimelinsäureresorufinester
b) Herstellung analog Beispiel 1 b) aus 3,1 g (5mM) 10a) und 2,2ml Oxalylchlorid.
c) Herstellung analog Beispiel 2c) aus 1,06g (5mM) Resorufin, 50ml Chloroform und 0,78ml 1,8-Diazabicyclo-(5,4,0)-undec-7-en und 10b).
DC: Rf = 0,71 (Essigester/Petrolether 1:2) f
IR(cm"1MFilm):1755, 1734
a) i^-O-Dihexadecyl-sn-glycero-S-glutarsäure-monoester
Herstellung analog Beispiel 1 a) aus 2,7g (5mM) i^-O-Dihexadecyl-sn-glycerin, 50ml Chloroform, 3ml Pyridin und 1,5g (13 mM) Glutarsäureanhydrid. DC: Rf: 0,65 (Essigester/Petrolether 1:1) •|R (cm"1): (KBr) 1740,1710 i^-O-Dihexadecyl-sn-glycero-S-glutarsäure-resorufinester:
b) Herstellung analog Beispiel 1 b) aus 2,2g (3,3mM) 11a) und 1 ml Oxalylchlorid.
c) Herstellung analog Beispiel 1c) aus 0,71 g (3,3mM) Resorufin, 20ml Dimethylformamid 0,5m Pyridin und 11 b). DC: Rf = 0,72 (Essigester/Petrolether 1:2).
a) i^-O-Dibenzyl-rac-glycero-S-glutrsäure-monoester
Herstellung analog Beispiel 1 a) aus3g (11 mM) 1,2-0-Dibenzyl-glycerin,30ml (Chloroform,2,5ml Pyridin und 1,8g (16mM) Glutarsäureanhydrid.
- DC: Rf: 0,39 (Essigester/Petrolether 1:1 +1 % Eisessig) i^-O-Dibenzyl-rac-glycero-S-glutarsäure-resorufinester:
b) Herstellung analog Beispiel 1 b) aus 2,9g (7,5mM) 12a), 30ml Chloroform und 3,3ml Oxalylchlorid.
c) Herstellung analog Beispiel 2c) aus 1,6g (7,5mM) Resorufin, 75ml Choroform, 1,2ml 1,8-Diazabicyclo-(5,4,0)-undec-7-en und 12b).
DC: Rf = 0,48 (Essigester/Hexan 1:1)
a) 1-0-Octadecyl-2-0-benzyl-sn-glycero-3-glutarsäuremonoester
Herstellung analog Beispiel 1a) aus 2,2 g (5mMol) i-O-Octadecyl-2-O-benzyl-sn-glycerin, 50 ml Chloroform, 3ml Pyridin und 1,5g (13mM) Glutarsäureanhydrid. IR (CiTT1MFiIm) 1730,1700 i-O-Octadecyl^-O-benzyl-sn-glycero-S-glutarsäureresorufinester:
b) Herstellung analog Beispiel 1 b) aus 1,7g (3,1 mM) 13a) und 1,3ml Oxalylchlorid.
c) Herstellung analog Beispiel 1 c) aus 0,8g (37mM) Resorufin, 20ml Dimethylformamid, 0,7ml Pyridin und 13b). DC: Rf= 0,68 (Essigester/Petrolether 1:1) IR (cm"1)-(KBr): 1768,1739
a) i^-Dioctanoyl-sn-glycero-S-glutarsäure-monoester
Herstellung analog Beispiel 1 a) aus 6,8g (2OmM) i^-Dioctanoyl-sn-glycerin, 100ml Chloroform, 12,5ml Pyridin und 5,8g (5OmM) Glutarsäureanhydrid.
DC: Rf: 0,49 (Essigester/Petrolether 1:1).
i^-Dioctanoyl-sn-glycero-S-glutarsäure-resorufinester
b) Herstellung analog Beispiel 1 b) aus 2,2g (5mM) 14a) und 2,2ml Oxalylchlorid
c) Herstellung analog Beispiel 1 c) aus 1,05g (5mM) Resorufin, 30ml Dimethylformamid, 0,75ml Pyridin und 14b). DC: Rf = 0,86 (RP 18, Acetonitril/Dichlormethan Ϊ72Τ
a) i^.-Dioleyl-rac-glycero-S-glutarsäure-monoester
Herstellung analog Beispiel 1 a) aus 3,1 g (5 m Mol) Diolein, 40 ml Chloroform, 3 ml Pyridin und1,5g(13mM) Glutarsäureanhydrid.
DC: Rf: 0,32 (Essigester/Petrolether 1:1)
IR (cm"1): (Film): 1740,1706
Diolein läßt sich aus technischen Diolein durch Säulenchromatographie an Kieselgel unter Verwendung von Essigester/ Petrolether 1:3 als Laufmittel in reiner Form herstellen.
i^.-Dioleyl-rac-glycero-S-glutarsäure-resorufinester:,
b) Hersteilung analog BeispieM b) aus 3,5g (4,8mM) 15a) und 1,3ml Oxalylchlorid.
c) Herstellung analog Beispiel 1 c) aus 0,9g (4,2mM) Resorufin, 20ml Dimethylformamid, 1 ml Pyridin udn 15b). DC: Rf = 0,78 (Essigester/Petrolether 1:1)
i^-O-Ditetradecyl-rac-glycero-pimelinsäure-naphthylester
Die Herstellung erfolgt analog Beispiel 10 b) und c) aus 0,72 g (5mM) 1-Naphthol. Auf reinigung über Flash-Chromatographie an Kieselgel mit dem Laufmittel Essigester/Hexan 1:3
DC: Rf = 0,89 (Essigester/Petrolether 1:5)
i^.-Dioleyl-rac-glycero-S-glutarsäure-resorufinester
10,3g (14,2mM) i^-Dioleyi-S-glyceroglutarsäuremonoesternach Beispiel 15a), 3,2g (15mM) Resorufin, 6,2g (3OmM) Dicyclohexylcarbodiimid und eine Spatelspitze 4-Dimethylaminopyridin rührt man in 75ml Dimethylformamid 2 bis 3 Tage bei Raumtemperatur. Dann wird mit Essigester verdünnt und der Niederschlag abfiltriert. Die Essigesterphase wird mit 1 N Salzsäure ausgeschüttelt und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels läßt ein öliger Rückstand, der über Kieselgel-Säulenchromatographie (Laufmittel: Essigester/Petrolether 1:1) gereinigt wird. Ebenso wurde das entsprechende Chlorphenolrot-Derivat hergestellt
DC; Rf = 0,69 (RP18; Isopropanol/Methanol 1:2).
Herstellung von 1,2-0-Dioctyl-3-pimelinsäure-monoester
1. Stufe Lit: J. H.Short, U. Biermacher Chim.Ther. 1966,456 Synthese von Pimelinsäuremonobenzylester
2. Stufe: Analog Beispiel 1 b) aus 2,5 g (10 mM) Pimelinsäuremonobenzylester. Das erhaltene Öl wird zu einer Lösung von 3,2 g
(1OmM) 1,2-0-Dioctylglycerin,7ml Pyridin getropft. Aufarbeitung analog Beispiel 1 c).
3. Stufe: Obiges Produkt wurde in 20 ml Tetrahydrofuran gelöst und nach Zusatz von 0,4 g PalladiumZ-Aktivkohlehydiert. Das
Rohprodukt wird übereine Kieselgel-Säule gereinigt
Laufmittel: Essigester/Petrolether 1:1
DC: Rf =0,61 (Essigester/Petrolether 1:1 .' IR (cm"1): (Film): 1740,1.710.
Synthese des 1 ^.-Dioleyl-glycero-S-glutarsäuremonoesters
a) i^-O-lsopropyliden-glycero-S-glutarsäure-trichlorethylester
Stufe 1: 5,55 g (42 mM) Isopropylidenglycol und 12 g (45,3 mM) 2,2,2-Trichlorethyl-hydrogen-glutarat werden in Ethylenglycoldimethylether gelöst und mit 10,5g (51 mM) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach zweitägigem Rühren wird filtriert und destilliert.
Sdp:170°C(0,1Torr)farbl.ÖI
DC: Rf =0,82
(Aceton/Chloroform 1:8) Stufe 2: Das erhaltene Öl wird in 11 ml Ether gelöst, mit 3 ml Methanol und 3 ml 3 N Salzsäure versetzt und 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die organische Phase wird mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung, dann mit gesättigter Natriumchloridlösung geschüttelt und getrocknet. Nach Abziehen des Lösungsmittels bleibt ein öliger Rückstand.
DC: Rf = 0,23 (Essigester/Petrolether 1:1)
b) i^-Dioleyl-glycero-S-glutarsäuretrichlorethylester
Stufe 3: 6,1 g (18 mM) des oben erhaltenen Produktes und 7,84 g (38 mM) Ölsäure wreden in 100 ml Ethylenglycoldimethylether gelöst und eine Lösung von 10,5 g (37 mM) Dicyclohexylcarbodiimid in 50 ml Ethylenglycoldimethyletherzugetropft. Nach 12stündigem Rühren bei Raumtemperaturwird filtriert und nacheinander mit 3 N Salzzsäure, mit Natriumhydrogencarbonatlösung, dann mit Wasser ausgeschüttelt. Nach Trocknen und Einengen der organischen Phase wird der Rückstand an Kieselgel chromatographiert.
Stufe 4 i^-Dioleyl-glycero-S-glutarsäure-monoester
Abspaltung derTrichlorethyl-Schutzgruppe nach Literaturvorschrift: Juste, Synthesis 1976,457.
Beispiel 20 '
a) i^-O-Didecyl-rac-glycero-S-pimelinsäure-monoester
Herstellung analog Beispiel 1a) aus 5,6g (15mM) 1,2-0-Didecyl-glycenn, 100ml Chloroform, 3,2ml Pyridin und 4,0g (28mM) Pimelinsäureanhydrid.
DC: Rf = 0,36 (Essigester/Hexab 1:1)
IR (cm""1): (Film) 1735,1710
i^-O-Didecyl-rac-glycero-S-pimelsäure-resorufinester
b) Herstellung analog Beispiel 1 b) aus 3g (5,8mM) 20a, 50ml Chloroform und 2,2ml Oxalylchlorid
c) Herstellung analog Beispiel 2c) aus 1,1 g (5mM) Resorufin, 1 m (6,4mM) !,SDiazabicyclo-föAOJ-undec^-en und 20b. DC: Rf = 0,71 (Essigester/Hexan 1:1)
IR (cm"1): (Film) 1755,1720
a) i^-O-Dilauryl-rac-glycero-S-azelainsäure-monoester
Herstellung analog Beispiel 1 a) aus 6,7 g (15,6 mM) 1,2-0-Dilaurylglycerin, 100 ml Chloroform, 3,2 ml Pyridin und 4,0 g (23 mM) Azelainsäureanhydrid.
DC: Rf = 0,22 (Essigester/Hexan 1:1)
IR(Cm-1J=(FiIm): 1738,1710
i^-O-Dilauryl-rac-glycero-S-azelainsäure-resorufinester
b) Herstellung analog Beispiel 1 b) aus 1,5g (2,5mM) 21 a, 30ml Chloroform und 1,5ml Oxalylchlorid
c) Herstellung analog Beispiel 2c) aus 0,55g (2,5mM) Resorufin, 25ml Chloroform, 0,5ml (3,2mM) 1,8-Diazabicyclo-(5,4,0)-undec-7-en und 21 b
DC: Rf = 0,78 (Essigester/Hexan 1:1) IR (cm"'): (Film): 1762,1740
In 60 ml destilliertem Wasser werden unter Rühren 1,2 g Natrium-Desoxycholat udn 0,15 mg Colipase (vom Schwein) gelöst.
Unter heftigem Rühren wird hierin eine Lösung von 70mg Lipasesubstrat i^-O-Dioctyl-rac-glycero-S-azelainsäure-resorufinester (Beispiel 4) in 1,7ml n-Propanol unter Druck in einem möglichst dünnen Strahl eingespritzt. Eine Lösung, die in 200ml destilliertem Wasser 1,5g Harnstoff, 1 g Natrium-Desoxy-Cholat, 200mg Natriumchlorid, 800mg TRIS und 107mg TRIS · HCI gelöst enthält, wird mit der oben hergestellten Emulsion gut gemischt.
2,5ml der so hergestellten Lösung werden mit 100μ,Ι Probe (Serum) versetzt. Die Reaktion wird bei 578nm Hg photometrisch verfolgt.
Bei Auswertung über einen Standard bekannter Lipaseaktivitätwird die Lipaseaktivität der Probe wie folgt berechnet:
Aktivität ,„, , ,.
Aktivität Ιτ> . . (Standard)
(Probe) :—
Δ E/min (Standard)
Eine Berechnung der Lipaseaktivität der Probe ist auch nach folgender Formel möglich:
Aktivität (Probe) ß]/'ij = 1000 . Vges
Probe . d
Vges: Gesamtvolumen des Testansatzes [cm3]
Vprobe^ Volumen der Probe [cm3]
ε: Extinktionskoeffizient des Chromogens bei 578 nm
d: Schichtdicke der Küvette [cm]
ΔΕ/min: Extinktionsänderung pro Minute bei 578 nm
Bei den genannten Reaktionsbedingungen beträgt der Extinktionskoeffizient ε = 60,65cm · μηιοΓ1.
Für verschiedene Lipasesubstrate wurden Leerwertänderung, Esteraseempfindlichkeit, Lipaseempfindlichkeit und Korrelation zu einem turbidimetrischen Trübungstest bestimmt.
Die Leerwertänderung wurde ermittelt mit einem Reagenz gemäß Beispiel 1 und verschiedenen Lipasesubstraten. Anstelle der Probe wurden 100μΙ Wasser zugegeben und die Extinktionsänderung bei 578 nm photometrisch verfolgt (mE/min).
Zur Ermittlung der Esteraseempfindlichkeit wurde anstelle der Probe 100/xl Carboxylesterase (EC 3.1.1.1, ca. 20000 U/l Boehringer Mannheim GmbH, Best.-Nr. 104698) zugegeben und die Extinktionsänderung wie oben beschrieben verfolgt.
Zur Ermittlung der Lipaseempfindlichkeit wurde anstelle der Probe 100μΙ Lipase (EC 3.1.1.3, ca. 100 U/l, Boehringer Mannheim GmbH, Best.-Nr.414590) zugegeben und die Extinktionsänderung wie oben beschrieben verfolgt.
Zur Ermittlung der Korrelation zu einem turbidimetrischen Trübungstest wurde mit steigenden Lipasemengen (0-1 000 U/l) ein Trübungstest (Boehringer Mannheim GmbH, Best.-Nr. 262358) durchgeführt mit einem Farbtest gemäß Beispiel 22 verglichen udn der Korrelationskoeffizient ermittelt.
Die Ergebnisse zeigt Tabelle I:
| Beispiel | Leerwert | Esteraseempfind | Lipaseempfind- | Korrelations |
| lichkeit | lichkeit | koeffizient | ||
| [AmE/min] | (Aktivität 20 000 U/I) | (Aktivität 100 U/l) | ||
| [AmE/min] | [AmE/min] | |||
| 1 | 13,2 | >1000 | — | — |
| 2 | 7,0 | 144,0 | -100 | nicht ermittelt |
| 3 | 3,9-4,1 | 112,5 | 12,28 | 0,9639 |
| 4 | 0,4-0,8 | 33,6 | 18,04 | 0,9421 |
| 5 | 2,4-3,0 | 30,2 | 22,18 | 0,9815 |
| 6 | 2,0-2,8 | 23,6 | 6,96 | 0,9179 |
| 7 | 2,4-3,0 | 34,8 | 10,9 | 0,9636 |
| 8 | 2,1-2,4 | 27,8 | 4,68 | 0,9286 |
| 11 | 0,1 | 1,8 | 0,97 | 0,9830 |
| 20 | 1,3-2,0 | 48,7 | 9,8 | 0,9888 |
| 21 | 9,8-11,9 | 9,5 | 13,2 | 0,9716 |
8,5g Natriumdesoxycholat, 0,05g Colipase, 20g Mannit, 0,05g Calciumchlorid, 0,82g Natriumchlorid, 2,7g TRIS und 0,4g TRIS · HCI werden in 200 ml destilliertem Wasser gelöst. Unter Rühren wird eine Lösung, die 0,35g 1,2-o-Ditetradecyl-racglycero-3-pimelinsäure-naphtholester in 7 ml Propanol gelöst enthält, eingespritzt. Die so erhaltene Emulsion wird bei -400C eingefroren und lyophilisiert.
70 mg des erhaltenen Lyophilisates werden in2ml destilliertem Wasser gelöst und mit 100μ.Ι einer Echtrot TR-Lösung (Echtrot = 4-Chlor-3-methyl-benzoldiazonium Naphthalin1,5-disulfonat) (231 mg in 10ml destilliertem Wasser) versetzt. Nach Zugabe von 100/xl Probe (Serum) wird die Reaktion bei 405 nm photometrisch verfolgt. Die Ermittlung der Lipasekonzentration erfolgt über eine Eichkurve analog zu Beispiel 22.
In eine Lösung von 3,04g Taurodesoxycholat, 2,7g Polywachs 4000,7 mg Calciumchlorid, 0,2 mg Colipase (vom Schwein) in 120 ml dest. Wasser werden unter Rühren 150 mg Lipasesubstrat i^-O-Didecyl-rac-glycero-S-glutarsäure-resomfinesterinSjörnl n-Propanol eingespritzt.
Zu der so erhaltenen Emulsion wurde die folgende Lösung zugegeben und gut gemischt:
10g Taurodesoxycholat, 6,4g Polywachs, 50g Mannit, 14g Harnstoff, 800mg Natriumchlorid und 15g Tris werden in 300ml dest.
Wasser gelöst. Mit einer Salzsäurelösung wird der pH-Wert auf pH = 7,5 eingestellt. Danach wird die Lösung auf 400 ml mit dest.
Wasser aufgefüllt.
2,5 ml des so hergestellten Reaktionsgemisches werden mit 100μ,Ι Probe (Serum) versetzt. Die Reaktion wird bei 578 nm photometrisch verfolgt.
Die Auswertung wird wie im Beispiel 22 vorgenommen.
In eine Lösung von 3,04g Taurodesoxycholat, 2,7g Polywachs 4000,7 mg Calciumchlorid, 0,2mg Colipase (vom Schwein) in 120 ml dest. Wasser werden unter Rühren 150 mg Lipasesubstrati^-O-Didecyl-rac-glycero-S-glutarsäure-resofurinester in 3,5 ml n-Propanol eingespritzt.
Zu der so erhaltenen Emulsion wurde die folgende Lösung zugegeben und gut gemischt:
10g Taurodesoxycholat, 6,4g Polywachs, 50g Mannit, 14g Harnstoff, 800mg Natriumchlorid, 28g CHES werden in 300ml dest.
Wasser gelöst. Mit einer Salzsäurelösung wird der pH-Wert auf pH = 8,5 eingestellt. Danach wird die Lösung auf 400 ml mit dest.
Wasser aufgefüllt.
2,5 ml des so hergestellten Reaktionsgemisches werden mit 100μ,Ι (Serum) versetzt. Die Reaktion wird bei 578nm photometrisch verfolgt.
Die Auswertung wird wie im Beispiel 22 angegeben, vorgenommen.
In eine Lösung aus 4,0g Na-Taurodesoxycholat, 0,06g Calciumchlorid, 0,2mg Colipase (vom Schwein), 5,0g Mannit und 2,0g Polywachs 4000 in 100ml dest. Wasser wird unter Rühren 150 ml i^-o-Ditetradecyl-rac-glycero-S-pimelinsäure-naphtholester, der in 4ml n-Propanol gelöst ist, eingespritzt. Unter guter Kühlung wird die so erhaltene Emulsion einige Minuten mit Ultraschall -behandelt. - _
Eine zweite Lösung enthält in 100ml 2,4g Na-Taurodesoxycholat, 2,OgTRIS, 12,0g Mannit, 3,5g Harnstoff und 0,5g Natriumchlorid. Mit Salzsäure wird der pH-Wert dieser Lösung auf pH = 8,3 eingestellt.
Eine dritte Lösung enthält Tg Echtrot TR (Echtrot TR = 4-Chlor-3-methyl-benzol-diazonium-naphthalin-1,5-disulfonat) in 40 ml dest. Wasser gelöst.
5 Teile der Lösung 1 und 6 Teile der Lösung 2 werden mit einem Teil der Lösung 3 gemischt. Mit der so erhaltenen Lösung wird ein zur Teststreifenherstellung geeignetes saugfähiges Papier, z. B. die Sorte VS 532 der Firma Schleicher und Schüll getränkt und in einem Umlufttrockenschrank bei einer Temperatur von 30 bis 650C schonend getrocknet. Bis zur weiteren Verwendung empfiehlt sich eine Aufbewahrung in Gegenwart eines feuchtigkeitsentziehenden Mittels.
Zur Prüfung auf Lipase der Probe (Serum) wird eine kleine Menge (einige Tropfen) des Probenmaterials auf den Streifen gegeben. Aus dem zeitlichen Verlauf der Gelbfärbung kann auf die Lipaseaktivität der zu untersuchenden Probe geschlossen werden.
a) i^-O-Dilauryl-rac-glycero-S-tetradecandisäuremonoester:
Herstellung analog Beispiel 1 a) aus 8,6g (2OmM) 1,2-0-Dilaurylglycerin, 100ml Chloroform,4ml Pyridin, 0,4g Dimethylaminopyridin, 9,6g (4OmM) Tetradecandisäureanhydrid
DC: R1 = 0,45 (Essigester/Petrolether 1:5) i^-O-Dilauryl-rac-glycero-S-tetradecandisäurefe-methylresorufin-Jester:
b) Herstellung analog Beispiel 1 b) aus 3,35g (5mM) 28a) und 2,2ml Oxalylchlorid
c) Herstellung analog Beispiel 2c) aus 1,2g (5 mM)4-Methylresorufin, 20ml Chloroform, 0,75ml !,S-Diaxabicyclo-föAOl-undec-7-en, 0,1 g Dimethylaminopyridin und 28b).
DC: R, = 0,63 (Essigester/Hexan 1:4)
d) Wie in Beispiel 22 angegeben wird eine Emulsion hergestellt. Jedoch wird anstelle des dort genannten Lipasesubstrats eine Lösung von 70mg Lipasesubstrat i^-O-Dilauryl-rac-glycero-S-tetradecandisäure-fe-methylresorufinJ-ester in 1,7ml n-Propanol gelöst eingesetzt.
Dabei wurden die folgenden testspezifischen Kenngrößen erhalten (vgl. Beispiel 23 und Tabelle I): Leerwert: 0,2mE/min Esteraseaktivität: 0,7 mE/min Lipaseempfindlichkeit: 23,6mE/min pro 100U/l Korrelationskoeffizient: 0,09509
i^-O-Dilauryl-rac-glycero-S-glutarsäure-te-methyl-resorufinJester: ·
a) Herstellung analog den Beispielen 7a-c mit 2,3g (1OmM) 4-Methylresorufin. DC: R1 = 0,68 (Essigester/Hexan 1:2)
b) In 60 ml dest. Wasser werden unter Rühren 0,9 g Natrium-Taurodesoxycholat und 0,3 g Colipase (vom Schwein) gelöst. Unter gutem Rühren wird hierin eine Lösung von T^-O-Dilauryl-rac-glycero-S-glutarsäure-ie-methyl-resorufin-Jester, 70 mg in 1,7ml n-Porpanol eingespritzt. Hierzu wird eine Lösung (200ml) zugegeben, die in 200ml 0,5g Harnstoff, 1 g Natrium-Taurodesoxycholat, 200-mg Natriumchlorid und 2,9g TRIS enthält und deren pH-Wert auf 7,5 eingestellt ist, gegeben. Nach gutem Mischen werden 2,5 ml der so hergestellten Lösung mit 100 μΙ Probe (Serum) versetzt. Die Reaktion wird bei 578 nm Hg photometrisch verfolgt und wie in Beispiel 22 angegeben ausgewertet.
Testspezifische Kenngrößen (vgl. Beisp.23 und Tabelle I): Leerwert: 0,4mE/min f
Lipaseempfindlichkeit: 28mE/min pro 100mE/min Korrelationskoeffizient :0,988
4-Methylresorufin:
Herstellung wie im Patent DE 3411 574 beschrieben aus 7,5g 2-Methyl-4-nitrosoresorcin,4,2g Resorcin, 3,6g Braunstein, 4,3ml Schwefelsäure, 75ml Methanol, 4g Zinkpulver und 18ml 25%igem Ammoniak.
DC: R1 = 0,70 (Ethanol/Aceton 2:1)
UV/VIS (0,1 M Kaliumphosphat-Puffer pH8,5):
max = 579nm
Die Herstellung des 2-Methyl-nitrosoresorcins erfolgt gemäß DE 3411 574, A1.
1,2-0-Dilauryl-rac-glycero-3-glutarsäure-(4-methylumbelliferyl-)ester:
a) 2,75g (5mM) 7a und 1 g (5mM) 4-Methylumbelliferon werden in 30ml Tetrahydrofuran gelöst und dann 2g (1OmM) Dicyclohexylcarbodiimid und 0,15g Dimethylaminopyridin zugefügt. Nach 24stündigem Rühren bei Raumtemperatur wird filtriert und eingeengt. Das Rohprodukt wird durch Flash-Chromatographie gereinigt.
DCiR1 = 0,40 (Essigester/Petrolether 1:3)
b) Die Emulsionsherstellung erfolgt wie in Beispiel 22 angegeben, es werden aber anstelle des dort eingesetzten Lipasesubstrats 35mg 1,2-Dilauryl-rac-glycero-3-glutarsäure-(4-methylumbelliferyl)-ester in 1,7 ml n-Propanol gelöst, eingesetzt.
Die Reaktion wird fluorimetrisch bei 250C verfolgt und zwar bei einer Anregungswellenlänge von 364nm, Spaltbreite 5 nm und einer Emissionswellenlänge von 448 nm und einer Spaltbreite von 10nm.
Testspezifische Kenngrößen (vgl. Beispiel 23 und Tabelle I):
Leerwert: 0,4mE/min
Lipaseempfindlichkeit:28mE/min pro 100U/I ,
Korrelationskoeffizient: 0,9942
1,2-O-Dilauryl-rac-glycero-3-glutarsäure-(p-nitrothiophenyl ester: Herstellung von 32a-b) analog Beispielen 7a-b.
c) Herstellung analog Beispiel 1 c) aus 1,4g (1OmM) p-Nitrothiophenol, 100ml Dimethylpermanid, 2,4ml Pyridin, 0,2g Dimethylaminopyridin und 32b. DC: R1 = 0,76 (Essigester/Hexan 1:4)
-11- Z44 8ZÜ
d) In 27ml dest. Wasser werden die folgenden Verbindungen unter gutem Rühren gelöst:
4,83mg Natrium-Desoxycholat 28,00 mg CHES* 17,50g Harnstoff
2,13mg Natriumchlorid 0,16mg Colipase vom Schwein
0,33mg Calciumchlorid 152,00mg Natrium-Taurodesoxycholat Der pH-Wert der Lösung wird auf pH = 8,3 eingestellt. Zu dieser Lösung wird unter gutem Rühren eine Lösung von i^-O-Dilauryl-rac-glycero-S-glutarsäure-lp-nitrothiophenyll-ester eingespritzt. Anschließend wurde die Lösung unter Kühlen 2 min mit Ultraschall behandelt (mittlere Intensität).
Zu 1 ml der so erhaltenen Emulsionslösung wurden 50 Ml Probe (Lipasehaltiges Humanserum) gegeben und vermischt. Die Reaktion wurde bei 405nm Hg photometrisch verfolgt und wie in Beispiel 22 angegeben berechnet, testspezifische Kenngrößen: Leerwert: 0,3mE/min
Lipaseempfindlichkeit: 12,2mE/min/pro 100Ü/L Korrelationskoeffizient: 0,998
a) 1-0-(2-Methoxy-octadecyl)-2-0-methyl-rac-glycero-3-glutarsäure-monoester:
Herstellung analog Beispiel 1a) aus 3g (7,7 mM) 1-0-(2-Methoxy-octadecyl)-2-0-methyl-glycerin,25ml Chloroform, 1,8ml Pyridin, 0,1 g Dimethylaminopyridin und 1,75 (15mM) Glutarsäureanhydrid.
Ausbeute: 1,5g (39%)
DC: R1 = 0,68(RP18,Aceton/Ethanol 1:2) 1-0-(2-Methoxy-octadecyl)-2-0-methyl-rac-glycero-3-glutarsäure-(6-methylresorufin)-ester:
b) Herstellung analog Beispiel 1 b) aus 1,5g (3mM) 33a) und 1,5ml Oxalylchlorid
c) Herstellung analog Beispiel 2c) aus 0,68g (3mM) 4-Methylresorufin, 0,45ml !,S-Diazabicyclo-fBAOlundec^en und 33b). DC: R1 = 0,86 (Essigester)
d) Die Herstellung der Testemulsion erfolgt wie im Beispiel 22 angegeben, jedoch werden diesmal als Lipasesubstrat 1-0-(2-Methoxy-octadecyl)-2-0-methyl-rac-glycero-3-glutarsäure-(6-methyl-resorufin)-ester eingesetzt.
Die Ermittlung der Lipasekonzentration erfolgt über eine Eichgerade aus zwei Standards unterschiedlicher Lipasekonzentration, bei der die Extinktionsänderung pro Minute gegen die Extinktionsänderung aufgetragen ist. Leerwert: 8,4mE/min Esteraseempfindlichkeit: 25,3mE/min Lipaseempfindlichkeit: 19,0mE/min pro 100U/I Korrelationskoeffizient: 0,9483
a) i^-O-Dilauryl-rac-glycero-S-bernsteinsäure-monoester:
Herstellung analog Beispiel 1 a) aus 8,56g (2OmM) 1,2-0-Dilaurylglycerin, 4g (4OmM) Bernsteinsäureanhydrid, 60ml Chloroform, 4,6ml Pyridin und 0,24g Dimethylaminopyridin. Das Produkt kristallisiert aus Hexan.
FP: 41-430C
DC: R1 = 0,26 (Essigester/Hexan 1:4) 1 ^-O-Dilauryl-rac-glycero-S-bernsteinsäure-resorufin-ester:
b) Herstellung analog Beispiel 17) aus 2,65g (5mM)34a) 1,06g (5mM) Resorufin, 6,18g (3OmM) Dicyclohexylcarbodiimid, 0,1 g Dimethylaminopyridin und 50ml Dimethylformamid.
DC: R1 = 0,47 (Essigester/Petrolether 1:3)
c) Wie in Beispiel 22 angegeben wird auch hier die Emulsion hergestellt. Als Lipasesubstrat werden in diesem Falle aber 70 mg i^-O-Dilauryl-rac-glycero-S-bemsteinsäure-resorufinesterin 1,7ml Propanol gelöst, verwendet.
Dabei wurden die folgenden testspezifischen Kenngrößen erhalten (vgl. Beispiel 23 und Tabelle I): Leerwert: 3,8-4,0 mE/min Esteraseempfindlichkeit: nicht ermittelt Lipaseempfindlichkeit: 8,7mE/min pro 100U/I Korrelationskoeffizient: 0,8793
a). 2-0-Lauryl-octadecandiol (1,2)-1-glutarsäure-monoester:
Herstellung analog Beispiel 1 a) aus4,6g (1OmM) 2-0-Lauryl-octadecandiol(T,2), 29ml Chloroform 2,3ml Pyridin, 0,12g Dimethylaminopyridin, 2,3g (2OmM) Glutarsäureanhydrid DC: R1 = 0,54 (Petrolether/Essigester 4:1) 2-0-Lauryl-octadecandiol(1,2)-1-glutarsäure-(f-methylresorufin-)ester:
b) Herstellung analog Beispiel 1 b) aus 1,15g (2mM) 35a) und 0,88ml Oxalylchlorid
c) Herstellung analog Beispiel 2c) aus 0,45g (2 mM) 4-Methylresorufin, 20ml Chloroform, 0,3ml !, 7-en, 40mg Dimethylaminopyridin und 35b).
DC: Ri = 0,37 (Petrolether/Essigester 5:1)
CHES* = Z-ICyclohexylaminol-aethan-sulfonsäure
d) Wie in Beispiel 22 angegeben wird eine Emulsion hergestellt, jedoch werden als Lipasesubstrat70mg 2-0-Lauryloctadecandio-i^i-glutarsäure-ie-methylresorufinl-esterin 1,7 ml n-Propanol gelöst, eingesetzt
Entsprechend dem Beispiel 23, Tab. I wurden die folgenden testspezifischen Kenngrößen erhalten: Leerwert: 0,3-1 ,OmE/min Esteraseempfindlichkeit: 1, OmE/min Lipaseempfindlichkeit: 25,5mE/min pro 100 U/l Korrelationskoeffizient: 0,996
a) i^-O-Dilauryl-rac-S-thioglycero-S-S-glutarsäuremonoester:
Herstellung analog Beispiel la) aus 2,5 g (4,8 mM) i^-O-Dilauryl-rac-S-thioglycerin, 14 ml Chloroform, 1,1 mlPyridin und 1,1 g (9,6mMLGIutarsäureanhydrid.
DC: R1 = 0,5 (Hexan/Tetrahydrofuran 1:4)
i^-O-Dilauryl-rac-S-thioglycero-S-S-glutarsäure-fB-methylresorufin-Jester:
b) Herstellung analog Beispiel 1 b) aus 0,74g (1,3mM) 36a) und 0,6ml Oxalylchlorid.
c) Herstellung analog Beispiel 2c) aus0,3g (1,3mM)4-Methylresorufin, 13ml Chloroform, 0,2ml !,S-Diazabicyclo-iöAOJ-undec-7-en, 27mg Dimethylaminopyridin und 36b).
DC: R1 = 0,38 (Petrolether/Essigester 17:3)
Das als Ausgangsmaterial eingesetzte 1,2-0-Dilauryl-rac-3-thioglycerin wird analog Org. Synth III, S.366 und S.363 folgendermaßen erhalten:
Umsetzung von 1,2-0-Dilaurylglycerin mitToluolsulfonsäurechlorid zum Dilauryl-glycero-3-toluolsulfonat, dann Reaktion mit Thioharnstoff zum entsprechenden Isothiuroniumsalz, anschließende Hydrolyse mit Salzsäure
DC: R1 = 0,52 (Petrolether/Essigester 49:1)
d) Wie in Beispiel 22 angegeben wird eine Emulsion hergestellt. Es wird jedoch anstelle des dort verwendeten Lipasesubstrats eine Lösung von 70mg i^-O-Dilauryl-rac-S-thioglycero-S-S-glutarsäure-fe-methylresorufinl-esterin 1,7ml n-Propanol eingesetzt.
testspezifische Kenngrößen: Leerwert: 0,2-0,9mE/min Esteraseempfindlichkeit: 1,3 mE/min Lipaseempfindlichkeit: 4,1 mE/min pro 100U/l Korrelationskoeffizient: 0,857
a) i^-S-Dilauryl-rac-i^-dithioglycero-S-glutarsäuremonoester:
Herstellung analog Beispiel 1 a) aus 3g (6,5mM) 1,2-S-Dilauryl-1,2-dithioglycerin, 30ml Pyrdin und 1,5g (13mlVl)
Glutarsäureanhydrid.
DC: R1 = 0,43 (Petrolether/Essigester 1:1)
i^-S-Dilauryl-rac-i^-dithioglycero-S-glutarsäure-fe-methyl-resorufin-Jester:
b) Herstellung analog Beispiel 1 b) aus 1,2g (2mM) 37a) und 1 ml Oxalylchlorid DC: Rf = 0,37 (Essigester/Petrolether 1:4)
c) Herstellung analog Beispiel 2c) aus 0,46g (2mM)4-Methylresorufin, 20 ml Chloroform, 0,3ml !,S-Diazabicyclo-iöAOJ-undec-7-en und 37b)
Das als Ausgangsmaterial eingesetzte i^-S-Dilauryl-rac-i^-dithioglycerin wird folgendermaßen hergestellt:
Zu einer Lösung von 9g (16OmM) Kaliumhydroxyd in 250ml Ethanol wird bei Raumtemperatur 10g (8OmM) 2,3-
Dimercaptopropanol in 100 ml Ethanol getropft. Nach einstündigem Rühren wird eine Lösung von 40 g (16OmM) Dodecylbromid in 100 ml Ethanol zugetropft. Zur Vervollständigung der Reaktion wird noch zwei Tage gerührt, dann filtriert und das Filtrat mit Eis versetzt. Nach Ansäuern mit 2 N Salzsäure wird dreimal mit Ether extrahiert, die organische Phase getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird über eine Kieselgelsäule (Elutionsmittel: Essigester/Petrolether 1:10) gereinigt.
DC: R1 = 0,54 (Essigester/Petrolether 1:10)
Leerwert: 3me/min
Esteraseempfindlichkeit: 3,4me/min
Lipaseempfindlichkeit: 24me/min
Korrelationskoeffizient: 0,9943
d) Wie in Beispiel 22 angegeben wird eine Emulsion hergestellt. Anstelle des dort eingesetzten Lipasesubstrats wird in diesem Falie aber i^-S-Dilauryl-rac-i^-dithioglycero-S-S-glutar-säureie-methylresorufin-lester, 70mg in 1,7ml n-Popranol gelöst, eingesetzt.
Claims (1)
- Erfindungsanspruch:1. Verfahren zur optischen Bestimmung der Lipase, gekennzeichnet dadurch, daß man ein Lipasesubstrat der allgemeinen FormelO V-M. OH2C-Y-C-A-C-X
HC-Y-R
Family
ID=
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