DE3044786A1

DE3044786A1 - Verfahren zur bestimmung von freien fettsaeuren

Info

Publication number: DE3044786A1
Application number: DE19803044786
Authority: DE
Inventors: Sakayu Shimizu; Yoshiki Kyoto Tani; Hideaki Yamada; Kanzo Aichi Yamashita
Original assignee: Amano Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 1979-12-12
Filing date: 1980-11-27
Publication date: 1981-09-17
Also published as: FR2479261B1; US4360591A; JPS5685300A; DE3044786C2; JPS5648160B2; FR2479261A1

Description

HOFFMANN - EITLE & PARTNER

PATENTANWÄLTE DR. ING. E. HOFFMANN (1930-197(5) · DIPL.-ING. W. EITLE · D R. RER. N AT. K. H O FFMAN N - DIPL.-ING. W. IEH N

DIPL-ING. K. FDCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 · D-8000 MDNCHEN 81 · TELEFON (089) 911087 ■ ΤΕΪ.ΕΧ 05-29il? (PATH E)

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AMANO PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Nagoya / Japan

Verfahren zur Bestimmung von freien Fettsäuren

Die Erfindung betrifft ganz allgemein ein enzymatisches Verfahren zur Bestimmung von freien Fettsäuren. Sie betrifft insbesondere ein Verfahren zur Bestimmung von freien Fettsäuren unter Verwendung der Acylcoenzym A (nachfolgend als Acyl-CoA abgekürzt)-Synthetase und Acyl-CoA-Oxidase, bei welcher die dabei vorkommende Reaktionsfolge durch die Zugabe von Myokinase beschleunigt wird, und dadurch eine schnellere und genauere Bestimmung der freien Fettsäuren möglich wird.

Verfahren zur Bestimmung von freien Fettsäuren beinhalten im allgemeinen chemische Verfahren , bei denen eine Extraktion mit organischen Lösungsmitteln nötig ist, und diese sind oft mühselig durchzuführen.Es besteht deshalb ein starkes Bedürfnis nach einem einfacheren Verfahren.

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Kürzlich wurde in der japanischen Offenlegungsschrift 52-17085 ein enzymatisches Verfahren zur Bestimmung von freien Fettsäuren in Serum unter Verwendung von Acyl-CoA-Synthetase beschrieben.

Diese Bestimmung beruht auf einer Sequenz im enzymatischen System, bei dem Acyl-CoA-Synthetase mit den freien Fettsäuren in Gegenwart von Adenosintriphosphat (nachfolgend ATP abgekürzt) umgesetzt wird, unter Bildung von Adenosinmonophosphat (nachfolgend als AMP bezeichnet). Im Anschluß an AMP folgt dann die Bildung von Brenztraubensäure durch die Umsetzung von Myokinase und Brenztraubensäure-Kinase. Die Menge an gebildeter Brenztraubensäure steht in Beziehung zu den Mengen an freien Fettsäuren. Da Serum im allgemeinen ATP-zersetzende Enzyme,wie ATP-asen und Phosphatasen in größeren oder kleineren Mengen enthält, zerfällt ATP in dem Meßsystem unter der Wirkung dieser Enzyme in Adenosindiphosphat (ADP), das dann als Brenztraubensäure gemessen wird. Weiterhin treten aufgrund der endogenen Brenztraubensäure daneben weitere Reaktionen auf. Dies führt dazu, daß die erzielten Werte unzuverlässig sind.

Neben der oben erwähnten quantitativen Bestimmungsmethode gibt es Bestimmungsmethoden, bei denen man andere enzymatische Systeme verwendet. Bei diesen Methoden mißt man das Acyl-CoA, das aus freien Fettsäuren durch Einwirkung von Acyl-CoA-Synthetase bei der Bildung von Wasserstoffperoxid unter Verwendung von Acyl-CoA-Oxidase gebildet wird. Die Menge an gebildetem Wasserstoffperoxid wird kolorimetrisch durch Einwirkung von Peroxidase, 4-Aminoantipyrin und Phenol überwacht.

Ein Verfahren der vorerwähnten Art hat den großen Vorteil, daß der Einfluß von Nebenreaktionen ausgeschlossen bleibt, selbst wenn ATP-asen,Phosphatasen und Brenztraubensäure

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im Serum vorliegen. Jedoch läßt auch diese Bestimmungsmethode aus praktischer Sicht gesehen noch zahlreiche Wünsche offen.

Wenn Acyl-CoA-Synthetase in Gegenwart von ATP auf die freien Fettsäuren einwirkt, dann verhindert das gebildete AMP die Bildung von Acyl-CoA. Deshalb werden die freien x-ettsäuren im Serum nicht vollständig in Acyl-CoA umgewandelt. Obwohl eine gegebenen Menge von Acyl-CoA-Oxidase dann mit Acyl-CoA unter Bildung von Wasserstoffperoxid reagiert, werden doch die freien Fettsäuren im Serum nicht vollständig in Wasserstoffperoxid umgewandelt, und infolgedessen ist der erzielte Meßwert an freien Fettsäuren niedriger als der wirkliche Wert.

Um diese Nachteile, die auf die langsame Reaktionsgeschwindigkeit zurückzuführen ist, zu vermeiden, ist es erforderlich, entweder eine höhere Konzentration von Acyl-CoA-Synthetase anzuwenden, oder aber die Meßzeit erheblich zu verlängern. Solche zusätzlichen Verfahrensschritte stören aber den wirtschaftlichen Wert des Verfahrens .

Aufgrund ausführlicher Untersuchungen durch die vorliegenden Erfinder wurde nun festgestellt, daß man die Reaktionsfolgen beschleunigen kann, indem man das unter der Einwirkung von Acyl-CoA-Synthetase gebildete AMP in ADP mittels Myokinase überführt. Durch.dieses Verfahren, d.h. die Entfernung der AMP aus dem Reaktionssystem kann man die Beschränkungen, die durch die Bildung von Acyl-CoA mittels AMP eintreten, verhindern, und die Bildung von Acyl-CoA schnell bis zur Vollendung bringen.

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Das Verfahren betrifft somit ein Verfahren zur Bestimmung von freien Fettsäuren mit einem Reaktionssystem 1, bei dem man Acyl-CoA-Synthetase mit den freien Fettsäuren reagieren läßt in Gegenwart von ATP und Coenzym A unter Bildung von Acyl-CoA und einem Reaktionssystem 2, in welchem Acyl-CoA-Oxidase mit dem im System 1 erhaltenen Acyl-CoA reagieren gelassen wird, unter Bildung von Wasserstoffperoxid und ist dadurch gekennzeichnet, daß man zum Reaktionssystem 1 Myokinase gibt, um die dortige Umsetzung schneller vollständig ablaufen zu lassen, worauf man dann das gebildete Wasserstoffperoxid quantitativ durch kolorimetrische Messung einer Farbentwicklung bestimmt.

Wenn man Acyl-CoA-Oxidase auf Acyl-CoA einwirken läßt, um dadurch eine schnellere Bildung von Wasserstoffperoxid zu ermöglichen, dann wird das Wasserstoffperoxid proportional zu den freien Fettsäuren gebildet. Das entstandene Wasserstoffperoxid wird dann mit 4-Aminoantipyrin und Phenolreagenzien in Gegenwart von Peroxidase behandelt und entwickelt eine Farbe, aus welcher die genauen Mengen an freien Fettsäuren in dem Serum kolorimetrisch bestimmt werden können.' Dies bedeutet eine erhebliche Verminderung der Reaktionszeit.

In Fig. 1 wird die Beziehung zwischen der Aktivität von Acyl-CoA-Synthetase und der Absorption bei 500 nm in dem erfindungsgemäßen System zur Messung der freien Fettsäuren in Gegenwart und in Abwesenheit von Myokinase gezeigt.

Fig. 2 ist eine graphische Darstellung und zeigt die Inhibierung der durch AMP verursachten Umsetzung in dem Meßsystem gemäß der vorliegenden Erfindung, und

Fig. 3 zeigt eine Standardkurve, die man gemäß dem im Beispiel gezeigten Meßsystem erhält.

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Die Reihenfolge der bei der vorliegenden Erfindung eintretenden Enzymreaktionen wird nachfolgend gezeigt:

1) RCOOH + ATP + CoA -^U- RCO - CoA + H₄P₃O₇ + AMP

2) AI-IP + ATP -^-4- 2ADP

3) RCO - CoA i^U H₀O₀

4) H₀O₀ + CH, -C=C- NH„

2 2 3 , ,

CH, - H C=O ³

(4)

4-Aminoantipyrin

CH-, -C = C

-N=Q =0

CH- -

N C

= O

Roter Chinonfarbstoff

(1) Acyl-CoA-Synthetase

(2) Myokinase

(3) Acyl-CoA-Oxidase

(4) Peroxidase

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Bei dem erfindungsgemaßen Verfahren zur Bestimmung von freien Fettsäuren, das einfacher und zuverlässiger als die bekannten ist, wird von einer Reihe von Enzymen Gebrauch gemacht. Die Acyl-CoA-Synthetase kann z.B. von Pflanzen oder Mikroorganismen stammen, jedoch stammt sie vorzugsweise von Pseudomonas aeruginosa IFO 3919 (s. Japanische Offenlegungsschrift 54-151187). Als Myokinase kann eine solche verwendet werden, die tierischen Ursprungs oder von Mikroorganismen gebildet ist, aber vorzugsweise verwendet man eine solche aus Hefen, wie sie im Handel von der Sigma Chemical Company erhältlich ist. Die verwendete Acyl-CoA-Oxidase kann aus tierischen oder Mikroorganismen-Quellen stammen, stammt aber vorzugsweise von Candida tropicalis IAM 4 965.

Die Enzymaktivitäten im erfindungsgemäßen Meßsystem werden in Einheiten ausgedrückt:

10 bis 200 Millieinheiten für die Acyl-CoA-Synthetase; 1 bis 200 Einheiten für die Myokinase; und 0,5 bis 5,0 Einheiten für die Acyl-CoA-Oxidase.

Die Erfindung wird nachfolgend in den Versuchen und Beispielen näher erläutert.

VERSUCH 1:

Es wurde eine Untersuchung hinsichtlich der Beziehung zwischen der Menge an Acyl-CoA-Synthetase und der Absorption bei 500 nm in einem Myokinase-enthaltenden und einem Myokinase-freien Reaktionssystem versucht. Die Reaktionssysteme werden in den nachfolgenden Beispielen näher beschrieben.

Die Ergebnisse werden in Fig. 1 gezeigt, und zeigen an, daß die Absorption bei 500 nm und die Reaktionsgeschwin-

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digkeit größer ist, unabhängig von der Menge an Acyl-CoA-Synthetase, in dem Myokinase-enthaltenden System (+MK) als in in dem Myokinase-freien System (-MK).

Dies liegt daran, weil die durch die Einwirkung von Acyl-CoA-Synthetase auf die freien Fettsäuren in Gegenwart von ATP gebildete AMP in Gegenwart von Myokinase in ADP umgewandelt wird, und nicht mehr die Bildung von Acyl-CoA inhibiert, und dadurch die Menge an Wasserstoffperoxid, die sich durch die Einwirkung von Acyl-CoA-Oxidase auf das gebildete Acyl-CoA entwickelt,proportional der Menge an freien Fettsäuren ist.

VERSUCH 2:

Es wurde ein Vergleich zwischen dem Meßsystem (s. Beispiele) durchgeführt, bei dem AMP von Anfang an vorhanden war, und überhaupt kein AMP vorhanden war. Die Untersuchung wurde hinsichtlich der Reaktionszeit und der Absorption bei O.D. 500 nm in Bezug auf die Wirkung von Myokinase, die erst später in das Meßsystem eingeführt wurde, und bei dem eine gegebene Menge von AMP von Anfang an vorlag, durchgeführt.

Die Ergebnisse werden in Fig. 2 gezeigt. In der graphischen Darstellung zeigt Fig. 1 eine erste Folge im Reaktionssystem, bei dem eine gegebenene Menge an Myokinase, kein AMP, von Anfang an vorliegt, und Gruppe 2 zeigt eine zweite Folge im Reaktionssystem, bei dem weder AMP noch Myokinase von Anfang an vorliegen und eine gegebenen Menge an Myokinase erst später zugegeben wird. Gruppe 3 zeigt eine dritte Folge im Reaktionssystem, bei dem eine

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gegebene Menge (60 η Mol) AMP, keine Myokinase, von Anfang an vorliegen, und eine gegebenen Menge an Myokinase erst später zugegeben wird, und Kurve 4 zeigt eine vierte Folge im Reaktionssystem, das eine Modifizierung der dritten Folge ist, worin 2100 nMol AMP verwendet wurden.

Aus Fig. 2 wird ersichtlich, daß eine gewisse Beschränkung hinsichtlich der Bildung von Acyl-CoA im Reaktionssystem vorliegt, wenn AMP von Anfang an zugegeben wird, aber daß diese Beschränkung nicht vorliegt, wenn die Myokinase im Laufe der Zeit zugegeben wird.

BEISPIEL:

Mol

0,45 ml eines Reaktionsmediums (pH: 8,0) aus 9 uMol Tris-HCl-Puffer, 10 bis 50 η Mol Palmitinsäure, 0,9 u. ATP, 0,2 uMol MgCl, 0,2 uMol EDTA, 0,3 uMol CoA, 0,045 mg Triton X-100, 138 Millieinheiten Acyl-CoA-Synthetase und 14 Einheiten Myokinase wurden 5 Minuten bei 37°C inkubiert. Zu dem so erhaltenen Produkt wurden 0,15 ml eines Mischmediums (pH: 7,4) bestehend aus 30 uMol Kaliumphosphatpuffer (pH: 7,4), 0,006 uMol Flavinadenindinukleotid (FAD), 0,5 uMol 4-Aminoantipyrin, 0,36 uMol Phenol, 0,4 uMol N-Äthylmaleinimid, 0,2 Einheiten Acyl-CoA-Oxidase und 3,0 Einheiten Peroxidase gegeben. Die erhaltene Flüssigkeit wurde dann weitere 10 Minuten bei 37°C inkubiert und bildete eine Farbe und diese wurde bei 500 nm hinsichtlich der Absorption gemessen und dadurch wurde eine Standardkurve erhalten (Fig. 3). Dann wurden 0,05 ml des Serums in der gleichen Weise wie vorher erwähnt, behandelt und man erhielt dadurch eine Arbeitskurve, aus· welcher man einen Wert ersehen konnte, welcher die Mengen an darin enthaltenen freien Fettsäuren anzeigte.

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Leerseite

Claims

HOFFMANN · EITLE & PARTNER

PAT E N TAN WALTE

DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) · D I PL-I N G. W. E ITLE · D R. RER. N AT. K. H O FFMAN N · D I PL.-1 N G. W. LEHN

DIPL.-ING. K. FPCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 · D-8000 MD NCH EN 81 · TELEFON (089) 911087 · TELEX 05-29619 (PATH E)

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AMANO PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Nagoya / Japan

Verfahren zur Bestimmung von freien Fettsäuren

Patentanspruch

Verfahren zur Bestimmung von freien Fettsäuren mit einem Reaktionssystem 1, in dem man Acylcoenzym A-Synthetase in Gegenwart von Adenosintriphosphat und Coenzym A auf die freien Fettsäuren einwirken läßt unter Bildung von Acylcoenzym A und einem Reaktionssystem 2, bei dem man Acylcoenzym A~Oxidase auf das Acylcoenzym A einwirken läßt unter Bildung von Wasserstoffperoxid, das dann anschließend bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß man Myokinase zum Reaktionssystem 1 zufügt und dadurch die Umsetzung dort schneller vervollständigt.

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ORIGINAL IN§PEQT|p² ~