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Beschreibung
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Die Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen gekennzeichneten
Gegenstand.
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Zur quantitativen Analyse von freien Fettsäuren in Serum sind verschiedene
Methoden bekannt, zum Beispiel ein Verfahren, bei dem die durch ein fettlösendes
organisches Lösungsmittel extrahierte freie Fettsäure durch eine Neutralisationstitration
mit einem Alkali gemessen wird, und ein Verfahren, bei dem die freie Fettsäure mit
Kupfernitrat und Triäthanolamin behandelt wird unter Bildung eines Kupfersalzes
der freien Fettsäure, das mit Chloroform extrahiert und danach mit einem Chelatbildner
unter Farbentwicklung umgesetzt wird. Das erstgenannte Verfahren leidet jedoch unter
dem Problem einer vergleichsweise schlechten Reproduzierbarkeit wegen der erforderlichen
komplizierten Verfahrensmassnahmen mit organischen Lösungsmitteln, dem nachteiligen
Einfluss des Vorliegens organischer Säuren, den bei der Titrationsoperation unvermeidbaren
technischen Irrtümern und dergleichen, und das letztgenannte Verfahren weist Nachteile
auf aufgrund der komplizierten Verfahrensmassnahmen bei der Bildung der Kupfersalze,
bei der Handhabung organischer Lösungsmittel, der möglichen Schädigung des menschlichen
Körpers und dergleichen.
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Bei der klinischen Prüfung haben sich daher diese Verfahren als zu
kompliziert erwiesen, als dass sie für eine Standardisierung der einzelnen Bestimmungsverfahrensschritte
in Frage kämen.
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In jüngster Zeit wurde ein neues Verfahren bekannt, bei dem Acyl-Coenzym
A-Synthetase (hier und im folgenden wird Coenzym A als "CoA" abgekürzt) auf freie
Fettsäure einwirken gelassen und das dabei gebildete Adenosinmonophosphat (im folgenden
abgekürzt
als AMP) mit Hilfe von Myokinase, einem Pyruvatkinasesystem,
gemessen wird,(vgl. Takahashi et al, Rinsho Kagaku, 4, 179, 1975). Nachteilig an
diesem Verfahren ist jedoch, dass es instabile teuere Reagentien wie reduziertes
Nicotinamid-adenin-dinucleotid (im folgenden abgekürzt als NADH) und Phospho,enolbrenztraubensäure
sowie vier Arten von Enzymen erfordert, was technische Schwierigkeiten aufwirft,
weshalb sich dieses Verfahren in der Praxis bisher nicht durchsetzen konnte.
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Erfindungsgemäss werden die aufgezeigten Nachteile bei der Fettsäurebestimmung
behoben. Die bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens ablaufenden
enzymatischen Reaktionen lassen sich wie folgt darstellen: In den Gleichungen bedeuten:
(A) eine Acyl-CoA-Synthetase, (B) eine Acyl-CoA-Oxidase, die durch Mikroorganismen
erzeugt ist, RCOOH eine Fettsäure, worin R einen langkettigen Alkylrest mit 5 bis
22 Kohlenstoffatomen bedeutet, ATP ist Adenosintriphosphat, CoA ist Coenzym A, RCO
CoA ein Acyl-Coenzym A, AMP ist Adenosinmonophosphat, PPi ist Pyrophosphorsäure
und RrCH = CHCO CoA ein Enoyl-Coenzym A,wobei Rl dem Rest R entspricht, mit der
Ausnahme, dass die Gruppe -CH2CH2 - nicht vorliegt.
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Bei der erfindungsgemäss verwendeten Acyl-CoA-Synthetase handelt es
sich um Säure: CoA-Ligase (AMP) die auch als Feftsäurethiokinase (langkettig) bezeichnet
wird, deren Enzym-Codenummer E.C 6,2,1,3 ist. Dieses Enzym kommt in tierischen Organen,
zum Beispiel Rattenleber, Hühnerleber und dergleichen vor und ebenso in verschiedenen
Mikroorganismen, die zum Beispiel zu Escherichiacoli, Genus Pseudomonas, Genus Bacillus,
Genus Candida, Genus Nocardia und dergleichen gehören. Dieses Enzym spielt in der
ersten Verfahrensstufe des Fettsäure-B-Oxidationssystems eine Rolle bei der Umwandlung
von freier Fettsäure mit 5 bis 22, insbesondere 12 bis 18 Kohlenstoffatomen in Acyl-CoA
und der optimale pH-Wert liegt bei etwa 7,5 bis 9,0 und die Km (Michaelis-Konstante)
beträgt weniger als 10 4 M.
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Bei der erfindungsgemäss verwendeten, durch Mikroorganismen erzeugten
Acyl-CoA-Oxidase handelt es sich um einen Typ von Enzym, das bei der Einwirkung
auf Acyl-CoA in Gegenwart von Sauerstoff Enoyl-CoA und Wasserstoffperoxid zu erzeugen
vermag. Hochgereinigte Acyl-CoA-Oxidase wurde bisher nur aus Rattenleber gewonnen
(Proceedings of the Japanese Conference on the Biochemistry of Lipids, Band 20,
1978).
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Erfindungsgemäss gelang es jedoch, hochgereinigte Acyl-CoA-Oxidase
aus Mikroorganismen zu gewinnen, insbesondere aus Hefe, die zum Genus Candida gehört.
Dieses Enzym wird ausführlich in der japanischen Patentanmeldung Sho 54-24232 beschrieben.
Kurz gesagt, ist dieses Enzym dadurch charakterisiert, dass es (1) bei der Einwirkung
auf Acyl-CoA in Gegenwart von Sauerstoff die Bildung von Enoyl-CoA und Wasserstoffperoxid
bewirkt, (2) als Substrat Acyl-CoA, dessen Acylkomponente 5 bis 22 Kohlenstoffatome
aufweist, zu benützen vermag und (3} einen optimalen pHWert von 6,5 bis 9,Q besitzt,
obwohl der Stabilisierungs-pE-Wert
7,0 bis 8,5 beträgt. Dieses Enzym
kann gewonnen werden nach einem Verfahren, bei dem ein Acyl-CoA-Oxidase-produzierender
Organismus, der zum Genus Candida gehört, zum Beispiel Candida tropicalis IFO 0589
(ATCC 20115) und Candida lipolytica IFO 1548 (ATCC 18942), in einem Nährmedium kultiviert
wird unter Anreicherung von Acyl-CoA-Oxidase in Hefezellen, und die gebildete Acyl-CoA-Oxidase
von den Zellen abgetrennt wird.
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Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird in der ersten
Verfahrensstufe freie Fettsäure mit 5 bis 22 Kohlenstoffatomen mit Acyl-CoA-Synthetase
behandelt in Gegenwart von ATP und CoA und vorzugsweise in Gegenwart von Magnesiumionen
unter Bildung von Acyl-CoA, AMP und Pyrophosphorsäure. Bei der Acyl-CoA-Synthetase
handelt es sich vorzugsweise um ein hochgereinigtes Präparat. Die Umsetzung wird
vorzugsweise bei einer Temperatur von 20 bis 400C und bei einem pH-Wert von 6 bis
9,5 durchgeführt. In diesem Reaktionssystem kann Dithiothreitol, Mercaptoäthanol,
Glutathion (in reduzierter Form) oder dergleichen als Antioxidans vorliegen.
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In der nächsten Verfahrensstufe wird das auf diese Weise gebildete
Acyl-CoA mit von Mikroorganismen erzeugter Acyl-CoA-Oxidase in Gegenwart von Sauerstoff
behandelt unter Bildung von Enoyl-CoA und Wasserstoffperoxid. Die von Mikroorganismen
gebildete Acyl-CoA-Oxidase stammt vorzugsweise vom Genus Candida und insbesondere
von Candida lipolytica, und liegt in hochgereinigter Form vor. Die Reaktionsbedingungen
sind vorzugsweise so gewählt, dass die Temperatur 20 bis 400C und der pH-Wert 6
bis 9,5 betragen. FAD (Flavin-adenin-dinucletid) kann in diesem Reaktionssystem
ebenfalls vorliegen.
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Die angegebene erste und zweite Reaktion kann in einer einzigen Stufe
oder in zwei separaten Stufen durchgeführt werden und das dabei gebildete Wasserstoffperoxid
oder Enoyl-CoA wird nach üblichen bekannten quantitativen Analysemethoden bestimmt.
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Zur quantitativen Analyse von Wasserstoffperoxid sind die beiden folgenden
Methoden (A) und (B) bekannt: (A) das durch Einwirkung von durch Mikroorganismen
erzeugte Acyl-CoA-Oxidase gebildete Wasserstoffperoxid wird nach der unten angegebenen
Reaktionsgleichung (3) durch Umsetzung mit einem Alkohol in Gegenwart von Katalase
in einen Aldehyd überführt, der gemessen wird und somit die Bestimmung von freier
Fettsäure ermöglicht
Zur Messung des gebildeten Aldehyds sind insbesondere zwei Methoden von Bedeutung,
wobei nach der einen Methode der Aldehyd direkt einer kolorimetrischen Bestimmung
unterworfen und nach der anderen Methode der Aldehyd mit einem Dehydrogenasesystem
konjugiert und die Änderung der Absorption im ultravioletten Bereich von NAD(NADH)
bestimmt wird. In der Regel wird ein Katalasesystem von reduzierenden Substanzen
kaum beeinflusst. Der Einfluss einer reduzierenden Verbindung wie CoA, die im erfindungsgemäss
gebildeten Reaktion gemisch vorliegt, ist daher vernachlässigbar, was einen hervorstechenden
Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens bedeutet.
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Als kolorimetrische Methoden stehen insbesondere die folgenden zur
Verfügung: (a) Der gebildete Formaldehyd wird mit Acetylaceton und Ammoniak kondensiert
und die gebildete gelbe Farbe (von Diacetyldihydrolutidin) wird bei 412 nm mit derjenigen
einer Standardprobe verglichen.
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(b) Der gebildete Aldehyd wird mit zwei Molekülen 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon
(im folgenden abgekürzt als MBTH) in Gegenwart eines Oxidationsmittels kondensiert
und die gebildete blaue Farbe wird bei 620 nm mit derjenigen einer Standardprobe
verglichen.
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(c) Der gebildete Formaldehyd wird mit 4-Amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazol
kondensiert und die gebildete purpurrote Farbe wird bei 550 nm mit derjenigen einer
Standardprobe verglichen.
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Vorstehende Methoden sind nur beispielsweise genannt und erfindungsgemäss
ist jede Methode mit Erfolg anwendbar, die zur Bestimmung des Aldehyds, der durch
die Einwirkung von Katalase aus einem Wasserstoffperoxid-Alkoholsystem gebildet
wird, geeignet ist.
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Als geeignete Ultraviolettmethoden seien die folgenden genannt: (a)
Der durch die Einwirkung von Katalase und Alkohol gebildete Aldehyd wird in Gegenwart
von NADH mit Alkoholdehydrogenase umgesetzt und die Abnahme der Absorption von NADH
bei 340 nm wird gemessen.
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(b) Der Aldehyd wird in Gegenwart von NAD mit Aldehyddehydrogenase
umgesetzt und die Absorptionszunahme bei 340 nm, die auf die Bildung von NADH zurückzuführen
ist, wird gemessen.
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Auch andere Methoden dieses Typs, die zur Bestimmung des gebildeten
Aldehyds geeignet sind, können erfindungsgemäss ebenso verwendet werden.
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(B) Das-durch die Einwirkung von durch Mikroorganismen erzeugte Acyl-CoA-Oxidase
gebildete Wasserstoffperoxid wird in Gegenwart von Peroxidase mit einem Wasserstoffdonator
(Chromogen) umgesetzt, der bei Oxidation zur Farbentwicklung (Fluoreszenz) befähigt
ist und die gebildete Farbsubstanz (fluoreszierende Substanz) wird gemessen zur
Bestimmung der freien Fettsäure, wobei die folgende Reaktionsgleichung (4) zugrundeliegt:
worin D den Wasserstoffdonator bedeutet-.
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Bei diesem Verfahren ist der Einfluss der im Reaktionsgemisch oder
dem Probenmaterial vorliegenden reduzierenden Substanz nicht vernachlässigbar und
deshalb ist die Anwendung festgelegter Verfahrensbedingungen erforderlich, um eine
genaue quantitative Beziehung zur Menge an freier Fettsäure zu erhalten.
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Als kolorimetrische Methoden sind die folgenden verwendbar: (a) 4-Aminoantipyrin
(im folgenden abgekürzt als 4-AA) und Phenol werden als Chromogene verwendet und
der
Farbvergleich wird bei 505 nm (Rotfarbstoff) durchgeführt.
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(b) 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon (im folgenden abgekürzt als
MBTH) und Dimethylanilin (im folgenden abgekürzt als DMA) werden als Chromogene
verwendet und der Farbvergleich wird bei 590 nm (Blaufarbstoff) durchgeführt.
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(c) 4-AA und DMA oder Diäthylanilin (im folgenden abgekürzt als DEA)
werden als Chromogene verwendet und der Farbvergleich wird bei 550 nm ( Purpurfarbstoff)
durchgeführt.
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Erfindungsgemäss sind jedoch auch andere als die angegebenen drei
kolorimetrischen Methoden verwendbar unter der Voraussetzung, dass ein Wasserstoffdonator
(Chromogen) verwendet wird, der durch Einwirkung eines Oxidationsmittels aus Wasserstoffperoxid
in Gegenwart von Peroxidase einen Farbstoff bildet. Es ist ferner möglich, die Menge
an Wasserstoffperoxid zu messen, die durch die Einwirkung von Acyl-CoA-Oxidase erzeugt
wird, durch Verwendung einer Wasserstoffperoxid-Elektrode.
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Bei der Durchführung der angegebenen Methoden kann die Messung von
Wasserstoffperoxid gleichzeitig mit den angegebenen ersten und zweiten Reaktionen
erfolgen.
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Bei einer derartigen Messung von Wasserstoffperoxid mit Chromogen
und Peroxidase zur Bestimmung der freien Fettsäure ist bei Zugabe einer überschüssigen
Menge an CoA zum Reaktionssystem die gewünschte Empfindlichkeit nicht erzielbar
wegen der störenden Farbentwicklung unter dem Einfluss dieser reduzierenden Verbindung.
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Erfindungsgemäss wurde gefunden, dass unter diesen Umständen die Zugabe
eines Thiolradikal-Blockierungsmittels in einer der Reagens zusammensetzungen diese
Nachteile behebt und eine befriedigende Farbentwicklung ergibt. Erfindungsgemäss
wird daher eine Reagenszusammensetzung angegeben, die als Gruppe (I) Acyl-CoA-Synthetase,
durch Mikroorganismen erzeugte Acyl-CoA-Oxidase, CoA, ATP und Magnesium enthält
und als Gruppe (II) Peroxidase, einen Farbstoffbildner und ein Thiolradikal-Blockierungsmittel
enthält und die zur Bestimmung von freier Fettsäure verwenbar ist durch Messung
des durch das enzymatische System gebildeten Peroxids. Erfindungsgemäss kann das
Vorliegen eines Thiolradikal-Blockierungsmittels die Reduktionskraft von CoA zum
Verschwinden bringen und eine ausreichende Farbentwicklungsempfindlichkeit liefern,
sodass eine genaue Bestimmung von freier Fettsäure ermöglicht wird.
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Bei den erfindungsgemäss verwendbaren Thiolradikal-Blockierungsmitteln
kann es sich um folgende handeln: (1) Monohalogenessigsäure und deren Säureamid
(2) Verbindungen, die zur Polarisierung von Thiolradikalen befähigt sind oder Verbindungen
mit einer leich polarisierbaren Doppelbindung und (3) Disulfidverbindungen.
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Es handelt sich dabei um eine Verbindung, die zur Umsetzung mit einem
Thiolradikal befähigt ist und dieses durch Alkylierung blockiert, wie Jodacetamid,
Monojodessigsäure und dergleichen; oder um eine Verbindung, die zur Umsetzung mit
einem Thiolradikal befähigt ist und dieses durch Additionsreaktion an die Doppelbindung
blockiert, wie N-Äthylmaleinimid(NEM), N-4-Dimethylamino-3,5-dinitrophenyl-maleinimid
(DDPM), Benzimidazoyl-maleinimid
(BIPM), N-(9-Acridinyl-maleinimid
(NAM), 4-Vinylpyridin, 2-Vinylchinolin, 9-Vinylacridin und dergleichen; oder um
eine Verbindung, die zur Blockierung eines Thiolradikals befähigt ist durch Austauschreaktion
zwischen dem Thiolradikal und einem Disulfidradikal,wie 5,5'-Ditiobis (2-nitrobenzoesäure)
(DTNB), 2,2'-Dithiodipyridin (2pDS), 4,4'-Dithiodipyridin (4PDS), 6,6'-Dithionicotinsäure
(6NDS), Thiamindisulfid (TDS) und dergleichen. Die angegebenen Verbindungen sind
nur Beispiel für erfindungsgemäss verwenbare Thiolradikal-Blockierungsmittel und
die Erfindung ist auf diese Verbindungen keineswegs beschränkt.
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Eine geeignete Methode zur Bestimmung von Enoyl-CoA besteht zum Beispiel
darin, dass ein enzymatisches System enthaltend Enoyl-CoA-Hydratase, 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase
and Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD) einer Kupplungsreaktion unterworfen und
das gebildete, in reduzierter Form vorliegende Nicotinamid-adenindinucleotid (im
folgenden abgekürzt als NADH) bestimmt wird durch Messung des Anstiegs der OD340.
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Die Messung des Sauerstoffverbrauchs bei der Oxidationsreaktion kann
in üblicher bekannter Weise erfolgen, zum Beispiel durch elektrische Bestimmung
mit Hilfe von Polarometrie.
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Erfindungsgemäss sind freie Fettsäuren leicht bestimmbar unter Verwendung
von zwei oder mehr als zwei Enzymen. Im Gegensatz zu bisher bekannten Verfahren
wird direkt das Wasserstoffperoxid gemessen, das aus der durch die freie Fettsäure
gebildeten Acyl-CoA stammt.
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Demzufolge können nur wenig enzymatische Fehler auftreten und die
Reproduzierbarkeit des Verfahrens ist ausgezeichnet. Das erfindungsgemässe Verfahren
zeichnet
sich ferner durch die leichte Durchführbarkeit der angegebenen
Kolorimetrie oder Messung im ultravioletten Bereich aus.
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Bei Verwendung einer aus Rattenleber stammenden Acyl-CoA-Oxidase besteht
ein Problem bezüglich schlechter Reaktivität und die Umsetzung erfolgt nur mit 60
% der freien Fettsäure. Erfindungsgemäss wird demgegenüber durch Mikroorganismen
erzeugte Acyl-CoA-Oxidase verwendet, die aufgrund ihrer ausgezeichneten Reaktivität
bewirkt, dass die Umsetzung mit fast 100 % der freien Fettsäure erfolgt.
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Bei Verwendung von Zellen von Hefe, die zum Genus Candida gehört,
besteht normalerweise das Problem, dass die Herstellung dieser Zellen sehr schwierig
ist und die erhaltenen Zellen ziemlich instabil sind und eine schlechte Aktivität
aufweisen, so dass sie als kommerzielles Produkt nicht in Frage kommen. Ausserdem
können die Zellen verschiedene Nebenreaktionen bewirken, zum Beispiel eine direkte
Umsetzung zwischen Wasserstoffperoxid und Katalase in der Zelle, so dass eine genaue
Bestimmung von freier Fettsäure schwierig durchzuführen ist. Da demgegenüber erfindungsgemäss
abgetrennte und hochgereinigte Acyl-CoA-Oxidase, die durch Mikroorganismen erzeugt
ist, Verwendung findet, treten keine derartige Nebenreaktionen auf und eine praktisch
vollständige Bestimmung der freien Fett---säuren ist möglich.
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Die Erfindung wird durch die beigefügte Zeichnung näher Veranschaulicht,
in der darstellen:
Fig. 1: eine Eichkurve mit Palmitinsäure, Fig.
2: die Beziehung zwischen den erfindungsgemäss erzielbaren Ergebnissen und den unter
Verwendung eines handelsüblichen Fertigpacks erhaltenen Ergebnissen, Fig. 3: die
Beziehung zwischen Reaktionszeit und Absorption bei der Bestimmung von freier Fettsäure
mit Acyl-CoA-Oxidase, und Fig. 4: die Beziehung zwischen Palmitinsäurekonzentration
und Absorption.
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Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern. In den
Beispielen gelangen die folgenden Enzyme zur Anwendung: Acyl-CoA-Synthetase: Candida
lipolytica wurde in einem Glucosemedium kultiviert und die erhaltenen Zellen wurden
gesammelt und mit Hilfe von Glaskugeln aufgebrochen.
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Die überstehende Flüssigkeit wurde abgetrennt und wiederholt gereinigt
unter Verwendung von DEAE-Cellulose, Sephadex G-150 und dergleichen.
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Acyl-CoA-Oxidase: Candida lipolytica wurde in einem blsäuremedium
kultiviert und die erhaltenen Zellen wurde gesammelt und mit Hilfe von Glaskörpern
aufgebrochen.
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Die überstehende Flüssigkeit wurde abgetrennt und hitzbehandelt und
danach mehrmals gereinigt unter Verwendung von DEAE-Cellulose, Sephadex G-150 und
dergleichen.
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Beispiel 1 Das unten angegebene Reagens wurde zur Bestimmung von freier
Fettsäure hergestellt.
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Reaktionsgemisch: 50 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,8) 5 mM EDTA-3Na
4 % Methanol Katalase 800 E/ml 10 mM FAD (Flavin-adenin-dinucleotid) 1 mM CoA 10
mM ATP 5 mM MgCl2 Acyl-CoA-Synthetase 0,5 E/ml Acyl-CoA-Oxidase 0,5 E/ml Farbbildende
Lösung A 2N - KOH Farbbildende Lösung B 0,6 % AHMT (0,5N-HCl) Farbbildende Lösung
C 0,75 % NaJO4 (0,2 N - KOH).
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50 LLl Natriumpalmitatlösung (1 % Triton X-100-Lösung) wurden in ein
Proberöhrchen pipettiert und 0,5 ml des angegebenen Reaktionsgemisches wurden zugesetzt.
Nach 15 min langer Umsetzung bei 370C wurde das Gemisch mit 0,5 ml farbbildender
Lösung A versetzt und die Reaktion wurde zu diesem Zeitpunkt abgestoppt. Nach Zugabe
von 0,5 ml farbbildender Lösung B wurde das Gemisch 5 min lang stehengelassen und
anschliessend mit der farbbildenden Lösung C versetzt und gut gerührt. Nach weiterem
10 min langem Stehen wurde die Absorption bei OD550 gemessen unter Verwendung von
Wasser als Bezugslösung. Für den Blindwert wurde CoA zugesetzt nach der Zugabe von
farbbildender Lösung A. Die Eichkurve ist in Fig. 1 wiedergegeben.
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Beispiel 2 Unter Verwendung des gleichen Reagens wie in Beispiel 1
wurden 10 Serumproben analysiert zur Bestimmung des darin vorliegenden Gehalts an
freier Fettsäure. Die Beziehung zwischen den Messungen und den entsprechenden Werten,
die unter Verwendung eines handelsüblichen Fertigpacks (chemische Methode) erhalten
wurden, ist in Fig. 2 wiedergegeben, wobei Y = 1,049 X + 17,27, r = 0,959 (Korrelationskoeffizient)
ist.
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Zur Durchführung der Messung wurden 50 Al Probematerial mit 3,0 ml
Extraktionsmedium (Chloroformlösung) und 1,0 ml Kupferlösung versetzt und das Gemisch
wurde 2 min lang geschüttelt und danach 5 min lang bei 3000 U/pm zentrifugiert.
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2,0 ml des Überstands wurden mit 0,5 ml farbbildender Lösung versehen
und die Absorption bei 610 nm wurde gemessen. Die Eichkurve und die Berechnungsmethode
waren wie üblich.
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Beispiel 3 Freie Fettsäure wurde unter Verwendung des folgenden Reaktionsgemisches
und der unten angegebenen farbbildenden Lösung bestimmt.
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Reaktionsmischung 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,8) 10 mM ATP 0,5 mM
CoA 5 mM MgC12 0,1 % NaN3 0,1 % Triton X-100 Acyl-CoA-Synthetase 50 mE Acyl-CoA-Oxidase
100 mE Farbbildende Lösung 50 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,0) 1 mM 4-Aminoantipyrin
5 mM Dimethylanilin Peroxidase 10 E 10 mM N-Äthylmaleinimid (NEM) 0,5 ml des Reaktionsgemisches
wurden bei 370C 5 min lang warmgehalten und danach mit 50 Fl Substrat aus Natriumpalmitatlösung
(1 mM, 1 % Triton X-100) versetzt. Nach der Umsetzung während einer bestimmten Zeitspanne
(0, 5, 10, 20, 30 min) wurde das Gemisch mit 2,0 ml farbbildender Lösung versetzt
und 10 min später wurde die Absorption bei OD550 gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse
sind in Fig. 3 wiedergegeben.
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In einer weiteren Versuchsreihe wurden jeweils 50 Fl von 0, 0,25,
0,5, 0,75 und 1,0 mM Palmitinsäurelösung zu 0,5 ml Reaktionsgemisch zugegeben und
bei 370C 15 min lang umgesetzt. Dann wurden 2,0 ml farbbildende Lösung zugegeben
und 10 min später wurde die Absorption bei OD550 gemessen. Die
erhaltenen
Ergebnisse sind in Fig. 4 wiedergegeben.
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Wird die relative Absorption des Systems, das mit 0,1 mM (Konzentration
an Reaktionsgemisch) Wasserstoffperoxid versetzt ist, jedoch kein CoA enthält, als
100 angenommen, so betrug die prozentuelle Entwicklung bei Gehalt an N-0thylmaleinimid
(NEM) in der farbbildenden Lösung 100, wohingegen sie nur 28 % betrug, wenn NEM
zur farbbildenden Lösung nicht zugesetzt wurde.
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In Fig. 3 bedeuten:
die gemessene Absorption in dem System, das mit 0,1 mM (Konzentration an Reaktionsgemisch)
Palmitinsäure versetzt und mit farbbildender Lösung, die 10 mM NEM enthielt,behandelt
wurde,
die gemessene Absorption in dem System, das mit 0,1 mM (Konzentration an Reaktionsgemisch)
Palmitinsäure versetzt und mit farbbildender Lösung, die kein NEM enthielt, behandelt
wurde, und
die gemessene Absorption in dem System, das keine Palmitinsäure enthielt und mit
farbbildender Lösung, die 10 mM NEM enthielt, behandelt wurde.
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In Fig. 4 bedeuten:
die Messung mit farbbildender Lösung, die NEM enthielt, und
die Messung mit farbbildender Lösung, die kein NEM enthielt.
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Bezugsbeispiel 1 Es wurde der Einfluss verschiedener Thiolradikal-Blockierungsmittel
wie folgt untersucht.
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Zu 500 ßl des Reaktionsgemisches, das 100 mM Tris-HCl-Puffer und 0,1
mM H202 enthielt sowie gegebenenfalls mit 0,05 mM Cystein versetzt war, wurden jeweils
100 ßl des unten angegebenen Thiolradikal-Blockierungsmittels in einer Menge von
10 mM zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde bei 370C 5 min lang stehengelassen
und danach mit 2 ml farbbildender Lösung (1 mM 4-AA, 10 mM DMA, Peroxidase 10 E
und 50 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,0) versetzt. Nach 5 min langem Stehen bei
370C wurde die OD550 gemessen. Die prozentuelle Entwicklung ist das Verhältnis (%)
von OD550 des mit Cystein versetzten Systems zu derjenigen des cysteinfreien Systems.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle I aufgeführt: Tabelle I Thiolradikal-
OD550 OD550 Entwicklung Blockiermittel mit Cystein ohne Cystein (%) N-Athylmaieinimid
0,290 0,290 100 Monojodessigsäure 0,262 0,287 91,3 2,2'-Dithiodipyridin 0,268 0,283
94,7 4,4'-Dithiodipyridin 0,258 0,285 90,5 PCMB* 0,233 0,285 81,8 Vergleich (H2O)
0,152 0,287 53,0 * pchlorquecks ileerben zoe säure
Bezugsbeispiel
2 Unter Verwendung einer farbbildenden Lösung mit der gleichen Zusammensetzung,
wie sie in Bezugsbeispiel 1 verwendet wurde, die jedoch zusätzlich 10 mM NEM enthielt,
wurden verschiedene Thiolverbindungen getestet.
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Zu 500 ijl des Reaktionsgemisches, das 100 mM Tris-HCl-Puffer, 0,1
mM H202 und 0,05 mM Thiolverbindung enthielt, wurden jeweils 2 ml der farbbildenden
Lösung (der gleichen Zusammensetzungwie in Bezugsbeispiel 1), die gegebenenfalls
mit 10 mM NEM versetzt war, zugegeben und das Gemisch wurde, nachdem es 5 min lang
bei 370C stehengelassen worden war, einer OD550-Absorptiongsmessung unterworfen.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II aufgeführt, wobei die
prozentuelle Entwicklung als relativer Wert ausgedrückt ist, wenn die Messergebnisse
des Systems, das keine Thiolverbindung enthält, als 100 angenommen werden: Tabelle
II Thiolverbindung prozentuelle Entwicklung mit 10 4 NEM ohne NEM Cystein (0,05
mM) 100 52 Glutathion (0,05 mM) 100 53 Mercaptoäthanol (0,05 mM) 99 58 Co (0,05
mM) 100 57 Dithiothreitol (0,05 mM) 98 48
Vergleichsbeispiel 1
Unter Verwendung von Acyl-CoA-Oxidase (ACO) aus Rattenleber anstelle der erfindungsgemäss
verwendbaren, durch Mikroorganismen erzeugten Oxidase (ACO) wurde die Bestimmung
von freier Fettsäure wie folgt durchgeführt.
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50 jil Natriumpalmitatlösung (1 % Triton X-100 1000 Xq/l) wurden mit
0,5 ml des unten angegebenen Reaktionsgemisches versetzt und analoge Verfahrensmassnahmen
wie in Beispiel 1 wurden wiederholt, d.h., dass die gleichen farbbildenden Lösungen
zugegeben wurden zur Farbentwicklungtund die Mengen an Natriumpalmitat wurden gemessen.
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Reaktionsgemisch 50 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,8) 5 mM EDTA-3Na
4 * Methanol Katalase 800 E/ml 10 mM FAD 1 mM CoA 10 mM ATP 5 mM MgCl2 Acyl-CoA-Synthetase
0,5 E/ml aus Rattenleber stammende Acyl-CoA-Oxidase 0,5 E/ml Die erhaltenen Ergebnisse
sind in der folgenden Tabelle III aufgeführt.
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Tabelle III min Rattenleber-ACO Mikroorganismen-ACO Natriumpalmitat
Natriupalmitat (*/1) (4q/l) O O O 5 270 850 10 497 985 15 586 1005 20 623 1020 30
630 1015 Die Ergebnisse zeigen, dass dann, wenn aus Rattenleber stammende Acyl-CoA-Oxidase
zur Bestimmung von Fettsäure verwendet wird, die Reaktion nicht vollständig abläuft
und bei etwa 60 % Umsetzung abstoppt. Bei Verwendung von durch Mikroorganismen erzeugter
Acyl-CoA-Oxidase kann demgegenüber die Umsetzung zu fast 100 % ablaufen, was sich
für die quantitative Analyse von freien Fettsäuren als besonders vorteilhaft erweist.
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Vergleichsbeispiel 2 Mikroorganismenzellen aus Hefe, die zum Genus
Candida gehören, wurden wie folgt hergestellt.
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Candida tropicalis-Stamm IFO 0589 (ATCC 20115) wurde in 50 ml eines
Nährmediums eingeimpft, das 1,0 % N-Alkangemisch (C10-C13), 0,5 % KH2PO4, 0,5 %
K2HPO4, 0,7 % Hefeextrakt und 0,7 % Polypepton (pH 5,5) enthielt, worauf in einem
Sakaguchi-Kolben unter Schütteln 60 Stunden lang bei 300C kultiviert wurde. Die
auf die Weise erhaltene Saatkultur wurde in jeweils
10 Kolben
mit Nährmedium (jeder 2 l-Kolben enthielt 500 ml des angegebenen Kulturmediums)
eingeimpft und unter Schütteln weitere 16 Stunden lang kultiviert. Die kultivierten
Medien wurden filtriert, wobei 80 g (Nassgewicht) Zellen gesammelt wurden, welche
gründlich mit 50 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,5) gewaschen und anschliessend in
400 ml des gleichen Puffers suspendiert wurden. Die Suspension wurde mit Zymolase
behandelt unter Bildung von Protoplast, der aufgebrochen wurde mit Hilfe eines Homogenisators
und anschliessend 15 min lang zentrifugiert wurde (bei 3000g).
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Der Überstand wurde erneut 1 Stunde lang zentrifugiert (20000 g) unter
Erzielung eines Niederschlags, der in den nachfolgenden Tests als Mikroorganismuszellenfraktion
verwendet wurde.
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Es wurden Vergleichsversuche durchgeführt mit den erhaltenen Zellen
und der erfindungsgemässe verwendbaren, durch Mikroorganismen erzeugten Oxidase
zur Bestimmung von freier Fettsäure.
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Zur Durchführung dieser Versuche wurden 50 ßl Natriumpalmitatlösung
(1 % Triton X-100) mit 0,5 ml des folgenden Reaktionsgemisches versetzt und das
erhaltene Gemisch wurde bei 370C wie in Beispiel 1 zur Reaktion gebracht.
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Reaktionsgemisch 50 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,8) 5 mM EDTA-3Na
4 % Methanol Katalase 800 E/ml 10 mM FAD 1 mM CoA 10 mM ATP 5 mM MgCl2
Acyl-CoA-Synthetase
0,5 E/ml Mikroorganismenzellen 1 mg Protein/ml Zu Vergleichszwecken wurde gleichzeitig
der Versuch des Beispiels 1 wiederholt.
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Nach der Umsetzung wurde das Gemisch mit den farbbildenden Lösungen
versetzt zur Farbentwicklung wie in Beispiel 1 und die Reaktivität wurde bestimmt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV aufgeführt Tabelle IV
Reaktionszeit Mikroorganisnenzellen Miiroorganiseen-AOO min Natriumpalmitat Natriumpalmitat
(µÄq/l) (IM/l) (Äqil) 0 0 0 5 387 850 10 440 985 15 423 1005 20 480 1020 30 505
1015 Die Ergebnisse zeigen, dass bei Verwendung der angegebenen Mikroorganismenzellen
die Ausbeute an Wasserstoffperoxid aus Palmitinsäure sehr schlecht ist. Diese Verfahrensmassnahme
ist daher in der Praxis zur Bestimmung von freier Fettsäure im Serum ungeeignet.