DE69225794T2 - Test zur bestimmung von estersubstraten - Google Patents

Test zur bestimmung von estersubstraten

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Description

    Hintergrund der Erfindung 1. Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft einen quantitativen Assay, der auf klinische Proben angewendet werden kann, für Substrate, die eine enzymatische Hydrolyse unter Freisetzung von langkettigen Fettsäuren erleiden können. Die Erfindung ist insbesondere, obwohl nicht ausschließlich, auf Estersubstrate, wie die Triglyceridsubstrate für Lipase und Phospholipidsubstrate für die Phospholipasen, gerichtet.
    • 2. Beschreibung des Standes der Technik
  • Ester, wie die Tri- und Diglyceride, sind ubiquitär und hinsichtlich jedes Aspekts von Zellmembranfunktion und Energietransfer von fundamentaler Bedeutung. Der Assay dieser Bestandteile ist dementsprechend in vielen Bereichen der klinischen Diagnose von Interesse. Dementsprechend kann beispielsweise ein Assay des Triglyceridgehalts einer klinischen Probe einen gewissen Hinweis auf die unlängst erfolgte Fettaufnahme über die Nahrung und die Fähigkeit der Leber, Fette für eine Energienutzung zu metabolisieren, liefern. Jedoch beruhen gegenwärtig verfügbare Verfahren zum Assay von Triglyceriden, wie jene, die kommerziell als Kits von der Sigma Chemical Co. Ltd. (Poole, Dorset, Vereinigtes Königreich) erhältlich sind, auf der Messung von durch enzymatische Hydrolyse freigesetztem Glycerol. So werden in der Sigma-Prozedur Nr. 405 Triglyceride in Isopropanol extrahiert und mit Kaliumhydroxid verseift. Freigesetztes Glycerol wird dann durch Periodat zu Formaldehyd umgewandelt. Durch Umsetzen mit Acetylaceton bildet das Formaldehyd gelbes Diacetyldihydrolutidin, das kolorimetrisch gemessen wird.
  • In den Sigma-Prozeduren Nr. 336, 337, 339 und 334 wird Glycerol aus Triglycerid enzymatisch unter Verwendung von Lipase freigesetzt, und Glycerol wird weiter mit ATP umgesetzt, um Glycerol-1-phosphat zu bilden. Die vier Methoden unterscheiden sich dann nur in dem Weg, durch welchen das Glycerol-1-phosphat weiter umgesetzt wird, um eine Extinktionsveränderung zu erzeugen, die spektrophotometrisch gemessen werden kann. Solche Assays leiden bei einer Anwendung auf klinische Proben unter dem Nachteil, daß, da Glycerol selbst ein Produkt des Zellmetabolismus ist, der Assay des Glycerolgehalts einer Blutprobe nicht ein genaues Bild der zirkulierenden Triglyceridkonzentrationen in dem Patienten liefern kann (siehe Cole, din. Chem. 36/7, 1267-1268 (1990)). Es besteht eindeutig ein Bedürfnis für die Entwicklung alternativer Mittel für die Bestimmung von Triglyceriden und anderen verwandten Substraten, wie Phospholipiden und Cholesterolestern, die genaue Ergebnisse bei geringen Konzentrationen oder in kleinen klinischen Blutproben liefern.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Es ist jetzt gefunden worden, daß derartige Substrate quantitativ in Albumin-enthaltenden klinischen Proben, wie Serum, schnell und empfindlich bestimmt werden können, indem veranlaßt wird, daß das geeignete Enzym auf das Substrat unter Freisetzung von Fettsäure (n) einwirk, und man dann die Bindung der freigesetzten Fettsäuren an ein Protein, das Fettsäuren mit hoher Affinität (mit einer Dissoziationskonstante von 10&supmin;&sup5;M oder weniger) bindet, nachweist oder mißt. Sehr wünschenswert ist ein solches Protein, das als Fettsäure-bindendes Protein ("fatty acid binding protein"; FABP) bekannt ist, welches ein beispielsweise aus der Leber von Tieren extrahierbares natürliches Produkt ist. Nachfolgend wird die Erfindung unter Bezugnahme auf FABP beschrieben, aber es versteht sich, daß FABP durch andere Bindungsproteine des beschriebenen Typs ersetzt werden kann. Zusätzlich wird die Erfindung unter Bezugnahme auf Serum als klinische Probe beschrieben, obwohl es sich versteht, daß die Erfindung auf andere klinische Proben, wie Voliblut und Plasma, wie auch auf teilweise gereinigte Fraktionen, die von diesen abgeleitet sind, anwendbar ist. Der Assay der Fettsäure/FABP-Bindungs-Wechselwirkung wird am bequemsten ausgeführt, indem eine markierte Sonde, tatsächlich eine markierte Fettsäure, die mit der durch die Wirkung von Lipase freigesetzten Fettsäure in Kompetition um die Bindungsstellen auf dem FABP tritt, verwendet wird. Adäquaterweise wird dann die Menge an freier Markierung, d.h. jener, die nicht an das FABP gebunden ist, gemessen.
  • Aus den Beobachtungen des Standes der Technik konnte erwartet werden, daß das in derartigen klinischen Proben vorliegende Albumin mit der Wirksamkeit des Assays interferieren würde, sofern es nicht entfernt würde. So weisen frühere Ergebnisse, die in Biochem. J. (1990), 266, 435-439 und Biochem. J. (1990), 270, 163-166 angegeben sind, darauf hin, daß Serumalbumin Stellen aufweist, die Fettsäuren binden können. In überraschender Weise ist jedoch festgestellt worden, daß der Substrat-Assay der Erfindung von ausreichend hoher Empfindlichkeit ist, um die Notwendigkeit einer vorab erfolgenden Entfernung von kompetitierendem Protein, wie Albumin, zu umgehen. Es war gleichfalls überraschend, daß der auf Enzym basierende Substrat-Assay der Erfindung vollständig abläuft und dies ausreichend schnell, um eine quantitative Bestimmung der vorliegenden Menge an Substrat zu ermöglichen.
  • Dementsprechend wird in der Verkörperung der vorstehend aufgeführten Prinzipien ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung eines Substrats, das eine enzymatische Hydrolyse unter Freisetzung von langkettigen Fettsäuren erleiden kann, in einer Albumin enthaltenden klinischen Probe, bereitgestellt, welches umfaßt, die Albumin enthaltende klinische Probe mit einem Enzym zu inkubieren, das auf das zu bestimmende Substrat einwirkt, unter Bedingungen, die wirksam sind zur Freisetzung von Fettsäure daraus, wobei veranlaßt wird, daß die so freigesetzte Fettsäure an ein Fettsäure bindendes Protein bindet, und die Bindung der Fettsäure an das Fettsäure bindende Protein zu bestimmen.
  • Die Erfindung umfaßt auch einen Kit zum Ausführen eines Assays, der im wesentlichen als den einzigen Reagentien davon aus dem Fettsäure-bindenden Protein (FABP) und einem Enzym, das in der Lage ist, das zu bestimmende Substrat unter Freisetzung von langkettigen Fettsäuren zu hydrolysieren, und einer Sonde, die an das FABP in Kompetition mit den in der enzymatischen Reaktion freigesetzten Fettsäuren bindet und mittels welchem das Ausmaß der kompetitiven Bindung gemessen werden kann, besteht.
    • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Der Assay der Erfindung ist im Prinzip auf das Serum jedes Säugetieres anwendbar, ist jedoch selbstverständlich hauptsächlich in Bezug auf Menschen von Interesse.
  • Ein wichtiger weiterer Zweck der Erfindung besteht darin, die Konzentration von Triglyceriden im Blut nachzuweisen und/oder zu überwachen. Der Assay ist gleichfalls beispielsweise für die Bestimmung von Cholesterolestern in Serum unter Verwendung einer geeigneten Cholesterolesterase und für die Bestimmung von Phospholipiden unter Verwendung von Phospholipase A2 anwendbar.
  • Aufgrund der Möglichkeit, daß Albumin eine kompetitive Rolle in dem Assay ausübt, würde es, wie vorstehend erläutert, normalerweise erforderlich erscheinen, es zu entfernen. Aufgrund der hohen Empfindlichkeit des Assays hat es sich jedoch ergeben, daß dies nicht erforderlich ist. Vorzugsweise umfaßt die klinische Probe 1 ul oder weniger, geeigneterweise 0,1 bis 1 ul, um jegliche Wirkungen des Albumins zu minimieren.
  • Die Albumin enthaltende Serumprobe wird mit dem Enzym bei jeder beliebigen Temperatur inkubiert, die wirksam ist, daß die enzymatische Hydrolyse stattfindet. Am geeignetsten wird Raumtemperatur (20-25ºC) verwendet, aber es können Temperaturen von 15-40ºC normalerweise eingesetzt werden.
  • Es versteht sich, daß in der zweiten Stufe des Assays das geeignete Enzym zugesetzt wird. So kann ein Überschuß an Lipase verwendet werden, um die Menge an Triglycerid in der Assay-Probe zu bestimmen. Cholesterolesterase kann bei der Bestimmung von Cholesterolestern eingesetzt werden. Phospholipase A2 kann bei der Bestimmung von Phospholipiden eingesetzt werden.
  • Das Fettsäure-bindende Protein (FABP) wird gleichfalls der Inkubationsmischung vor, während oder nach der Zugabe des Enzyms zugesetzt. Es können verschiedene Typen von FABP eingesetzt werden. Sie sind vorzugsweise cytosolisch und werden normalerweise durch das Gewebe bezeichnet, aus dem sie isoliert wurden, z.B. Dünndarm, Herzmuskel, Leber und Fettgewebe. Hepatisches FABP ist bevorzugt und wird geeigneterweise aus der Leber von Tieren, beispielsweise aus Ratten, Schweinen oder Rindern, extrahiert. Ein bevorzugtes Extraktionsverfahren ist jenes, das von D.C. Wilton in Biochem. J. 261, 273-276 (1989) beschrieben worden ist. Das FABP muß kein Naturprodukt sein. Es kann ein synthetisches Analog sein, das Säuren bindet, oder es kann das Analog eines Naturprodukts, das durch ein rekombinantes DNA- Verfahren erhalten worden ist, sein, z.B. das FABP aus Rattenleber, das durch Expression des Gens in E. coli produziert worden ist (siehe J.B. Lowe et al., J. Biol. Chem. 259, 12696-12704 (1984) und A.F. Worrall et al., Biochem. J. 278, 365-368 (1991). Es können jegliche Inkubationsbedingungen verwendet werden, die wirksam sind, um die durch die Lipase freigesetzte Säure zu binden. Allgemein gesagt, können die gleichen Temperaturen wie in der Hydrolysestufe eingesetzt werden.
  • Es ist auch erforderlich, nachzuweisen, daß eine Säure-FABP- Bindung stattgefunden hat. Das bevorzugte Mittel, um dies vorzunehmen, besteht in einem Kompetitions-Assay, indem man eine kompetitive Fettsäure-Spezies mit der durch das Enzym freigesetzten Fettsäure um eine beschränkte Anzahl von Bindungsstellen auf dem FABP kompetitieren läßt. Die kompetitive Spezies wird hier als "Sonde" bezeichnet. Sie kann einen Markierungsabschnitt und einen langkettigen aliphatischen Abschnitt, der mit einer Säuregruppe verbunden ist, und typischerweise 9-19 Kohlenstoffatome ausschließlich der Säuregruppe aufweist, umfassen. Der Markierungsabschnitt kann beispielsweise ein Fluorophor, Chromophor oder Luminophor sein. Radioaktive Markierungen sind weniger bevorzugt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Markierung ein polycyclisches Fluorophor, insbesondere ein Naphthalin oder Anthracen mit einer Polaritäts-empfindlichen fluoreszierenden Grupe. Eine Polaritäts-empfindliche fluoreszierende Gruppe ist eine, die eine Veränderung in ihrer Fluoreszenzemission (Quantenausbeute und Wellenlängenmaximum) durchläuft, wenn sie sich von einer polaren zu einer nicht-polaren Umgebung fortbewegt. Es ist eine große Veränderung hinsichtlich des Fluoreszenzsignals bei einer festgelegten Wellenlänge zu beobachten, wenn sich die Sonde aus der nicht-polaren Mikroumgebung des FABP-Moleküls zu einer polaren Mikroumgebung (dem Assay-Medium, das normalerweise wäßrig ist) bewegt. Die Sonde ist negativ geladen und liegt dementsprechend normalerweise als ein Säuresalz vor. Insbesondere bevorzugte derartige Sonden sind jene der Formel:
  • Pc - Z - NH - (CH&sub2;)n - X&supmin;, in welcher:
  • Pc für einen Naphthalin- oder Anthracen-Rest steht;
  • Z für -CO- oder -SO&sub2;- steht; und
  • X für das Anion einer Säuregruppe, vorzugsweise COO&supmin;, steht.
  • n ist 4 bis 24, vorzugsweise 8 bis 19, insbesondere 8 bis 12.
  • Salze von 11-(Dansylamino)undecansäure (DAUDA) der Formel:
  • sind besonders bevorzugt. Es ist bekannt, daß diese Sonde an FABP in Kompetition mit Fettsäuren bindet (siehe T.C.I. Wilkinson und D.C. Wilton, Biochem. J. 247, 485-488 (1987)). Jedoch war es überraschend, festzustellen, daß eine vollständige und rasche Reaktion auftrat, die quantitativ durch Beobachten der Veränderung des Fluoreszenzsignals bestimmt werden konnte, wenn es in Kombination mit einem System eingesetzt wurde, welches ein Substrat und ein Enzym, das in der Lage ist, das Substrat unter Freisetzung langkettiger Fettsäuren zu hydrolysieren, umfaßte. Andere Fluorophore, die verwendet werden können, sind 9-Anthroyloxy-Fettsäuren (siehe J. Storch et al., J. Biol. Chem. 264, 8708-8713, (1989)) und cis-Parinarsäure (eine Polyen-Fettsäure) (siehe H.J.K. Keuper et al., Chem. Phys. Lipids 38, 159- 178 (1985)).
  • Alternativ kann eine kolorimetrische Sonde, wie Hämin, eingesetzt werden. Ein derartiges Molekül bindet gleichfalls an FABP in Kompetition mit der durch das Enzym freigesetzten Fettsäure, und eine Farbveränderung kann spektrophotometrisch bestimmt werden. Andere Chromophore, die verwendet werden können, umfassen Bilirubin.
  • Alternativ braucht die "Sonde" selbst keinen Markierungsabschnitt zu umfassen und kann indirekt bestimmt werden. Anstatt dessen kann die Sonde selbst als Verstärker, Inhibitor, Cofaktor oder andersartiges Auslöser- oder Vermittlermolekül wirken, das in der Lage ist, eine geeignete Indikatorreaktion bei einer Verdrängung von dem FABP zu modulieren.
  • Ein weiterer alternativer Assay umfaßt, dem Assay-Medium eine markierte Säure, z.B. mittels ¹&sup4;C oder ³H radioaktiv markiert, oder eine, an die ein Chromophor angeheftet worden ist, zuzusetzen und die Menge an markierter Säure zu messen, die nach einer Kompetition zwischen der durch die Lipase freigesetzten Säure und der markierten Säure um eine begrenzte Menge an FABP in Lösung bleibt. Die markierte Säure kann gemessen werden, indem sie auf Lipidex 1000 unlöslich gemacht wird (siehe J.F.C. Glatz und J.H. Veerkamp, Anal. Biochem. 132, 89-95 (1983)), das Lipidex 1000 von dem Assay-Medium abgetrennt wird und die Menge von markiertem Material darauf bestimmt wird.
  • Die Spezies für den Kompetitions-Assay kann der Assay-Mischung vor, gleichzeitig mit oder nach der Fettsäure und vor oder nach Zugabe des Enzyms zugesetzt werden. Der Assay wird als "kompeti-tiv" angesehen, wenn eine Spezies die andere von dem FABP verdrängt, um eine Gleichgewichtsposition hinsichtlich der reversiblen Bindungsreaktion zu erzielen. Wenn die kompetitierende Spezies an das FABP bindet, kann die Bindung auf verschiedene Weisen gemessen werden. Im Falle eines Polaritäts-empfindlichen Fluorophors wird leicht die Veränderung der Fluoreszenz verfolgt. Veränderungen hinsichtlich der Farbe und Intensität eines Chromophors oder der Intensität eines Luminophors sind gleichfalls einer Messung zugänglich. Alternativ ist es möglich, die FABP-Sonde-Spezies zu präzipitieren, das Präzipitat abzutrennen und die Menge an Markierung, die an das FABP gebunden ist, oder die Menge an freier Markierung, die in Lösung zurückbleibt, zu messen. Dies könnte beispielsweise mittels eines immobilisierten Antikörpers gegen das FABP oder durch Koppeln des FABP direkt an ein unlösliches Material, wie Agarose, erfolgen.
  • Bei einer alternativen Vorgehensweise wird der Fettsäureester in der Säuregruppierung markiert, z.B. indem sie an eine fluoreszierende Reporter-Gruppe gebunden wird, und die Menge an Bindung der freigesetzten fluoreszierenden Fettsäure an das FABP wird durch eine geeignete spektrale Veränderung, die bei einer Bindung auftritt, gemessen.
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
    • Beispiel 1
  • Eine Substrat und die fluoreszierende Sonde enthaltende Pufferlösung wurde, wie folgt, hergestellt:
  • Zu 20 ml 0,1 M Tris-Puffer, pH 8,0, enthaltend 0,1 M NaCl, in einem Sterilin-Röhrchen wurden 0,05 ml 11-(Dansylamino)undecansäure (DAUDA) (0,38 mM) in Methanol zugesetzt. Die Mischung wurde kurz geschüttelt. 2 ml dieser Assay-Lösung wurde einer 4 ml-Einweg-Fluorimeterküvette aus Kunststoff zugesetzt, die dann in ein Perkin-Elmer LS 3B-Fluorimeter bei Raumtemperatur eingesetzt wurde. Die Anregungswellenlänge betrug 350 nm und die Fluoreszenz wurde bei 500 nm gemessen. Die Maschine wurde auf Null abgeglichen, so daß man keine Fluoreszenzablesung erhielt. 0,02 ml eines 70 % Ammoniumsulfat-gesättigten Überstands eines E. coli-Lysats, enthaltend rekombinantes FABP aus Rattenleber (1 mg/ml), gewonnen aus der Expression eines synthetischen Gens für dieses Protein, wurde zugesetzt.
  • 0,02 ml einer Serumprobe (erhalten von dem Pathology Laboratory, Southampton General Hospital) wurde auf 1 ml mit destilliertem Wasser, enthaltend 0,1 % des nicht-ionischen Detergens Triton X-100, verdünnt. 0,01 ml dieser verdünnten Serumprobe wurde der Assay-Mischung zugesetzt. Die Empfindlichkeit des Fluorimeters wurde so eingestellt, daß eine Anzeige von ungefähr 90 % auf dem Aufzeichnungsgerät erhalten wurde, und die anfängliche Anzeige notiert.
  • Ein Überschuß an Lipase (0,005 ml) aus Rhizopus arrhizus wurde zugesetzt (6250 Einheiten). Innerhalb von 30 s wurde bei Raumtemperatur ein schneller Abfall der Fluoreszenz festgestellt und dieser Wert festgehalten, obwohl die Reaktion über eine Inkubationsdauer von 1-2 min überwacht wurde, während der ein langsamerer Abfall der Fluoreszenz festgestellt wurde (es wird angenommen, daß dies auf eine Hydrolyse des 2-Monoglyceridproduktes der primären Hydrolyse zurückzuführen ist). Eine Kalibrierung kann erzielt werden, indem Ölsäure in der vollständigen Assay-Mischung in Abwesenheit von Lipase titriert wird oder, was bequemer ist, Serumproben mit vorher bestimmter Triglyceridkonzentration verwendet werden.
  • Fig. 1 zeigt die Fluoreszenz-Verdrängungs-Aufzeichnungen für drei Serumproben a), b) und c). In jedem Falle wurde die Veränderung in der Fluoreszenz nach 30 s gemessen und, wie ersehen werden kann, betragen diese Veränderungen (ΔF) für a) 22 Einheiten, b) 47 Einheiten und c) 10 Einheiten.
  • Unter Verwendung der Probe a) (von welcher durch die Quelle berichtet wird, daß sie 3,7 mM Triglycerid aufweist) für eine Kalibrierung entspricht dies Triglyceridwerten für a) von 3,7 mM, für b) von 8-9 mM und für c) von 1,68 mM.
    • Beispiel 2
  • Zu 1 ml 0,1 M Tris-Puffer, pH 8,0, enthaltend 0,1 M NaCl, in einer Kunststoff-Spektrophotometerküvette wurde 0,01 ml 0,4 mM Häm in 0,04 M Ammoniumhydroxid zugesetzt. Es wurde auch eine identische Leerwert-Küvette hergestellt und diese zwei Küvetten bei 405 nm auf Null abgeglichen, so daß sie keine Extinktion in einem Hitachi U2000-Spektrophotometer lieferten. 0,05 ml 70 % Ammoniumsulfat-gesättigter Überstand eines E. coli-Lysats, enthaltend rekombinantes FABP (1 mg/ml), gewonnen aus der Expression eines synthetischen Gens für dieses Protein, wurde der Reaktionsküvette und ein gleiches Volumen Wasser der Leerwert- Küvette zugesetzt. Bei 405 nm wurde eine erhöhte Extinktion aufgrund der Bindung von Häm an FABP aufgezeichnet.
  • 0,01 ml verdünntes Serum (äquivalent zu 0,2 ul Serum) wurde der Umsetzung zugesetzt, und nach Aufzeichnen der Extinktion wurde ein Überschuß an Lipase (0,005 ml) aus Rhizopus arrhizus zugesetzt (6250 Einheiten). Der Abfall der Extinktion bei 405 nm wurde über einen Zeitraum von 1-2 min aufgezeichnet.
  • Fig. 2 zeigt die Extinktions-Verdrängungs-Aufzeichnungen für zwei Serumproben a) und b), welche Triglyceridkonzentrationen von 3,7 mM bzw. 11,9 mM aufwiesen. In jedem Fall wurde die Extinktionsänderung nach 30 5 gemessen, und, wie festgestellt werden kann, betragen diese Veränderungen (ΔABS) für a) 0,006 und für b) 0,016.

Claims (12)

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung eines Substrates, das eine enzymatische Hydrolyse unter Freisetzung von langkettigen Fettsäuren erleiden kann, in einer Albumin enthaltenden klinischen Probe, umfassend das Inkubieren der Albumin enthaltenden klinischen Probe mit einem Enzym, das auf das zu bestimmende Substrat einwirkt, unter Bedingungen, die wirksam sind zur Freisetzung von Fettsäure daraus, wobei veranlaßt wird, daß die so freigesetzte Fettsäure an ein Fettsäure-bindendes Protein bindet, und Bestimmen der Bindung der Fettsäure an das Fettsäurebindende Protein.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Fettsäure-bindende Protein FABP ist und die Bindung zwischen FABP und der Fettsäure durch ein Verfahren bestimmt wird, bei dem man eine kompetitive Sonde, die an das FABP in Kompetition mit der Fettsäure bindet, mit dem FABP in Wechselwirkung treten läßt und die freie oder gebundene kompetitive Sonde dann direkt oder indirekt bestimmt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Sonde durch Fluoreszenz-Verschiebung bestimmt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Sonde ein Anion von 11- (Dansylamino) undecansäure ist.
5. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Sonde kolorimetrisch bestimmt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Sonde Hämin ist.
7. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Sonde als auslösende Verbindung dient, die eine Indikatorreaktion auf eine Verdrängung von dem FABP modulieren kann.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei das FABP aus der Leber stammt.
9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Bestimmung von Triglyceriden, wobei das Enzym Lipase ist.
10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die klinische Probe eine Serumprobe ist.
11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die klinische Probe 0,1 bis 1 ul umfaßt.
12. Kit zur Durchführung einer Bestimmung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bestehend im wesentlichen als einzigen Reagentien aus dem Fettsäure-bindenden Protein (FABP) und einem Enzym, das in der Lage ist, das zu bestimmende Substrat zu hydrolysieren zur Freisetzung von langkettigen Fettsäuren, und einer Sonde, die in Kompetition mit den bei der enzymatischen Reaktion freigesetzten Fettsäuren an das FABP bindet und mit deren Hilfe das Ausmaß der kompetitiven Bindung gemessen werden kann.
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