WO1995032181A1 - Fluoreszenzbestimmung der aktivität lipolytischer enzyme - Google Patents

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WO1995032181A1
WO1995032181A1 PCT/EP1995/001919 EP9501919W WO9532181A1 WO 1995032181 A1 WO1995032181 A1 WO 1995032181A1 EP 9501919 W EP9501919 W EP 9501919W WO 9532181 A1 WO9532181 A1 WO 9532181A1
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lipase
lipases
trinitrophenylaminododecanoyl
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Albin Hermetter
Martin Duque
Fritz Paltauf
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Progen Biotechnik Gmbh
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    • C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases

Definitions

  • a method based on fluorimetry was developed to determine the activity of lipases of animal, plant and microbial origin (fungal and bacterial lipases) and lipases detectable in serum [lipoprotein lipase (LPL), hepatic lipase (HL), pancreatic lipase (PL)] .
  • LPL lipoprotein lipase
  • HL hepatic lipase
  • PL pancreatic lipase
  • fluorogenic triglyceride analogs have been synthesized in which an acyl or
  • the fluorogenic lipid is solubilized with amphiphiles in the form of liposomes, vesicles, micelles or emulsions.
  • the fluorogenic substrate can also be used as such in aqueous
  • An essential part of the invention is the complexation of the fluorogenic
  • Lipids with albumin in an aqueous medium and subsequent lyophilization which gives a solid "water-soluble" substrate for fluorimetric lipase analysis.
  • the proposed method is suitable for numerous practical applications fertilize such as for lipase analysis in medical diagnostics, biotechnological enzyme production, the quality control of lipases used in organic chemistry, the detection of lipases or lipase inhibitors in food, and the enzyme screening of biological material.
  • the stereoisomers of each of the fluorogenic lipids were prepared and used in various substrate forms (see above) for lipase determination. Different lipases showed very different stereospecificities on the fluorogenic substrates.
  • the described method is therefore suitable for the discrimination of lipases in natural enzyme mixtures (eg serum) as well as for the screening (genetically modified) of modified enzymes.
  • the radiometric methods are discontinuous methods in which the release of radioactively labeled fatty acids from a triglyceride is determined after separation from the unreacted starting compound. These methods are very complex due to the use of radioactivity and the poor reproducibility.
  • ad2 The release of fatty acids from triglycerides is determined by means of alkali titration. However, large amounts of enzyme and substrate must be used for accurate measurements. This method is very prone to failure. In particular, this method is not well applicable to certain "substrate forms", for example if the substrate is solubilized with detergents or dissolved in organic solvents.
  • ad 3a In this case, the formation of chromogenic carboxylic acids from their (glycerol) esters is determined photometrically (and fluorimetrically) (Boehringer Mannheim GmbH, European Patent 0207252B1). The sensitivity of these methods is not very high, but the fluorimetric methods are more sensitive and the substrates are more diverse.
  • pyrenebutyric acid the fluorescence of which is suppressed by a quencher fatty acid adjacent to the molecule (e.g. bromohexanoic acid).
  • a quencher fatty acid adjacent to the molecule e.g. bromohexanoic acid.
  • Substrate cleavage leads to de-quenching and thus to an increase in fluorescence.
  • fluorophores excimer technology
  • fluorophore and quencher bromine acts at a few tenths of a nm distance
  • the previously known substrates can at best be used in vesicles for determining the activity of enriched and pure enzymes.
  • ERS ⁇ ZBL ⁇ T (RULE 26) Analyzes, however, lead to an association of pyrentriglyceride with apolipoproteins and albumin, which leads to the problem mentioned above.
  • a substrate is therefore required which contains fluorophore and quencher in the same molecule and in which the quench effect does not or hardly depends on the conformation.
  • Such quenching can be done by Resonance Energy Transfer (RET)
  • fatty acid esters of fluorophores e.g. methylumbelliferone; Analytic Sciences February 1991, Vol. 7, 15-18
  • fluoresce little intact and, after hydrolysis cleavage, fluoresce less Biochemica et Biophysica Acta, 1006 (1989) 84-88 ).
  • substrate very high amounts of substrate are required here, which can lead to artifacts when analyzing native biological material.
  • detergent is required for the solubilization of the lipophilic substrate. This often destroys the native biological milieu (e.g. solubilization of lipoproteins and denaturation of proteins in human serum) (Human Serum Lipoproteins, Fruchart & Shepherd, de Gruyter 1989).
  • the present invention describes the chemical synthesis of new fluorogenic lipase substrates (lipid analogs).
  • the optical measurement signal is independent of the conformation of the lipid substrate and thus also of the shape of the substrate.
  • a new substrate form for the solubilization of the substrate is described, which can be used universally for the determination of lipase activities in biological and artificial environments.
  • the substances used for a fluorometric measurement are compounds with the following structure:
  • the compounds of the stated structure can be derived from sn-glycerol, where X, Y, Z can be 0.
  • At least one of the radicals R 1 # 2 # 3 is an acyl or alkyl group which contains a fluorescent radical at the end and at least one further radical R 1 i2i3 is an acyl or alkyl radical which contains a chromophore bonded at the ⁇ end and which quenches the fluorescence of the fluorophore via resonance energy transfer (RET).
  • RET resonance energy transfer
  • At least one of the hydrocarbon chains which contain quenchers or fluorophore must preferably be bound to a primary alcohol function of the glycerol or propane structure via an acyl or thioester bond.
  • a radical R, 2 3 can be an aliphatic hydrocarbon.
  • X, Y or Z can also be S, NH or CH 2 .
  • Fluorophore-substituted side chains R 1> 2 3 can be: I. preferably pyrene bonded to the ⁇ -end of an acyl or alkyl chain with a chain length of C 2 - C 20 with 0 to 6 double bonds. II.
  • fluorophores perylene, anthryl, anthraniloyl, saliciloyl, tetracene, anthracene, phenanthrene, naphthalene, coumarone, coumarin, acridine, aminonaphtolsulfonic acid, phenyloxadiazole, diphenyloxazole, alloxenzophone, stilbene , Fluorene, fluorenone, p-quinone, methylumbelliferone, trinitrophenylamine, phenazine, phenylindole, quinoline, diphenylacetylene, benzothiophene, cyanothiocarbonyls, 1, 3,5,7-decatetraene, rhodamine, diphenylhexatriene, dansyl, 7-nitrobenz-2-oxa -1, 3-diazole (NBD), benzocarbazone, di
  • Quencher-substituted side chains R 1 ⁇ 2 . 3 can be:
  • pyrene as fluorophore, preferably trinitrophenylamine bonded to the ⁇ end of an acyl or alkyl chain with a chain length of C 2 -C 20 with 0 to 6 double bonds.
  • the starting compound for the fluorogenic alkyldiacylglycerol is a 1-O-alkylglycerol, which by known methods (see Hermetter & Paltauf) in ether lipids; Biochemical and Biomedical Aspects (H. Mangold «St F. Paltauf, Editors). Academic Press, 1983, p. 389) is converted into a 1-O-alkyl-2-acyl-3-O-tritylglycerol (acylation protocol: F. Paltauf & A. Hermetter, Methods in Enzymology 197 (1 991) 134), the 2-acyl group the fluorophore or the Quencher can wear.
  • the trityl group is replaced by a further acyl radical which is complementary to Position 2 carries a quencher or fluorophore.
  • This method can also be used to make up the substituted 1,2-dialkyl-3-O-trityl, 1,2-acyl-2-O-alkyl-3-O-trityl and 1,2-diacyl-3-O-tritylglycerols to produce corresponding dialkylacyl and triacylglycerols, one side chain of the starting compound containing fluorophor or quencher and an acyl residue which contains quencher or fluorophore complementary to it being introduced via the trity exchange.
  • 1,3-diacyl-2-acylamino-propanediols which are a fluorophore and a quencher, can be prepared by 1-acyl-2-acylamino-3-O-trityl-1,3-propanediols by trityl group exchange by this method -substituted acyl radical contain.
  • the new substrates can be distributed by all conventional methods in an aqueous environment (Lipases, Borgström & Brockman (Editors), Elsevier, 1984), specifically in phospholipid vesicles, in detergent micelles and emulsions, or dissolved in organic solvents.
  • a new solubilization (substrate) form is described here, the substrate being distributed in a defined molar ratio in the aqueous phase by complexing with a suitable protein, preferably bovine serum albumin (BSA).
  • BSA bovine serum albumin
  • an ethanolic solution of the lipid analog is injected into an aqueous buffer solution with a defined pH, which already contains BSA.
  • the substrate form (lipid-protein complex) obtained in this way can be used both in biological and in artificial environments.
  • the native composition of sensitive biological systems e.g. of human serum, not destroyed and the lipase activity of these samples can take place in the presence of their intact components (proteins, lipoproteins!).
  • Lipid-binding proteins in particular the following substances, can generally be used as complexing protein: BSA, HSA (human
  • ERS ⁇ ZBL ⁇ T serum albumin
  • casein casein
  • lactalbumin ovalbumin
  • water-soluble apolipoproteins modified forms of the aforementioned proteins (methylated, carboxylated, acetylated and proteins modified by chemical or genetic methods).
  • Both the fat-free and the commercially available proteins were examined.
  • the complexes shown are associations of lipid and protein in a molar ratio of 1/1.
  • the water-soluble lipid-protein complex can be freeze-dried using a lyophilizer and isolated as a solid powder. After redissolving in aqueous media, these preparations are suitable for measuring lipase activities.
  • the lyophilization of the lipid-protein complex can be carried out in the absence or in the presence of buffers or mineral salts and of low or high molecular weight additives, preferably carbohydrates. Lyophilization is preferably carried out from a solution of 10 millimolar N- (2-hydroxyethyl) piperazine-N '- (2-ethanesulfonic acid) / NaOH (HEPES-
  • the lyophilisate can preferably be redissolved in distilled water if the lyophilization was carried out from buffer salt solution, or in aqueous buffer solution which preferably contains HEPES-NaOH or phosphate or Tris-HCl, pH 7.4.
  • the ethanol-water ratio is less than 1/100, v / v.
  • This preparation can be used immediately for a lipase determination or, advantageously, after an equilibration phase of approximately 20 hours.
  • the activity of the lipase can be determined continuously via the time-dependent increase in the fluorescence intensity (FIG. 1).
  • the lipase (s) in the sample cleaves the lipid analog and leads by spatial separation of fluorophore and quencher to an increase in fluorescence linearly dependent on the extent of the hydrolysis.
  • the low initial intensity of the fluorophore in the intact substrate is caused by the presence of fluorophore and quencher together on one molecule. This base value is therefore an important indicator for the quenching of the fluorophore in the substrate and thus for the quality and
  • the lipase determination can also be carried out as an end point method, with a simple reading of the increase in fluorescence intensity taking place after a defined incubation time.
  • the fluorescence measurement itself can be carried out in a continuous or discontinuous form with a fluorescence spectrometer, fluorescence microscope or plate reader.
  • the lipase-induced cleavage of the fluorogenic substrate can be calculated quantitatively from the increase in the fluorescence intensity with the aid of a calibration curve (FIG. 2), which was created using unquenched pyrene-substituted triglycerides.
  • the substrate conversion which is obtained from the time-dependent increase in fluorescence, corresponds to the increase in the fluorescent cleavage products which, after thin-layer chromatographic separation on silica gel (mobile phase: petroleum ether / chloroform / glacial acetic acid 96/4/1) and elution with chloroform / methanol 2/1 fluorimetric were determined.
  • Colipase hepatic lipase; as well as lipases from Pseudomonas species, Chromobacterium viscosum, Candida rugosa, Rhizopus arrhizus, Geotrich ⁇ m candidum.
  • the present invention can be put into practical use in the following important areas of lipase analysis.
  • SPARE BLADE (RULE 26) sen, which lead to organ damage, whereby enzymes are released into the serum, which either do not occur at all or only in a very low concentration (eg in the case of carcinomas or inflammatory processes of the liver and the pancreas, or damage to these organs in the case of alcoholism ).
  • RULE 26 SPARE BLADE
  • Stereoisomers of the substances of the formulas I and II can be used for the screening of different stereoselectivities of natural and chemically and genetically modified lipases.
  • the sn-1 acyl isomer of compound II of lipoprotein lipase is converted about 25 times faster than the sn-3 acyl isomer.
  • Other lipases, which can be detectable in the serum, such as, for example, pancreatic lipase, show lower stereophonic preferences. The proportion of lipoprotein lipase in the total lipase activity of the serum can therefore be determined from the degree of the stereo preference measured.
  • a kit for determining the activity of lipases in particular lipoprotein, hepatic and pancreatic lipases, is also provided, comprising a lipase, in particular a lipoprotein, hepatic and / or pancreatic lipase, as a positive control and one or more compounds according to one of claims 1 to 1 5 and usual auxiliary substances.
  • 1 -Q-Hexadecyl-sn-glycerol is tritylated with trityl chloride at the sn-3 position (see Hermetter & Paltauf in Etherlipids; Biochemical and Biomedical Aspects (H. Mangold & F. Paltauf, Editors), Academic Press, 1983, p. 389) and the resulting alkyltritylglycerol with pyrendecanoic acid on the still free sn-2 OH-
  • rac.1 -oloyl-glycerol rac.1 -oloyl-3-0-trityl-glycerol is produced from rac.1- which contains pyrendodecanoic anhydride in rac.1-
  • Oleoyl-2-pyrendodecanoyl-3-0-tritylglycerol is converted.
  • the conversion of the diacyltritylglycerol (200 mg, 209.8 // mol) with trinitrophenylaminododecanoic anhydride (525.5 mg, 629.4 // mol) in the presence of boron trifluoride etherate (50%) gives rac.1-oleoyl -2-pyrendodecanoyl-3- (2 ', 4', 6'-trinitrophenylamino-dodecanoyD-glycero! (122, 1 mg, 109, 1 / mol, 52% yield).
  • the acylalkylglycerol (146 mg, 188 // mol) was then trinitrophenylaminododecanoic acid (100 mg, 230 // mol) in the presence of 52 mg dimethylaminopyridine (423 // mol) and 42 mg dicyclohexylcarbodimide (200 / mol) in 5 ml Acylated chloroform.
  • the rac.1 -pyrendecanoyl-2-0-hexadecyl-3- (2 ', 4', 6'-trinitrophenylaminododecanoyl) glycerol formed was turned on
  • the synthesis starts from rac.1 -Tetradecanoylamino-3-0-tritylpropanediol, which was prepared according to the literature procedure (R. Dijkman, N. Dekker, and GH Haas, Biochim.Biophys.Acta 1043 (1 990) 67-74).
  • acyltritylpropanediol was esterified with pyrendecanoic acid to rac.1-tetradecanoylamino-2-pyrendecanoyl-3-O-tritylpropanediol (the same method was used for the acylation of alkyltritylglycerols, see Hermetter & Paltauf in ether lipids;
  • the lipase activity of the sample in pmol converted substrate / test volume / time unit (here 2.1 pmol / ml / min) is determined from the slope of the increase in fluorescence (FIG. 1) and via a calibration line
  • Fig. 2 determined which was obtained for known concentrations of hexadecylpyrenecanoyltritylglycerol (HPTG) in aqueous albumin solution.
  • HPTG hexadecylpyrenecanoyltritylglycerol
  • ERS ⁇ ZBLA ⁇ T (RULE 26) set amount of enzyme (in ⁇ g) (Fig. 3).
  • Example 2 the activity of 1 ug Lipoprotein ⁇ lipase (from cow's milk) to an albumin-substrate complex of BSA and 1- (2, 4, 6, -Trinitrophenvlaminododecanovl) -2-pyrendecanovl-3- 0-hexadecyl-sn-glycerol (Example 2) determined to be 52.3 pmol / ml / min.
  • Example 12 As described in Example 12, the activity of 1 ⁇ g lipoprotein lipase (from cow's milk) on an albumin-triglyceride complex of BSA and 1-O-dodecyl-2-pyrendecanoyl-3- (2 ', 4', 6 ' -trinitrophenylaminododecanoyl) -sn_-glycerol (Example 3) determined to 6 pmol / ml / min.
  • the lipoprotein lipase activity was determined according to the example 1 2 Regulation determined.
  • BSA bovine serum albumin
  • HSA human serum albumin
  • lipases showed clear activities: swine pancreatic lipase (PL) (from Boehringer Mannheim GmbH), lipoprotein lipase (LPL) from human serum and cow's milk, as well as human serum and breast milk; microbial lipases from: Chromobacterium viscosum, Candida rugosa, Rhizopus arrhizus, Pseudomonas species (from Nagase Biochemicals, Ltd., Japan), Geotrichum candid ⁇ m.
  • PL pancreatic lipase
  • LPL lipoprotein lipase
  • microbial lipases from: Chromobacterium viscosum, Candida rugosa, Rhizopus arrhizus, Pseudomonas species (from Nagase Biochemicals, Ltd., Japan), Geotrichum candid ⁇ m.
  • Lipoprotein lipase used LPL from cow's milk.
  • Serum lipase activity before heparinization low to no activity
  • Serum lipase activity before heparinization 60 pmol / ml / min
  • Example 12 The complex of fluorogenic substrate and bovine serum albumin obtained in Example 12 in an aqueous medium is frozen at -75 ° C. and then lyophilized.
  • a lyophilisate was prepared from albumin and fluorogenic substrate, a solution of 25 mg glycogen in 3 ml of 10 mM HEPES, pH 7.4 (pH adjustment with NaOH) being used as the aqueous medium.
  • a lyophilizate was prepared from albumin and fluorogenic substrate, a solution of 25 mg of sucrose in 3 ml of 10 mM Na phosphate buffer, pH 7.4, being used as the aqueous medium.
  • a lyophilizate was prepared from albumin and fluorogenic substrate, a solution of
  • Lyophilisate activity (pmol / ml / min) from Tris / HCl 7 from HEPES + glycogen 1 2 from phosphate buffer + sucrose 10 from PBS + starch 13

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Abstract

Zur Bestimmung der Aktivität von Lipasen tierischer, pflanzlicher und mikrobieller Herkunft sowie insbesondere im Serum detektierbarer Lipasen wurde eine Methode auf fluorimetrischer Basis entwickelt. Zu diesem Zweck wurden fluorogene Triglyceridanaloge synthetisiert, in denen eine Acyl- oder Alkylkette am φ-Ende einen Fluorophor und eine andere einen Fluoreszenzquencher trägt. Für die Aktivitätsbestimmung wird das fluorogene Lipid mit Amphiphilen in Form von Liposomen, Vesikeln, Micellen oder Emulsionen solubilisiert. Das fluorogene Substrat kann auch als solches im wäßrigen Medium verteilt oder in organischen Lösungsmitteln gelöst dem Enzym angeboten werden. Als neue Solubilisierungsform für Substrate in der Lipaseanalytik werden Komplexe von fluorogenen Triglyceriden mit geeigneten Proteinen (z.B. Albumin) im wäßrigen Medium erstmals beschrieben. Die Aktivität der fettspaltenden Enzyme wird über die Hydrolyse des fluorogenen Substrates bestimmt, die mit einem kontinuierlichen Anstieg der Fluoreszenzintensität verbunden ist.

Description

"Fluoreszenzbestimmung der Aktivität lipolytischer Enzyme"
Beschreibung
Zur Bestimmung der Aktivität von Lipasen tierischer, pflanzlicher und mikrobieller Herkunft (fungale und bakterielle Lipasen), sowie im Serum detektierbarer Lipasen [Lipoprotein-Lipase (LPL), hepatische Lipase (HL), Pankreaslipase (PL)] wurde eine Methode auf fluorimetrischer Basis entwickelt. Zu diesem Zweck wurden fluorogene Triglyceridanaloge synthetisiert, in denen eine Acyl- oder
Alkylkette am tu-Ende einen Fluorophor und eine andere einen Fluoreszenzquen- cher trägt (siehe Formel I und II). Der dritte Substituent kann ein aliphatischer Kohlenwasserstoff rest sein. Für die Aktivitätsbestimmung wird das fluorogene Lipid mit Amphiphilen in Form von Liposomen, Vesikeln, Micellen oder Emulsio- nen solubilisiert. Das fluorogene Substrat kann auch als solches im wäßrigen
Medium verteilt oder in organischen Lösungsmitteln gelöst dem Enzym ange¬ boten werden. Als neue Solubilisierungsform für Substrate in der Lipaseanalytik werden Komplexe von fluorogenen Triglyceriden mit geeigneten Proteinen (z.B. Albumin) im wäßrigen Medium erstmals beschrieben. Die durch die fettspalten- den Enzyme induzierte Hydrolyse des fluorogenen Substrates führt zu einer räumlichen Trennung der Fluorophor- und Quencher-substituierten Kohlenwas¬ serstoffkette und somit zu einem Fluoreszenzanstieg.
Rι**- — X — CH2 |
R2— Y — CH l
R3 — Z — CH2 Formel
Wesentlicher Bestandteil der Erfindung ist die Komplexierung der fluorogenen
Lipide mit Albumin in wäßrigem Medium und darauffolgende Lyophilisierung, die ein festes "wasserlösliches" Substrat für die fluorimetrische Lipaseanalytik ergibt. Die vorgeschlagene Methode eignet sich für zahlreiche praktische Anwen- düngen wie z.B. für die Lipaseanalytik in der medizinischen Diagnostik, der biotechnologischen Enzymproduktion, die Qualitätsüberprüfung von Lipasen, die in der organischen Chemie eingesetzt werden, den Nachweis von Lipasen oder Lipaseinhibitoren in Lebensmitteln, sowie das Enzymscreening von biologischem Material. Von den fluorogenen Lipiden wurden jeweils die Stereoisomeren hergestellt und in verschiedenen Substratformen (siehe oben) zur Lipasebestim- mung eingesetzt. Verschiedene Lipasen zeigten stark unterschiedliche Stereospe- zifitäten an den fluorogenen Substraten. Das beschriebene Verfahren eignet sich daher für die Diskriminierung von Lipasen in natürlichen Enzymgemischen (z.B. Serum) als auch für das Screening (gentechnisch) modifizierter Enzyme.
Stand der Technik:
Folgende Methoden zur Bestimmung der Aktivität von Lipasen sind bekannt (Lipases, Borgström & Brockman, 1984):
1 ) radiometrische Verfahren (Clin. Chem. 30,748 (1984))
2) titrimetrische Verfahren (Methods in Enzymology, Vol. 71 , 619- 627 (1981 ))
3) spektroskopische Verfahren: a) photometrische b) fluorimetrische
ad1 ) Die radiometrischen Verfahren sind diskontinuierliche Verfahren, bei denen die Freisetzung radioaktiv markierter Fettsäuren aus einem Triglycerid nach erfolgter Abtrennung von der nicht umgesetzten Ausgangsverbindung bestimmt wird. Diese Methoden sind aufgrund der Verwendung von Radioaktivität und der schlechten Reproduzierbarkeit sehr aufwendig.
ad2) Die Freisetzung von Fettsäuren aus Triglyceriden wird mittels Laugentitra¬ tion bestimmt. Für genaue Messungen müssen jedoch große Mengen an Enzym sowie an Substrat eingesetzt werden. Diese Methode ist sehr störanfällig. Im speziellen ist diese Methode bei bestimmten "Substratformen" nicht gut an¬ wendbar, z.B. wenn das Substrat mit Detergentien solubilisiert ist oder in organi¬ schen Lösungsmitteln gelöst ist. ad 3a) In diesem Fall wird die Bildung chromogener Carbonsäuren aus ihren (Glycerin-) Estern photometrisch (und fluorimetrisch) bestimmt (Boehringer Mannheim GmbH, Europäisches Patent 0207252B1 ). Die Empfindlichkeit dieser Methoden ist nicht sehr hoch, hingegen sind die fluorimetrischen Methoden empfindlicher und die Substrate vielfältiger.
ad 3b) Bekannte Fluoreszenzmethoden (siehe auch 3a) wurden auf folgenden Prinzipien basierend beschrieben (KSV-Chemicals, Oy Valimotie 7, Europäisches Patent 0037583B1 ). Tripyrenacyl-substituierte Triglyceride (Biochemica et Biophysica Acta, 963 (1988) 340-348) werden als Substrate geschildert, die intra- oder intermolekulare Excimerfluoreszenz in Gegenwart von Amphiphilen zeigen. Bei der hydrolytischen Spaltung einer Pyrenacylkette nimmt die Pyren- monomerfluoreszenz auf Kosten der Excimerfluoreszenz zu. Ein zweites Konzept ist ähnlich aufgebaut. Ein markiertes Substrat enthält eine fluoreszierende Fettsäure (z.B. Pyrenbuttersäure), deren Fluoreszenz durch eine im Molekül benachbarte Quencherfettsäure unterdrückt wird (z.B. Bromhexansäure). Sub¬ stratspaltung führt zu einer Entquenchung und somit zu einem Fluoreszenzan¬ stieg. Beide Methoden funktionieren nur dann, wenn beide Fluorophore (Excimer- technik) oder Fluorophor und Quencher (Brom wirkt auf wenige Zehntel nm Distanz) eng benachbart sind. Wie im folgenden dargestellt, trifft dies in den meisten Fällen nicht zu. Bei der Third Conference on Methods and Applications of Fluorescence Spectroscopy in Prag/Tschechien vom 18. - 21 .10.1993 ("Con- formational effects on the fluorescence of pyrene-labeled alkyldiacyl glycerols in different model membranes", Peer reviewed articles, Plenum Press, in press) haben wir bereits berichtet, daß Di-pyrenacylglycerole "ungünstige" Konformati¬ onen in Micellen, Emulsionen, in Gegenwart von Albumin sowie in organischen Lösungsmitteln zeigen und nur in Vesikeln intramolekulare Excimer-Fluoreszenz ausbilden. Bei der Verwendung von Bromacyl-substituierten Pyrentriglyceriden in Micellen, Emulsionen, Albumin sowie in organischen Lösungsmitteln wird die erforderliche Nachbarschaft von Bromacyl und Pyrenacyl-Rest aus denselben
Gründen auch nicht erreicht und der gewünschte Quencheffekt nicht erzielt. Die bisher bekannten Substrate können allenfalls in Vesikeln zur Aktivitätsbestim¬ mung von angereicherten und reinen Enzymen verwendet werden. Bei Serum-
ERSÄΓZBLÄΓT (REGEL 26) analysen kommt es hingegen zur Assoziation des Pyrentriglycerides mit Apolipo- proteinen und Albumin, die damit zum oben erwähnten Problem führt. Es wird deshalb ein Substrat benötigt, das Fluorophor und Quencher im selben Molekül enthält und bei dem der Quencheffekt nicht oder kaum von der Konformation abhängt. Eine solche Quenchung kann durch ResonanzEnergieTransfer (RET)
(das Absorptionsspektrum des Quenchers überlappt mit dem Emissionsspektrum des Fluorophors) erfolgen (Principles of Fluorescence Spectroscopy, J.R. Lako- wicz, Plenum Press, 1983) . Wichtig dabei ist, daß der Fluorophor und der Quencher an das ω-Ende der hydrophoben Seitenketten gebunden sind, da in diesem Fall keine direkte Interferenz mit der Esterhydrolyse durch das Enzym auftreten kann.
Neben chromogenen Triglyceriden wurden auch Fettsäureester von Fluorophoren (z.B. Methylumbelliferon; Analytic Sciences February 1991 , Vol. 7, 15-18) beschrieben, die im intakten Zustand wenig, nach Hydrolysespaltung stärker fluoreszieren (Biochemica et Biophysica Acta, 1006 (1989) 84-88). Allgemein werden hier sehr hohe Mengen an Substrat benötigt, die bei Analysen von nativem biologischen Material zu Artefakten führen können.
Bei allen bisher bekannten Methoden wird Detergenz für die Solubilisierung des lipophilen Substrates benötigt. Dadurch wird vielfach das native biologische Milieu zerstört (z.B. Solubilisierung von Lipoproteinen und Denaturierung von Proteinen im menschlichen Serum) (Human Serum Lipoproteins, Fruchart & Shepherd, de Gruyter 1989).
Die vorliegende Erfindung beschreibt die chemische Synthese neuer fluorogener Lipasesubstrate (Lipidanaloga). Das optische Meßsignal ist unabhängig von der Konformation des Lipidsubstrats und somit auch von der Substratform. Weiters wird eine neue Substratform für die Solubilisierung des Substrats beschrieben, die universell für die Bestimmung von Lipaseaktivitäten in biologischen und künstlichen Milieus verwendet werden kann.
ERSÄΓZBLÄΓT (REGEL 26) Ausführliche Beschreibung:
Die für eine fluorimetrische Messung verwendeten Substanzen sind Verbindun¬ gen mit folgender Struktur:
RT— X — CH-
R, — Y -— CH
R3— Z ' :H, Formel
Die Verbindungen der angegebenen Struktur können sich von sn-Glycerin ablei¬ ten, wobei X, Y, Z gleich 0 sein kann. Mindestens einer der Reste R1#2#3 ist eine Acyl- oder Alkylgruppe, die am toEnde einen fluoreszierenden Rest enthält und mindestens ein weiterer Rest R1 i2i3 ist ein Acyl- bzw. Alkylrest, der am ω-Ende einen Chromophor gebunden enthält und der die Fluoreszenz des Fluorophors über Resonanzenergietransfer (RET) quencht. Mindestens eine der Kohlen¬ wasserstoffketten, die Quencher oder Fluorophor enthalten, müssen über eine Acyl- oder Thioesterbindung vorzugsweise an eine primäre Alkoholfunktion des Glycerins bzw. Propangerüsts gebunden sein. Ein Rest R, 2 3 kann ein aliphati- scher Kohlenwasserstoff sein. X, Y oder Z können jedoch auch S, NH oder CH2 sein.
Fluorophor-substituierte Seitenketten R1>2 3 können sein: I. vorzugsweise Pyren gebunden an das ω-Ende einer Acyl- oder Alkylkette mit einer Kettenlänge von C2 - C20 mit 0 bis 6 Doppelbindungen. II. Anstelle von Pyren kann einer der nachfolgenden Fluorophore eingesetzt werden: Perylen, Anthryl, Anthraniloyl, Saliciloyl, Tetracen, Anthracen, Phenan- tren, Naphthalen, Cumaron, Cumarin, Acridin, Aminonaphtolsulfonsäure, Phenyl- oxadiazol, Diphenyloxazol, Alloxazin, Stilben, Dibenzopyron, Fluoren, Fluorenon, p-Quinon, Methylumbelliferon, Trinitrophenylamin, Phenazin, Phenylindol, Quino- lin, Diphenylacetylen, Benzothiophen, Cyanothiocarbonyle, 1 ,3,5,7-Dekatetraen, Rhodamin, Diphenylhexatrien, Dansyl, 7-Nitrobenz-2-oxa-1 ,3-diazol (NBD), Benzocarbazon, Dibenzofuran, Parinarsäure, 4,4-Difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-5- indacen.
Quencher-substituierte Seitenketten R1 <2.3 können sein:
I. für Pyren als Fluorophor vorzugsweise Trinitrophenylamin gebunden an das ω- Ende einer Acyl- oder Alkylkette mit einer Kettenlänge von C2 - C20 mit 0 bis 6 Doppelbindungen.
II. Anstelle von Trinitrophenylamin können alle chromogenen oder fluorogenen Verbindungen verwendet werden, deren Absorptionsspektrum (Akzeptor) mit dem Emissionsspektrum (Donor) des vermessenen Fluorophors überlappt. Als geeignete Donor-Akzeptor Kombinationen können alle geeigneten Kombinationen von Fluorophoren (siehe oben, II.) verwendet werden.
Als Beispiel für den beschriebenen Verbindungstyp dient das in der nächsten Struktur dargestellte 1 -O-Hexadecyl-2-pyrendecanoyl-3-trinitrophenylaminodode- canoyl-sn-glycerol.
Figure imgf000008_0001
Formel II
Ausgangsverbindung für das fluorogene Alkyldiacylglycerol ist ein 1 -O-Alkylgly- cerol, das nach bekannten Verfahren (siehe Hermetter & Paltauf) in Etherlipids; Biochemical and Biomedical Aspects (H. Mangold «St F. Paltauf, Editors). Aca- demic Press, 1983, p. 389) in ein 1-O-Alkyl-2-acyl-3-O-tritylglycerol umgewan¬ delt wird (Acylierungsvorschrift: F. Paltauf & A. Hermetter, Methods in Enzymology 197 (1 991 ) 134), wobei die 2-Acylgruppe den Fluorophor oder den Quencher tragen kann. Nach einem Verfahren, das bereits für die Synthese von Phospholipiden beschrieben ist (Chem. Phys. Lipids, 50 (1989) 57-62), und hier erstmals für die Triglyceridsynthese beschrieben wird, wird die Tritylgruppe durch einen weiteren Acylrest ersetzt, der komplementär zur Position 2 einen Quencher oder Fluorophor trägt. Dieses Verfahren kann auch angewendet werden, um aus substituierten 1 ,2-Dialkyl-3-O-trityl, 1 -Acyl-2-O-alkyl-3-O-trityl und 1 ,2-Diacyl-3-O-tritylglycerolen die entsprechenden Dialkylacyl und Triacyl- glycerole herzustellen, wobei eine Seitenkette der Ausgangsverbindung Fluoro¬ phor oder Quencher enthält und über den Tritylaustausch ein Acylrest eingeführt wird, der komplementär dazu Quencher oder Fluorophor enthält. Ebenso können nach dieser Methode aus 1 -Acyl-2-acylamino-3-O-trityl-1 ,3-propandiolen durch Tritylgruppenaustausch die entsprechenden 1 ,3-Diacyl-2-acylamino-propandiole hergestellt werden, die einen Fluorophor- und einen Quencher-substituierten Acylrest enthalten.
Für die fluorimetrische Bestimmung von Lipasen können die neuen Substrate nach allen herkömmlichen Methoden im wäßrigen Milieu (Lipases, Borgström & Brockman (Editors), Elsevier, 1984) und zwar in Phospholipidvesikeln, in Deter- gensmicellen und Emulsionen verteilt oder in organischen Lösungsmitteln gelöst werden.
Hier wird eine neue Solubilisierungs(Substrat)form beschrieben, wobei das Substrat durch Komplexierung mit einem geeigneten Protein bevorzugt Rinder¬ serum Albumin (BSA) in einem definierten Molverhältnis in der wäßrigen Phase verteilt wird. Hierzu wird eine ethanolische Lösung des Lipidanalogen in eine wäßrige Pufferlösung mit definiertem pH, die bereits BSA enthält, injiziert. Die in dieser Weise erhaltene Substratform (Lipid-Protein-Komplex) kann sowohl in biologischen als auch in künstlichen Milieus verwendet werden. Im besonderen ist hervorzuheben, daß die native Zusammensetzung empfindlicher biologischer Systeme, wie z.B. von menschlichem Serum, nicht zerstört und die Lipaseakti- vität dieser Proben in Gegenwart ihrer intakten Bestandteile (Proteine, Lipopro- teine!) erfolgen kann. Als Komplexierungsprotein können allgemein lipidbindende Proteine, insbesondere folgende Stoffe verwendet werden: BSA, HSA (Human-
ERSÄΓZBLÄΓT (REGEL 26) serum Albumin), Casein, Lactalbumin, Ovalbumin, wasserlösliche Apolipopro- teine sowie modifizierte Formen der bereits erwähnten Proteine (methylierte, carboxylierte, acetylierte sowie durch chemische oder genetische Methoden modifizierte Proteine). Untersucht wurden sowohl die fettfreien als auch die im Handel üblichen Proteine (nur teilweise entfettet). Die dargestellten Komplexe stellen Assoziate von Lipid und Protein im Molverhältnis 1 /1 dar.
Der wasserlösliche Lipid-Protein-Komplex kann mittels eines Lyophilisators gefriergetrocknet und als festes Pulver isoliert werden. Diese Präparate sind nach Wiederauflösen in wäßrigen Medien für die Vermessung von Lipaseaktivi- täten geeignet. Die Lyophilisierung des Lipid-Protein-Komplexes kann in Ab¬ wesenheit oder in Gegenwart von Puffer oder Mineralsalzen sowie von nieder- oder hochmolekularen Zusatzstoffen, bevorzugt Kohlehydraten, durchgeführt werden. Bevorzugt erfolgt die Lyophilisierung aus einer Lösung von 10 milli- molaren N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N'-(2-ethansulfonsäure)/NaOH (HEPES-
NaOH), pH 7,4, und Glykogen oder PBS (2 g KCI, 2 g KH2PO4, 80 g NaCI und 21 ,6 g Na2HPO4 • H2O in 1 Liter H2O) und Stärke. Für die Lipasebestimmung kann das Lyophilisat bevorzugt in destilliertem Wasser, wenn die Lyophilisierung aus Puffersalzlösung vorgenommen wurde, oder in wäßriger Pufferlösung, die bevorzugt HEPES-NaOH oder Phosphat oder Tris-HCI, pH 7,4, enthalten, wieder¬ aufgelöst werden.
Zur Herstellung des Komplexes wird die Lösung vom fluorogenen Triglycerid entsprechend Formel I oder II, vorzugsweise in Ethanol, unter Rühren in eine wäßrige Lösung von Protein, vorzugsweise Albumin, die Puffer- oder Mineral¬ salze enthalten kann, bei Temperaturen, vorzugsweise zwischen 20 und 37°C, injiziert. Das Ethanol-Wasser- Verhältnis ist kleiner als 1 /100, v/v. Dieses Prä¬ parat kann sofort für eine Lipasebestimmung verwendet werden oder günstiger¬ weise nach einer Equilibrierungsphase von ca. 20 Stunden. Nach Zugabe von Lipase oder eines Lipase-enthaltenden Präparats kann die Aktivität der Lipase über den zeitabhängigen Anstieg der Fluoreszenzintensität kontinuierlich be¬ stimmt werden (Fig. 1 ). Die in der Probe befindliche(n) Lipase(n) spaltet das Lipidanaloge und führt durch räumliche Trennung von Fluorophor und Quencher zu einem vom Ausmaß der Hydrolyse linear abhängigen Anstieg der Fluoreszenz. Die niedrige Ausgangsintensität des Fluorophors im intakten Substrat wird durch die gemeinsame Gegenwart von Fluorophor und Quencher an einem Molekül bewirkt. Dieser Basiswert gilt daher bei jeder Messung als wichtiger Hinweis für die Quenchung des Fluorophors im Substrat und somit für die Qualität und
Unversehrtheit der Testsubstanz.
Die Lipasebestimmung kann auch als Endpunktsmethode durchgeführt werden, wobei eine einfache Ablesung des Fluoreszenzintensitätsanstiegs nach defi- nierter Inkubationszeit erfolgt. Die Fluoreszenzmessung selbst kann in kontinuier¬ licher oder diskontinuierlicher Form mit einem Fluoreszenzspektrometer, Fluores¬ zenzmikroskop oder Plattenlesegerät durchgeführt werden. Die lipaseinduzierte Spaltung des fluorogenen Substrats kann quantitativ aus dem Anstieg der Fluoreszenzintensität unter Zuhilfenahme einer Eichkurve (Fig. 2), die mittels ungequenchter pyrensubstituierter Triglyceride erstellt wurde, berechnet werden.
Der Substratumsatz, der aus dem zeitabhängigen Fluoreszenzanstieg erhalten wird, entspricht der Zunahme der fluoreszierenden Spaltprodukte, die nach erfolgter dünnschichtchromatographischer Auftrennung auf Kieselgel (Lauf mittel: Petrolether/Chloroform/Eisessig 96/4/1 ) und Elution mittels Chloroform/Methanol 2/1 fluorimetrisch bestimmt wurden. Es besteht ein linearer Zusammenhang zwischen Fluoreszenzanstieg und der Menge oder Aktivität von Lipase im Test¬ gemisch (Fig. 3). Diese Linearität wurde allgemein für tierische und mikrobielle Lipasen gefunden. Im besonderen wurden untersucht: Lipoproteinlipase im menschlichen Serum, in der Kuhmilch, in humaner Muttermilch; angereicherte und reine Lipoproteinlipase; Pankreaslipase in Gegenwart und Abwesenheit von
Colipase; hepatische Lipase; sowie Lipasen aus Pseudomonas species, Chromo- bakterium viscosum, Candida rugosa, Rhizopus arrhizus, Geotrichυm candidum.
Die vorliegende Erfindung kann in folgenden wichtigen Bereichen der Lipase- analytik praktisch eingesetzt werden.
1 ) Medizinische Diagnostik: Die Bestimmung von Lipaseaktivität im mensch¬ lichen Serum ist wichtig bei der Untersuchung pathologischer Fälle wie Fettstoff¬ wechselstörungen (Hyperlipidämie, Adipositas), sowie auch destruktiven Prozes-
ERSATZBLÄTT (REGEL 26) sen, die zu Organschäden führen, wobei Enzyme in das Serum entlassen wer¬ den, die dort entweder gar nicht oder nur in sehr geringer Konzentration vorkom¬ men (z.B. bei Karzinomen oder entzündlichen Prozessen der Leber und des Pankreas, oder Schädigung dieser Organe bei Alkoholismus). 2) Screening von Lipasen in Mikroorganismen und Pflanzen sowie chemisch und gentechnisch modifizierter Enzyme.
3) Stereoisomere der Substanzen der Formeln I und II können für das Screening unterschiedlicher Stereoselektivitäten von natürlichen sowie chemisch und gentechnisch modifizierten Lipasen herangezogen werden. Zum Beispiel wird das sn-1 Acylisomer der Verbindung II von Lipoproteinlipase ca. 25 mal schneller umgesetzt als das sn-3 Acylisomere. Andere Lipasen, die im Serum detektierbar sein können, wie beispielsweise Pankreaslipase, zeigen geringere Stereopräferen¬ zen. Daher kann aus dem Grad der gemessenen Stereopräferenz, der Anteil von Lipoproteinlipase an der Gesamtlipaseaktivität des Serums bestimmt werden. 4) Aktivitätsscreening bei Isolierung und Aufreinigung von natürlichen sowie gentechnisch und biotechnologisch produzierten Lipasen, die nach verschiedenen Methoden wie Säulenchromatographie, HPLC, Gelelektrophorese, Ultrafiltration gereinigt werden. Nach elektrophoretischer Trennung kann die Enzymdetektion direkt auf dem Gel erfolgen. 5) Bestimmung von Lipasen und Lipaseinhibitoren aus Lebensmitteln.
Erfindungsgemäß wird auch ein Kit zur Aktivitätsbestimmung von Lipasen, insbesondere Lipoprotein-, hepatische und pankreatische Lipasen bereitgestellt, umfassend eine Lipase, insbesondere eine Lipoprotein-, hepatische und/oder pankreatische Lipase, als Positivkontrolle und ein oder mehrere Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 1 5 sowie übliche Hilfsstoffe.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter:
Beispiel 1
1 -0-Hexadecyl-2-pyrendecanoyl-3-(2',4',6'-trinitrophenylaminododecanoyl)-sn.-
ERSÄΓZBLÄΓT (REGEL 26) glycerol
1 -Q-Hexadecyl-sn-glycerol wird mit Tritylchlorid an der sn-3 Position trityliert (siehe Hermetter & Paltauf in Etherlipids; Biochemical and Biomedical Aspects (H. Mangold & F. Paltauf, Editors), Academic Press, 1983, p. 389) und das resultierende Alkyltritylglycerol mit Pyrendecansäure an der noch freien sn-2 OH-
Gruppe zum 1 -O-Hexadecyl-2-pyrendecanoyl-3-O-trityl-.sn-glycerol verestert (Acylierungsvorschrift: F. Paltauf & A. Hermetter, Methods in Enzymology 197 (1991 ) 134). Eine Lösung des resultierenden 1 -0-Hexadecyl-2-pyrendecanoyl-3- O-trityl-sn-glycerols, 150 mg (109,5 /mol), sowie von 280 mg (335 μmol) Trinitrophenylaminododecansäureanhydrid und 500 μ\ Bortrifluorid-Etherat
(50%ig) in 2 ml Methylenchlorid wird eine halbe Stunde bei 0°C und zwei weitere Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird durch Zugabe von NaHC03 unter Rühren neutralisiert. Die Lösung des Rohprodukts im organischen Lösungsmittel wird abgetrennt und im N2-Strom auf 1 ml eingeengt. Dann werden 10 ml Petrolether zugegeben. Der Niederschlag wird verworfen und der Überstand auf eine Kieselgelsäule aufgetragen. Elution der Säule mit Petrolether/Essigester 9/1 (v/v) liefert 86,3 mg (79,9 mol) des Produktes (73% Ausbeute), das dünnschichtchromatographisch auf Kieselgel einheitlich ist. DC: Rf = 0,79 (Petrolether/Chloroform 1 :4)
Beispiel 2
1 -(2',4',6'-Trinitrophenylaminododecanoyl)-2-pyrendecanoyl-3-0-hexadecyl-sn_- glycerol Herstellung analog Beispiel 1 : aus 3-0-Hexadecyl-.sn-glycerol, aus dem zunächst
1 -0-Trityl-2-pyrendecanoyl-3-0-hexadecyl-sn_-glycerol erhalten wurde. Aus letzterer Verbindung (300 mg, 328, 4μmol) wurde 1 -Trinitrophenylaminododeca- noyl-2-pyrendecanoyl-3-0-hexadecyl-srvglycerol (212,7 mg, 197, 1 /mol, 60% Ausbeute) nach Säulenchromatographie erhalten. DC: Rf = 0,79 (Petrolether/Chloroform 1 :4)
ERSATZBLÄTT (REGEL 26) Beispiel 3
1 -0-Dodecyl-2-pyrendecanoyl-3-(2',4',6'-trinitrophenylaminododecanoyl)-sn.- glycerol
Herstellung analog Beispiel 1 : aus 100 mg (103,2 //mol) 1 -0-Dodecyl-2-pyren- decanoyl-3-O-trityl-sn-glycerol wurden 72,9 mg (71 ,2 //mol, 69% Ausbeute) 1-
0-Dodecvl-2-pvrendecanovl-3-(2',4',6,-trinitrophenylaminododecanoyl)-sn- glycerol erhalten.
DC: Rf = 0,75 (Petrolether/Chloroform 1 :4)
Beispiel 4
1-(2',4',6'-Trinitrophenylaminododecanoyl)-2-pyrendecanoyl-3-0-dodecyl-sjι- glycerol Herstellung analog Beispiel 1 : aus 100 mg (103,2 //mol) 1 -0-Trityl-2-pyrendeca- noyl-3-O-dodecyl-.sn-glycerol wurden 63,4 mg (61 ,9 //mol, 60% Ausbeute) 1 - (2, .4, .6,-Trinitrophenvlaminododecanoyl)-2-pyrendecanovl-3-O-dodecyl-sn- glycerol erhalten. DC: Rf = 0,75 (Petrolether/Chloroform 1 :4)
Beispiel 5
1 -0-Tetradecyl-2-0-pyrendecyl-3-(2',4',6'-trinitrophenylaminohexanoyl)-sn.- glycerol 1 -Q-Tetradecyl-sn-glycerol wird mit Tritylchlorid ins 1 -Q-Tetradecyl-3-Q-trityl-sn- glycerol umgewandelt (siehe Hermetter & Paltauf in Etherlipids; Biochemical and Biomedical Aspects (H. Mangold & F. Paltauf, Editors), Academic Press, 1983, p. 389) . Alkylierung der letzteren Substanz mit Pyrenhexylmesylat, das aus Pyrenhexanol und Mesylchlorid erhalten wurde (s. Hermetter & Paltauf in Ether- lipids; Biochemical and Biomedical Aspects (H. Mangold & F. Paltauf, Editors),
Academic Press, 1983, p. 389), liefert 1 -0-Tetradecyl-2-0-pyrendecyl-3-0-trityl- stvglycerol. Das Dialkyltritylglycerol (250 mg, 286,9 μmol) wird mit Trinitro- phenylaminohexansäureanhydrid (573,7 mg, 860,7 /mol) in Gegenwart von Bortrifluorid-Etherat (50%ig), analog zum Verfahren in Beispiel 1 , in das Endpro¬ dukt umgewandelt (191 ,4 mg, 200,8 / mol, 70% Ausbeute). DC: Rf = 0,85 (Petrolether/Chloroform 1 :4)
Beispiel 6
1 -(2',4',6'-Trinitrophenylaminohexanoyl)-2-0-pyrendecyl-3-0-tetradecyl-s_n- glycerol
Herstellung analog Beispiel 5: aus 200 mg (229,5 //mol) 1 -0-Trityl-2-0-pyren- decyl-3-O-tetradecyl-.sn-glycerol wurden 148,8 mg (156,1 / mol, 68% Ausbeute)
1 -Trinitrophenylaminohexanoyl-2-0-pyrendecyl-3-0-tetradecyl-srι-glycerol erhal¬ ten. DC: Rf = 0,85 (Petrolether/Chloroform 1 :4)
Beispiel 7
rac.1 -0leoyl-2-pyrendodecanoyl-3-(2',4',6'-trinitrophenylaminododecanoyl)- glycerol
Analog zum Verfahren in Beispiel 1 wird aus rac.1 -Oleoyl-glycerol rac.1 -Oleoyl- 3-0-trityl-glycerol hergestellt, das mit Pyrendodecansäureanhydrid in rac.1-
Oleoyl-2-pyrendodecanoyl-3-0-tritylglycerol umgewandelt wird. Der Umsatz des Diacyltritylglycerols (200 mg, 209,8 //mol) mit Trinitrophenylaminododecan- säureanhydrid (525,5 mg, 629,4 //mol) in Gegenwart von Bortrifluorid-Etherat (50%ig), liefert rac.1 -Oleoyl-2-pyrendodecanoyl-3-(2', 4', 6'-trinitrophenylamino- dodecanoyD-glycero! (122, 1 mg, 109, 1 /mol, 52% Ausbeute).
DC: Rf = 0,75 (Petrolether/Chloroform 1 :4)
Beispiel 8
1 -(2' ,4' , 6'-Trinitrophenylaminododecanoyl)-2-pyrendodecanoyl-3-oleoyl-srι- glycerol
Analog zum Verfahren in Beispiel 7 wird 3-Oleoyl-j>n-glycerol zunächst über das Oleoyltrityl-sjvglycerol in 1 -0-Trityl-2-pyrendodecanoyl-3-oleoyl-sn-glycerol
ERSATZBLÄTT (REGEL 26) umgewandelt, das mit Trinitrophenylaminododecansäureanhydrid in Gegenwart von Bortrifluorid-Etherat das Endprodukt (50% Ausbeute) gibt. DC: Rf = 0,75 (Petrolether/Chloroform 1 :4)
Beispiel 9
1 -Oleovl-2-pvrendodecanoyl-3-(2',4',6'-trinitrophenvlaminododecanoyl)-sn- glycerol
Analog zum Verfahren in Beispiel 8 wird 1 -Oleoyl-2-pyrendodecanoyl-3-O-trityl- sn-glycerol in das Endprodukt umgewandelt (Ausbeute 56%).
DC: Rf = 0,75 (Petrolether/Chloroform 1 :4)
Beispiel 10
rac.1 -Pyrendecanoyl-2-0-hexadecyl-3-(2',4',6'-trinitrophenylaminododecanoyl)- glycerol
2-O-Hexadecylglycerol (siehe Hermetter & Paltauf in Etherlipids; Biochemical and Biomedical and Biomedical Aspects (H. Mangold & F. Paltauf, Editors), Academic Press, 1983, p. 389) (100 mg 31 5 //mol) wurde mit Pyrendecansäure in Gegen- wart von Dimethylaminopyridin (85,5 mg, 100 //mol) und Dicyclohexylcarbodi- imid (75 mg, 350 mol) in 5 ml CHCI3 'acyliert (Acylierungsvorschrift: F. Paltauf & A. Hermetter, Methods in Enzymology 197 (1991 ) 134). Das gebildete rac.1 - Pyrendecanoyl-2-O-hexadecyl-glycerol wurde an Kieselgel chromatographiert (Elution mit einem Gradienten von Petrolether-Ether). Das Reinprodukt wurde in 87% Ausbeute (146 mg) erhalten; DC an Kieselgel: Rf = 0,40 (Chloro¬ form/Azeton/Eisessig 96:4: 1 ). Das Acylalkylglycerol (146 mg, 188 //mol) wurde hierauf mit Trinitrophenylaminododecansäure (100 mg, 230 //mol) in Gegenwart von 52 mg Dimethylaminopyridin (423 //mol) und 42 mg Dicyclohexylcarbodi- imid (200 / mol) in 5 ml Chloroform acyliert. Das gebildete rac.1 -Pyrendecanoyl- 2-0-hexadecyl-3-(2',4',6'-trinitrophenylaminododecanoyl)-glycerol wurde an
Kieselgel (Elution mit einem Gradienten von Petrolether-Ether (Kieselgel, Chloro¬ form/Azeton/Eisessig 96:4: 1 ) gereinigt (137 mg, 68% Ausbeute). DC: Rf = 0,80
ERSÄΓZBLÄΓT (REGEL 26) Beispiel 1 1
rac.1 -Tetradecanoylamino-2-pyrendecanoyl-3-(2',4',6'-trinitrophenylaminodode- canoyl)-propandiol Die Synthese geht aus von rac.1 -Tetradecanoylamino-3-0-tritylpropandiol, das nach Literaturvorschrift hergestellt wurde (R. Dijkman, N. Dekker, and G.H. Haas, Biochim.Biophys.Acta 1043 (1 990) 67-74). Das Acyltritylpropandiol wurde mit Pyrendecansäure zum rac.1 -Tetradecanoylamino-2-pyrendecanoyl-3- O-tritylpropandiol verestert (Es wurde die gleiche Methode wir für die Acylierung von Alkyltritylglycerolen verwendet, siehe Hermetter & Paltauf in Etherlipids;
Biochemical and Biomedical Aspects (H. Mangold & F. Paltauf, Editors), Aca¬ demic Press, 1983, p. 389. Aus dieser Verbindung (200 mg, 286,5 //mol) wurden durch Tritylgruppenaustausch mit Trinitrophenylaminododecansäurean- hydrid, analog zu dem unter Beispiel 1 angegebenen Verfahren, 1 53,3 mg (177,6 //mol, 62% Ausbeute) des Endprodukts erhalten.
DC: Rf = 0,70 (Petrolether/Chloroform 1 :4)
Beispiel 12
In eine Lösung von 9 nmol (0,6 mg) Rinderserumalbumin (BSA) in 9 ml 10 mM
Tris/HCI, pH 7,4 wird unter Rühren mittels einer Hamiltonspritze in einem mög¬ lichst dünnen Strahl eine Lösung von 9 nmol (9 //g) 1 -0-Hexadecyl-2-pyrendeca- noyl-3-(2', 4', 6'-trinitrophenylaminododecanoyl)-^rvglycerol (Beispiel 1 ) in 30 μ\ Ethanol bei Raumtemperatur eingespritzt. 3 ml einer derart erhaltenen Lösung eines BSA-Triglycerid-Komplexes werden mit 40 μ\ Lipaseprobe (Lipoproteinli¬ pase) versetzt. Hierauf wird über den zeitabhängigen Anstieg der Fluoreszenz bei 380 nm die Reaktion mit einem Fluorimeter bei 37°C verfolgt (Anregung 342 n ; Spaltbreite: Anregung 10 nm Emission 10 nm) . Die Lipaseaktivität der Probe in pmol umgesetztes Substrat/Testvolumen/Zeiteinheit (hier 2, 1 pmol/ml/min) wird aus der Steigung des Fluoreszenzanstiegs (Fig. 1 ) und über eine Eichgerade
(Fig. 2) ermittelt, welche für bekannte Konzentrationen von Hexadecylpyren- decanoyltritylglycerol (HPTG) in wäßriger Albuminlösung erhalten wurde. Die ermittelten Lipaseaktivitäten stehen in linearem Zusammenhang mit der einge-
ERSÄΓZBLAΓT (REGEL 26) setzten Enzymmenge (in μg) (Fig. 3) .
Beispiel 13
Wie unter Beispiel 12 beschrieben, wurde die Aktivität von 1 μg Lipoprotein¬ lipase (aus Kuhmilch) an einem Albumin-Substrat-Komplex aus BSA und 1- (2,,4,,6,-Trinitrophenvlaminododecanovl)-2-pyrendecanovl-3-0-hexadecyl-sn- glycerol (Beispiel 2) zu 52,3 pmol/ml/min bestimmt.
Beispiel 14
Wie unter Beispiel 12 beschrieben, wurde die Aktivität von 1 μg Lipoprotein¬ lipase (aus Kuhmilch) an einem Albumin-Triglycerid-Komplex aus BSA und 1 -O- Dodecyl-2-pyrendecanoyl-3-(2',4',6'-trinitrophenylaminododecanoyl)-sn_-glycerol (Beispiel 3) zu 6 pmol/ml/min bestimmt.
Beispiel 15
Wie unter Beispiel 12 beschrieben, wurde die Aktivität von 1 μg Lipoprotein- lipase (aus Kuhmilch) an einem Albumin-Triglycerid-Komplex aus BSA und 1-
(2',4', 6'-Trinitrophenylaminododecänoyl)-2-pyrendecanoyl-3-0-dodecyl-sπ- glycerol (Beispiel 4) zu 150 pmol/ml/min bestimmt.
Beispiel 16
Die Verwendung verschiedener Komplexierungsproteine für fluorogene Substrate der Lipoproteinlipase lieferte die in der Tabelle 1 zusammengestellten Ergebnisse. Ein Komplex aus Protein und 1 -0-Hexadecyl-2-pyrendecanoyl-3-(2',4',6'-trinitro- phenylaminododecanoyl)-.sn-g|ycerol wurde gemäß Beispiel 12 hergestellt, wobei die in der Tabelle angeführten Proteine eingesetzt wurden.
Die angeführten Proteine wurden gekauft (BSA: Boehringer Mannheim GmbH; die restlichen von Sigma).
Die Lipoproteinlipaseaktivität wurde nach der unter Beispiel 1 2 angeführten Vorschrift ermittelt.
Tabelle 1
Protein Aktivität [pmol/ml/min]
BSA (Rinderserumalbumin) 18
BSA-palmitoyliert 8
BSA-acetyliert 13
HSA (Humanserumalbumin) 13
Ovalbumin 4
Casein 5
Lactalbumin 13
Globulin 1 ,3
Beispiel 17
Für verschiedene Lipasen wurden an einem Komplex aus 1 -0-Dodecyl-2-pyren- decanoyl-3-(2',4',6'-trinitrophenylaminododecanoyl)-^rι-glycerol und BSA Aktivitäten gemessen, die linear von der Enzymkonzentration abhängig waren. Bereitung des Komplexes, Aktivitätsmessung sowie Auswertung erfolgten wie unter Beispiel 1 2 beschrieben. Mit Esterase aus Schweineleber und Phospho- lipase A2 aus Schweinepankreas (beide von Boehringer Mannheim) wurden keine Aktivitäten gefunden.
Folgende Lipasen zeigten deutliche Aktivitäten: Schweinepankreaslipase (PL) (von Boehringer Mannheim GmbH), Lipoproteinlipase (LPL) aus Humanserum und Kuhmilch, sowie menschliches Serum und Muttermilch; mikrobielle Lipasen aus: Chromobakterium viscosum, Candida rugosa, Rhizopus arrhizus, Pseudomonas species (von Nagase Biochemicals, Ltd., Japan), Geotrichum candidυm.
ERSATZBLÄTT (REGEL 26) Beispiel 18
Bestimmt wurde der Einfluß von Salzen und Detergentien auf die Lipaseaktivität von Lipoproteinlipase.
Verwendeter Komplex: Herstellung und Zusammensetzung wie unter Beispiel 17 beschrieben.
Verwendete Lipoproteinlipase: LPL aus Kuhmilch.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 zusammengestellt:
Tabelle 2
Additive Aktivität [pmol/ml/min] ohne 18
0, 1 M NaCI 26
10 mM CaCI2 30
20 mM Triton 22
10 mM CaCI2 + 20 mM Triton 40
Beispiel 19
Wie unter Beispiel 13 beschrieben, wurden die Aktivitäten von jeweils 20 μ\ menschlichen Plasmas vor und nach Heparinisierung eines normolipämischen
Spenders (60 U/kg Körpergewicht, Blutabnahme nach 25 min) durchgeführt. Serumlipaseaktivität vor Heparinisierung: gering bis keine Aktivität Serumlipaseaktivität vor Heparinisierung: 60 pmol/ml/min
Beispiel 20
Der unter Beispiel 12 in wäßrigem Medium erhaltene Komplex aus fluorogenem Substrat und Rinderserumalbumin wird bei -75°C eingefroren und anschließend lyophilisiert.
Beispiel 21
Wie unter Beispiel 20 beschrieben, wurde ein Lyophilisat aus Albumin und fluorogenem Substrat hergestellt, wobei als wäßriges Medium eine Lösung von 25 mg Glykogen in 3 ml 10 mM HEPES, pH 7,4 (pH-Einstellung mit NaOH), verwendet wurde.
Beispiel 22
Wie unter Beispiel 20 beschrieben, wurde ein Lyophilisat aus Albumin und fluorogenem Substrat hergestellt, wobei als wäßriges Medium eine Lösung von 25 mg Saccharose in 3 ml 10 mM Na-Phosphatpuffer, pH 7,4, verwendet wurde.
Beispiel 23
Wie unter Beispiel 20 beschrieben, wurde ein Lyophilisat aus Albumin und fluorogenem Substrat hergestellt, wobei als wäßriges Medium eine Lösung von
25 mg Stärke in 3 ml PBS (2 g KCl, 2 g KH2P04, 80 g NaCI und 21 ,6 g NA2HP04Η20 in 1 Liter H20), pH 7,4, verwendet wurde.
Beispiel 24
Die unter Beispiel 20-23 hergestellten Lyophilisate wurden in 9 ml H2Odest gelöst. Jeweils 3 ml Aliquots wurde für die Aktivitätsbestimmung von LPL wie unter Beispiel 1 1 beschrieben, verwendet. Die Resultate können der Tabelle 3 ent¬ nommen werden: Tabelle 3
Lyophilisat Aktivität (pmol/ml/min) aus Tris/HCI 7 aus HEPES + Glykogen 1 2 aus Phosphatpuffer + Saccharose 10 aus PBS + Stärke 13

Claims

Patentansprüche
1 . Racemate und Enantiomere der allgemeinen Formel
R A— X— CH-
R, _ B — Y— CH
R., C— Z— CH,
worin R1 # R2 und R3 Alkyl- oder Alkenylketten mit 2 bis 26 C-Atomen, wobei die Anzahl der Doppelbindungen 0 - 6 betragen kann, X, Y und Z -S-, -0-, -NH- oder auch -CH2-, A, B, C, 0
-C- oder -CH2- bedeuten, dadurch gekennzeichnet, daß jeweils eine der Seitenketten R R2 und R3 einen Fluorophor als molekularen optischen Sensor und ein anderer Rest R1 # R2 und R3 einen Quencher enthält, wobei alle chromogenen und fluorogenen Substituenten Quencher sein können, deren Absorptionsspektrum mit dem Emissionsspektrum des Fluorophors, der als molekularer optischer Sensor verwendet wird überlappt, und die somit als Resonanzenergietransfer (RET)-Akzeptoren für den Sensor- Fluorophor (RET-Donor) in Frage kommen.
2. Verbindungen nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß als fluo¬ reszierende Gruppen Pyren, Perylen, Anthryl, Anthraniloyi, Saliciloyl, Tetracen, Anthracen, Phenantren, Naphthalen, Cumaron, Cumarin, Acri- din, Aminonaphtolsulfonsäure, Phenyloxadiazol, Diphenyloxazol, Alloxa- zin, Stilben, Dibenzopyron, Fluoren, Fluorenon, p-Quinon, Methylumbelli- feron, Trinitrophenylamin, Phenazin, Phenylindol, Quinolin, Diphenylacety- len, Benzothiophen, Cyanothiocarbonyle, 1 ,3,5,7-Dekatetraen, Rhodamin,
Diphenylhexatrien, Dansyl, 7-Nitrobenz-2-oxa-1 ,3-diazol (NBD), Benzo- carbazon, Dibenzofuran, Parinarsäure, 4,4-Difluoro-4-bora-3a-4a-diaza-5-
-indacen verwendet werden. 3. Verbindungen nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als quenchende Gruppen Trinitrophenylamin oder Pyren, Perylen, Anthryl, Anthraniloyl, Saliciloyl, Tetracen, Anthracen, Phenantren, Naphthalen, Cumaron, Cumarin, Acridin, Aminonaphtholsulfonsaure, Phenyloxadiazol, Diphenyloxazol, Alloxazin, Stilben, Dibenzopyron, Fluoren, Fluorenon, p- Quinon, Methylumbelliferon, Phenazin, Phenylindol, Quinolin, Diphenyla- cetylen, Benzothiophen, Cyanothiocarbonyle, 1 ,3,5,7-Dekatetraen, Rho- damin, Diphenylhexatrien, Dansyl, 7-Nitrobenz-2-oxa-1 ,
3-diazol (NBD), Benzocarbazon, Dibenzofuran, Parinarsäure, 4,
4-Difluoro-4-bora-3a,4a- diaza-5-indacen verwendet werden, wobei deren Absorptionsspektren den Bedingungen von Anspruch 1 entsprechen müssen.
Racemat und Enantiomere von O-Alkyl-diacyl-glycerolen, Di-O-alkyl-acyl- glycerolen und Triacylglycerolen nach Anspruch 1 , 2 und 3.
5. Racemat und Enantiomere der Verbindung nach Anspruch 1 , 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Formel
Figure imgf000024_0001
hat.
1 -0-Dodecyl-2-pyrendecanoyl-3-(2',4',
6'-trinitrophenylaminododecanoyl)- sn-glycerol.
ERSATZBLÄΓT (REGEL 26)
7. 1 -(2',4',6'-Trinitrophenylaminododecanoyl)-2-pyrendecanoyl-3-0-dodecyl- sn-glycerol.
8. 1 -0-Tetradecyl-2-0-pyrendecyl-3-(2',4',6'-trinitrophenylaminohexanoyD- sn-glycerol.
9. 1 -(2',4,,6'-Trinitrophevlaminohexanovl)-2-0-pyrendecvl-3-0-tetradecyl-sn- glycerol.
10. rac.1 -Oleoyl-2-pyrendodecanoyl-3-(2',4',6'-trinitrophenylaminododeca- noyl)-glycerol.
1 1 . 1 -(2',4',6'-Trinitrophenylaminododecanoyl)-2-pyrendodecanoyl-3-oleoyl- sn-glycerol.
12. 1 -Oleoyl-2-pyrendodecanoyl-3-(2',4',6'-trinitrophenylaminododecanoyl)- sn— glycerol.
13. rac.1 -Pyrendecanoyl-2-0-hexadecyl-3-(2',4',6'-trinitrophenylaminododeca- noyl)-glycerol.
14. rac.1 -Tetradecanoylamino-2-pyrendecanoyl-3-(2',4',6'-trinitrophenylami- nododecanoyU-propandiol.
15. Racemate und Enantiomere von Alkylacyl-, Dialkyl- und Diacyltrityl-glyce- rolen nach den Ansprüchen 1 , 2, 3 und 4, die die Formel
RT — O— CH
R, •O— CH
Tr — 0— CH,
Tr = Trityl (Triphenylmethyl)
ERSATZBLÄΓT (REGEL 26) haben, dadurch gekennzeichnet, daß ein Radylrest R, oder R2 einen Fluo¬ rophor und ein anderer Radylrest R2 oder R, einen Quencher kovalent gebunden enthält.
1 6. Verfahren zur Herstellung von Triacyl-, Alkyldiacyl- und Dialkylacylglycero- len, dadurch gekennzeichnet, daß in den entsprechenden Alkylacyltrityl- glycerolen, Dialkyltritylglycerolen oder Diacyltritylglycerolen die Trityl¬ gruppe durch eine Acylgruppe in Gegenwart von Bortrifluorid-Etherat als Katalysator in einer Einstufenreaktion ersetzt wird.
17. Verfahren zur Herstellung der neuen enantiomeren Triglyceridanalogen 1 - 0-Hexadecvl-2-pvrendecanovl-3-trinitrophenvlaminododecanoyl-sn-glyce- rol, 1 -0-Hexadecvl-2-pyrendecyl-3-trinitrophenvlaminododecanoyl-sn- glycerolund 1 -0-Hexadecarιoyl-2-pyrendecanoyl-3-trinitrophenylaminodo- decanoyl-sn-glycerol, dadurch gekennzeichnet, daß in den entsprechenden
Alkylacyltritylglycerolen, Dialkyltritylglycerolen oder Diacyltritylglycerolen die Tritylgruppe durch eine Acylgruppe in Gegenwart von Bortrifluorid- Etherat als Katalysator in einer Einstufenreaktion ersetzt wird.
18. Wasserlösliche Komplexe fluorogener Verbindungen nach einem der
Ansprüche 1 bis 1 5, dadurch gekennzeichnet, daß das fluoreszierende Lipid mit wasserlöslichen lipidbindenden Proteinen, bevorzugt mit Rinder¬ serumalbumin, Humanserumalbumin, Ovalbumin, Lactalbumin, Casein, Apolipoproteinen, oder durch Acylierung, Alkylierung, Hydroxymethylie- rung, Carboxymethylierung oder Carboxylierung modifizierten Proteinen in wäßriger Lösung solubilisiert ist.
1 9. Lyophilisate von wasserlöslichen Lipid-Protein-Komplexen nach Anspruch 1 8.
20. Wasserlösliche Komplexe der enantiomeren Triglyceridanaloga 1 -0-Hexa- decyl-2-pyrendecanoyl-3-trinitrophenylamino-dodecanoyl-_sn,-glycerol, 1 - 0-Hexadecyl-2-pyrendecyl-3-trinitrophenylaminododecanoyl--srv-glycerol und 1 -0-Hexadecanoyl-2-pyrendecanoyl-3-trinitrophenylaminododecanoyl- sn-glycerol, dadurch gekennzeichnet, daß diese Lipide mit wasserlöslichen lipidbindenden Proteinen, bevorzugt mit Rinderserumalbumin, Humanse- rumalbumin, Ovalbumin, Lactalbumin, Casein, Apolipoproteinen, oder durch Acylierung, Alkylierung, Hydroxymethylierung, Carboxymethylie- rung oder Carboxylierung modifizierten Proteinen in wäßriger Lösung solubilisiert sind.
21 . Lyophilisate von wasserlöslichen Lipid-Protein-Komplexen nach Anspruch 20.
22. Lyophilisate nach den Ansprüchen 19 und 21 , die in Gegenwart von Zusätzen, bevorzugt Stärke, Glykogen organischen und anorganischen Salzen, Saccharose hergestellt werden.
23. Fluorimetrische Bestimmung von Lipaseaktivitäten, gekennzeichnet da¬ durch, daß man Komplexe der fluorogenen Substrate mit wasserlöslichen Proteinen nach den Ansprüchen 18 und 20 oder Lösungen der Lyophilisa¬ te nach den Ansprüchen 19 und 21 in wäßriger Pufferlösung einem fettspaltenden Enzym anbietet und die Enzymaktivität über die Verände¬ rung eines Fluoreszenzparameters, bevorzugt über den Anstieg der Fluo¬ reszenzintensität des Sensor-Fluorophors bestimmt.
24. Fluorimetrische Bestimmung von Lipaseaktivitäten, gekennzeichnet da- durch, daß Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 15 solubilisiert in Phospholipid-Liposomen, Vesikeln, Detergens-Micellen oder Emulsionen, Lösungen in organischen Lösungsmitteln oder Gemischen organischer Lösungsmittel mit Wasser der Lipase anbietet und die Enzymaktivität über die Veränderung eines Fluoreszenzparameters, bevorzugt über den An- stieg der Fluoreszenzintensität des Sensor-Fluorophors bestimmt.
25. Verwendung der Bestimmungsmethoden nach Anspruch 23 oder 24 in der medizinischen Diagnostik zur klinischen Lipaseanalytik bevorzugt im menschlichen Serum, Plasma und Fettgewebe nach oder ohne Heparinisie¬ rung des Spenders, bei pathologischen Erscheinungsformen wie Karzinom, Adipositas, Hyperlipidämie, Alkoholismus, Hepatitis, Pankreatitis sowie bei gesunden Spendern, zur Lipaseanalytik bei der biotechnologischen Lipaseproduktion, für das Screening von Lipasen aus tierischen, pflanzli¬ chen und mikrobiellen Material, sowie chemisch und gentechnologisch modifizierter oder produzierter Lipasen, als auch bei ernährungswissen¬ schaftlichen und lebensmittelchemischen Untersuchungen, bevorzugt für das Screening von Lipasen und Lipaseinhibitoren.
26. Verfahren zum Screening der Stereospezifität von Lipasen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aktivität der Lipasen an beiden Enantiome¬ ren der fluorogenen Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 1 5 mit einem Verfahren nach Anspruch 22 oder 23 bestimmt.
27. Kit zur Aktivitätsbestimmung von Lipasen, insbesondere Lipoprotein-, hepatische und pankreatische Lipasen, umfassend eine Lipase, insbeson¬ dere eine Lipoprotein-, hepatische und/oder pankreatische Lipase, als Positivkontrolle und ein oder mehrere Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 15 sowie übliche Hilfsstoffe.
ERSATZBLÄTT (REGEL 26)
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002042497A2 (en) * 2000-11-27 2002-05-30 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods using fluorescens energy transfer probes for detecting cleavage of nucleic acids
WO2017040983A1 (en) * 2015-09-03 2017-03-09 The University Of Chicago Systems and methods for characterization of hypertriglyceridemia
US9957546B2 (en) 2008-03-04 2018-05-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Vivo detection of phospholipase activation

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0037583A1 (de) * 1980-04-09 1981-10-14 KSV-Chemicals Oy Verfahren zur fluorimetrischen Bestimmung der Aktivität von fettspaltenden Enzymen und Mittel zur Durchführung dieses Verfahrens

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0037583A1 (de) * 1980-04-09 1981-10-14 KSV-Chemicals Oy Verfahren zur fluorimetrischen Bestimmung der Aktivität von fettspaltenden Enzymen und Mittel zur Durchführung dieses Verfahrens

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. NEGRE ET AL.: "Hydrolysis of fluorescent pyrenetriacylglycerols by lipase from human stomach and gastric juice", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, vol. 963, 1988, pages 340 - 348 *
E. GRUND ET AL.: "Conformational effects on the fluorescence of pyrene-labeled alkyldiacyl glycerols in different model membranes", JOURNAL OF FLUORESCENCE, vol. 4, no. 4, 1994, pages 365 - 366 *
T. THUREN ET AL.: "Phospholipase A2 assay using an intramolecularly quenched pyrene-labeled phospholipid analog as a substrate", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, vol. 170, no. 1, 1988, pages 248 - 255 *
T. THUREN, P. J. KINNUNEN: "A continuous fluorometric assay for phospholipase C from Clostridium perfringens", CHEMISTRY AND PHYSICS OF LIPIDS, vol. 59, 1991, pages 69 - 74 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002042497A2 (en) * 2000-11-27 2002-05-30 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods using fluorescens energy transfer probes for detecting cleavage of nucleic acids
WO2002042497A3 (en) * 2000-11-27 2003-02-06 Sloan Kettering Inst Cancer Methods using fluorescens energy transfer probes for detecting cleavage of nucleic acids
US9957546B2 (en) 2008-03-04 2018-05-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Vivo detection of phospholipase activation
US11034994B2 (en) 2008-03-04 2021-06-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania In vivo detection of phospholipase activation
WO2017040983A1 (en) * 2015-09-03 2017-03-09 The University Of Chicago Systems and methods for characterization of hypertriglyceridemia

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