DE2167140C2 - - Google Patents

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DE2167140C2
DE2167140C2 DE19712167140 DE2167140A DE2167140C2 DE 2167140 C2 DE2167140 C2 DE 2167140C2 DE 19712167140 DE19712167140 DE 19712167140 DE 2167140 A DE2167140 A DE 2167140A DE 2167140 C2 DE2167140 C2 DE 2167140C2
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creatinine
creatine
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DE19712167140
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English (en)
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August Wilhelm Dr.Rer.Nat. 8120 Weilheim De Wahlefeld
Hans 8132 Tutzing De Moellering
Erich 8000 Muenchen De Bernt
Wolfgang Dr.Phil.Nat. Gruber
Hans Ulrich Prof. Dr.Rer.Nat. 8132 Tutzing De Bergmeyer
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Roche Diagnostics GmbH
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Boehringer Mannheim GmbH
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Description

Die Erfindung betrifft ein neues Reagens zur spezifischen enzymatischen Bestimmung von Creatinin.
In der klinischen Chemie, insbesondere für die Funktionsdiagnostik der Niere, spielt die Bestimmung des Creatinins eine wichtige Rolle. Die Bestimmung des Creatinins im Serum bzw. Im sogenannten Clearance-Test, die gleichzeitige Bestimmung im Serum und Harn, gehört zu den Standarduntersuchungsmethoden im klinischen Labor.
Die bisher übliche Bestimmungsmethode beruht auf der von M. Jaff´ gefundenen Farbreaktion von Creatinin mit Pikrinsäure im alkalischen Milieu. Hierbei wird nach saurer Enteiweißung der Probe (z. B. mit Trichloressigsäure oder mit Pikrinsäure) im Überstand nach Zugabe von Pikrinsäure und Alkalisieren eine Färbung entwickelt und photometrisch gemessen. Ein wesentlicher Nachteil dieses an sich einfachen Verfahrens besteht darin, daß es nicht für Creatinin spezifisch ist.
Eine Reihe von Modifikationen der Jaff´-Reaktion verbessert zwar die Präzision und die Durchführbarkeit, ohne diesen prinzipiellen Mangel zu beheben. Auch blieb die Jaff´-Methode sehr störanfällig und schon geringe Verschiebungen in der H- bzw. OH-Ionenkonzentration führen zu einer Veränderung der Farbtiefe.
Von Dubos und Miller (J. Biol. Chem. 121, 457 (1937)) wurde eine Modifikation der Jaff´-Reaktion beschrieben, bei der mit einem Rohextrakt eines bestimmten Bakteriums in einem Aliquot einer Probe Creatinin abgebaut wird, während der Rest der Probe unbehandelt blieb. In beiden Probeteilen wurde dann die Bestimmung nach Jaff´ durchgeführt und aus der Differenz der Extinktionen der Creatinin-Gehalt bestimmt. Diese Methode ist zwar sehr spezifisch, die Durchführung ist jedoch recht umständlich und erfordert es, das Bakterium laufend zu züchten.
Eine apparative Verbesserung dieser Methode ist von Miller et al. in J. Biol. Chem. 130, 383-391 (1939) beschrieben. Es wird hierbei eine höhere Spezifität durch colorimetrische Auswertung der Proben erreicht. Es muß aber, ebenso wie bei der Methode von Akamatsu und Kanai, Enzymologia, Vol. 15, 122-125 (1951), welche nicht vollständig identifizierte Bodenbakterien als Enzymlieferanten benutzt, das Bakterium laufend gezüchtet werden, da in Bakteriensuspension und nicht mit isolierter Enzymaktivität gearbeitet wird. Davon abgesehen wurde dieser Mikroorganismus nicht hinterlegt, so daß keine Wiederholbarkeit gegeben ist.
Analoges gibt für die Verwendung Creatinin-umwandelnder Enzyme aus Pseudomonasströmen nach P. Kopper, Arch. Biochem. 19, 171-172 (1949). Dort wird vermutet, daß die enzymatische Aktivität aus einer Creatininhydrase und einer Creatinhydrolase oder möglicherweise -oxidase zusammengesetzt ist.
Eine weitere bekannte Methode wandelt Creatinin unter Zusatz von o-Nitrobenzaldehyd in Methylguanidin um, welches dann nach der Sakaguchi-Reaktion bestimmt wird. Weiter wurde auch eine Farbreaktion zwischen Creatinin und Kalium-Quecksilber- Thiocyanat beschrieben. Beide Methoden erwiesen sich jedoch für das klinische Labor als ungeeignet.
Es besteht daher Bedarf an einem einfachen, aber spezifischen Test für Creatinin.
Die Erfindung löst dieses Problem durch eine Reagenzienkombination zur spezifischen Bestimmung von Creatinin, welche Creatininamidohydrolase enthält und in den Patentansprüchen definiert ist.
Das Enzym Creatininamidohydrolase und ein Verfahren zu seiner Gewinnung sind in der gleichzeitig eingereichten Patentanmeldung DE-OS 21 22 298 beschrieben. Das Enzym Creatininamidohydrolase, welches bisher noch nicht beschrieben wurde, katalysiert die Reaktion:
Das gebildete Creatin wird durch Phosphorylierung mit Creatinkinase und Adenosintriphosphat (ATP) unter Bildung von Adenosindiphosphat bestimmt.
Ein pH-Wert zwischen 7,8 und 8,3 wird bevorzugt. Zur Einstellung des pH-Wertes können beliebige Puffer verwendet werden. Es ist jedoch darauf zu achten, daß der verwendete Puffer die angeschlossene Bestimmungsmethode nicht stört.
Eine vorherige Enteiweißung der Probe ist nicht erforderlich, kann jedoch zweckmäßig sein.
Die erfindungsgemäßen Reagenzienkombination besteht aus
  • 1. Puffer, reduz. Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NADH), ATP und Phosphoenolpyruvat (PEP) und MgCl₂
  • 2. Lactatdehydrogenase (LDH), Pyruvatkinase (PK)
  • 4. Creatininamidohydrolase
in vor Gebrauch unvermischbarem Zustand.
Die erfindungsgemäße Reagenzkombination schafft erstmals die Möglichkeit einer spezifischen Creatinin-Bestimmung, die sich auch zur Routineanwendung im klinischen Labor eignet und eine ausreichende Empfindlichkeit für praktische Zwecke besitzt. Die einzige bisher bekannte spezifische Bestimmungsmethode nach Miller und Dubos war hingegen für die Verwendung zur Routineuntersuchung unbrauchbar (vgl. R. J. Henry, Clinical Chemistry, 1964, Seite 288).
Das folgende Beispiel erläutert die erfindungsgemäße Testkombination weiter.
Beispiel 1 Messung des Creatins mittels Creatinkinase
Das Prinzip der Ausführungsform besteht darin, daß mit Hilfe von Creatininamidohydrolase das Creatinin zu Creatin hydrolysiert und gebildetes Creatin nach M. L. Tanzer (J. of Biol. Chem. 234, S. 3201 (1959)) mit Creatinkinase und ATP phosphoryliert, gebildetes ADP mit PEP und PK in ATP umgewandelt und dabei entstandenes Pyruvat mit NADH und Lactatdehydrogenase zu Lactat reduziert wird unter Bildung von NAD. Die Umsetzung von 1 Mol NADH (Messung bei 334, 340 oder 366 nm) entspricht der Gegenwart von 1 Mol Creatinin.
Zur Durchführung wird ein Reagenziengemisch, das NADH, ATP, PEP und Magnesiumchlorid in 0,11 M Puffer bei pH 9,0 enthält, mit LDH und PK gemischt und auf 25°C temperiert. Dann werden Serum und Creatinkinase zugesetzt und bei der angegebenen Temperatur maximal 30 Minuten inkubiert. Durch Zugabe von mindestens 5 U Creatininamidohydrolase wird die Reaktion gestartet. Der Extinktionsabfall wird registriert. Die Reaktionsdauer beträgt je nach Creatinin- Gehalt 40 bis 90 Minuten. Der Creatinin-Gehalt errechnet sich direkt über den molaren Extinkionskoeffizienten von NADH.
Vorteile dieser Ausführungsform sind Einsparung an Untersuchungsmaterial um den Faktor 10 gegenüber der Jaff´-Methode, ein Serum-Leerwert ist nicht erforderlich, keine Enteiweißung, kein Zentrifugieren nötig.

Claims (2)

  1. Reagenzienkombination zur spezifischen Bestimmung von Creatinin, dadurch gekennzeichnet, daß sie
    • 1. Puffer, NADH, ATP, Phosphoenolpyruvat (PEP) und MgCl₂
    • 2. Lactatdehydrogenase, Pyruvatkinase (PK)
    • 3. Creatinkinase und
    • 4. Creatininamidohydrolase
  2. in vor Gebrauch unvermischbaren Zustand enthält.
DE19712167140 1971-05-05 1971-05-05 Expired DE2167140C2 (de)

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DE19712167140 DE2167140C2 (de) 1971-05-05 1971-05-05

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Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Arch.Biochem. 19, 1949, 171-172 *
BERGMEYER, H.U.: Methoden der Enzymatischen Analyse, 2. Aufl., Bd. 2, Weinheim 1970, S. 1724-1728 *
Enzymologia 15, 1951, 122-125 *
J.Biol.Chem. 130, 1939, 383-391 *

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